考点 1 基因工程

1．基因工程的 3 种基本工具
(1)限制性核酸内切酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割 DNA 分子。
(2)DNA 连接酶：① E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端；② T4 DNA 连接酶能连接黏性末
端和平末端。
(3)载体：①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有一个至多个限制酶切割位点；③具
有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。
提醒 (1)限制酶≠DNA 酶≠解旋酶

限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开； DNA 酶是将

DNA 水解为基本组成单位；解旋酶是将 DNA 的两条链间的氢键打开形成两条单链。

(2)使用限制酶的注意点：a.一般用同种限制酶切割载体和目的基因；b.不同的限制酶也能

切割出相同的黏性末端。

(3)DNA 连接酶≠DNA 聚合酶

DNA 连接酶连接两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸

链上。

2．基因工程的操作流程
(1)目的基因的获取：①从基因文库中获取。②利用 PCR 技术扩增。③化学方法人工合成。
提醒 ① PCR 技术扩增

a．原理：DNA 双链复制。

b．条件：模板 DNA、引物、游离的脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶。

c．过程

② 化学方法人工合成：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用 DNA 合成仪用化学方法合

成，不需要模板。

(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
① 基因表达载体的组成
② 构建过程

提醒 ①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。

② 启动子、终止子

a．启动子(DNA 片段)≠起始密码子(位于 mRNA 上)。

b．终止子(DNA 片段)≠终止密码子(位于 mRNA 上)。

③ 目的基因插入位置：启动子与终止子之间。

(3)将目的基因导入受体细胞
根据受体种类确定基因工程的受体细胞及导入方法。
① 植物：植物体细胞或受精卵——导入方法常用农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法
(本法针对单子叶植物)。
② 动物：受精卵——导入方法为显微注射法。
③ 微生物：细菌——导入方法为感受态法。
(4)目的基因的检测与鉴定的方法
① 检测目的基因是否导入受体细胞：DNA 分子杂交技术。
② 检测目的基因是否转录出 mRNA：分子杂交技术。
③ 检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。
④ 个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。
3．蛋白质工程

1．(2018·全国Ⅰ，38)回答下列问题：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细
胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__________________
________________________________________________________________________
______________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过 Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌
体 DNA 通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬
菌体 DNA 导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞
的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为
防止蛋白质被降解，在实验中应选用________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白
质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化
外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
解析 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是

基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细

胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用 Ca2＋参与

的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体 DNA 和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)

进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防

止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化

过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。

方法技巧 (1)基因工程常用工具有 3 种——限制酶、DNA 连接酶、载体；(2)常用载体有

3 种——质粒、λ 噬菌体衍生物、动植物病毒；(3)获取目的基因有 3 种方法——基因文库、

PCR 扩增、人工合成；(4)常用 3 类受体细胞及导入方法：植物细胞——农杆菌转化法；动

物细胞——显微注射法；微生物细胞——Ca2＋处理转化法。

2．(2017·全国Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没
有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。已知在人体中基因 A(有内含子)
可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白 A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因 A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白 A，
其原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因 A 的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________
______作为载体，其原因是_____________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白 A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有__
______________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因 A 是否翻译出蛋白 A，可用的检测物质是________________(填“蛋白 A
的基因”或“蛋白 A 的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说
是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启
示是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)基因 A 有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的 RNA 序列
不能被切除，无法表达出蛋白 A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖
快、容易培养 (4)蛋白 A 的抗体
(5)DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 (1)细菌是原核生物，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列

的机制，将完整的基因 A 导入大肠杆菌后，无法表达出蛋白 A。

(2)噬菌体是细菌病毒，专门寄生在细菌体内；家蚕是动物。因此用家蚕作为表达基因 A 的

受体，不选用噬菌体作为载体。

(3)原核生物常作为基因工程中的受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较

少，最常用的原核细胞是大肠杆菌。

(4)检测目的基因 A 是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体

进行抗原—抗体杂交。

(5)艾弗里实验表明加热杀死的 S 型细菌的 DNA 可转入 R 型菌中，这充分显示“DNA 可以

从一种生物个体转移到另一种生物个体”，因此，可为基因工程理论的建立提供启示。

方法技巧 (1)基因组文库中目的基因因有内含子部分，所以在真、原核细胞之间只能部

分基因可以交流，但 cDNA 文库中基因无内含子部分，可以在不同物种之间交流。(2)病毒

做载体时，运载目的基因进入受体细胞时具有特异性。(3)要提取细胞内的物质如 mRNA、

色素、H2O2 酶等要做的是破碎细胞这一步，常用的方法为研磨，为研磨充分常加 SiO2。

3．(2017·全国Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。
通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的 mRNA，常选用嫩叶而不选用
老叶作为实验材料，原因是_________________________________________________。
提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是__________________________。
(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体
细胞，原因是______________________________________________________________
______________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是________________
__。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中 )抗真菌病的能力没有提
高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)嫩叶中基因表达强烈，相应的 mRNA 多(或嫩叶组织细胞易破碎) 防止提取的
mRNA 被 RNA 酶降解 (2)在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对原则
合成 cDNA (3)质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因，
便于筛选；质粒中含有复制原点等 (4)磷酸二酯键 (5)几丁质酶基因没有转录或转录的
mRNA 没有翻译
解析 (1)由于嫩叶中几丁质酶转录的 mRNA 较多，因此在进行基因工程操作时，常选用嫩

叶而不选用老叶作为实验材料。提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是

防止提取的 mRNA 被 RNA 酶降解。

(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，原理是 mRNA 可根据碱基互补配对原则逆转录为

cDNA。

(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体

细胞，原因是质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因，

便于筛选；质粒中含有复制原点等。

(4)DNA 连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。

(5)基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物

的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或转录的

mRNA 没有翻译。

4．(2018·湖北七市教科研协作体高三联考) 基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而
实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取
是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：
(1)构建基因组文库的一般步骤：
① 提取某种生物体内的__________________，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的
DNA 片段；
②DNA 片段分别与载体结合，得到重组载体；
③ 重组载体导入到________的群体中储存，基因组文库构建完成。
(2)与基因组文库相比，cDNA 文库的基因数相对要少。其原因是_____________________
______________________________________________。
(3)载体与 DNA 片段结合前，需要使用同种限制酶处理。其目的是___________________
_____________________________________________________。
(4)将重组 DNA 导入受体菌之前，常用________处理，提高导入的成功率。
答案 (1)① 全部 DNA 或全部基因 ③受体菌
(2)cDNA 文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全
部基因 (3)以获得与 DNA 片段相同的黏性末端 (4)Ca2＋
解析 (1)构建基因组文库的一般步骤为：

① 提取某种生物体内的全部 DNA 或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小

的 DNA 片段；

②DNA 片段分别与载体结合，得到重组载体；

③ 重组载体导入到受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。

(2)cDNA 文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全

部基因，因此与基因组文库相比，cDNA 文库的基因数相对要少。

(3)载体与 DNA 片段结合前，需要使用同种限制酶处理，以获得与 DNA 片段相同的黏性末

端。

(4)将重组 DNA 导入受体菌群之前，常用钙离子(Ca2＋)处理，以提高导入的成功率。

5．(2018·菏泽高三模拟)乙肝病毒是一种 DNA 病毒。中国的乙肝病毒携带者约占总人口的

10%。我国科学家通过基因工程生产出乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障
回答下列问题：
(1)乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是________________________________________
________________________。
(2)乙肝病毒的基因组可编码的蛋白质及功能如下：Core 蛋白是外壳蛋白；Pre—core 与抑
制宿主的免疫反应有关；X 蛋白与病毒复制有关；S 蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入
细胞有关。通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的_______________
_________________________________________________________。
(3)通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如图所示：
乙肝病毒――→有关基因――→细菌――→大量生产疫苗
a．若要获得大量的目的基因，可采用 PCR 技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有___
_____________________________________________________________________种，其作用
是____________________________________________________________________。
b．在①②过程中需使用的工具酶是________________。②过程中常用的载体是__________
______。
c．为提高②过程的转化效率，常采用的方法是______________________________。
(4)使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好，从细胞结构的角度分析，原因是____
________________。
答案 (1)肝细胞表面有乙肝病毒的受体 (2)Core 蛋白和 S 蛋白 (3)a.2 使 DNA 聚合酶能
够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸 b．限制酶和 DNA 连接酶 质粒 c．用 Ca2＋
(CaCl2)溶液处理细菌 (4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪
切、折叠、加工、修饰等处理
解析 据题图分析可知，①表示从乙肝病毒中分离有关抗原基因；②过程包括基因表达载

体的构建以及导入细菌；③可用特定抗体筛选含目的基因的细菌，并作为微生物发酵的工

程菌。

(1)由于肝细胞表面有乙肝病毒的受体，所以乙肝病毒专一侵染肝细胞。

(2)根据题意分析可知，乙肝病毒作为抗原的部分应该是其外壳蛋白和包膜蛋白，即通过基

因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的 Core 蛋白和 S 蛋白。

(3)a.PCR 技术中，需要 2 种不同的引物，使 DNA 聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧

核苷酸。

b．在构建基因表达载体的过程中，需要使用的工具酶是限制酶和 DNA 连接酶，常用的载

体是质粒。

c．为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用 Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌，使之成为

感受态细胞。

(4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰

等处理，因此使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好。

6．(2018·咸阳二模)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。
下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的 DNA 和质粒上的实线箭头表示相关限
制酶的酶切位点，虚线箭头表示转录的方向。请分析回答下列问题：

(1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用______________技术对
目的基因进行扩增，该技术需要的条件是______________、酶、原料、模板，该技术必须
用__________________酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、
启动子和终止子之外，还需具有__________________。
(2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用 SmaⅠ 酶切割，原因是____________
________________。图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化，
应选用____________________酶对外源 DNA、质粒进行切割。
(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，可用放射性同位素标记的____________作探针进
行分子杂交检测，还需要在个体水平上鉴定，后者具体过程是______________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)PCR(或多聚酶链式反应) 引物 热稳定 DNA 聚合(或 Taq) 标记基因 (2)SmaⅠ
会破坏质粒的抗性基因和外源 DNA 中的目的基因 BamHⅠ 和 HindⅢ (3)抗盐基因(或目
的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察烟草植株的生长状态
解析 (1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用 PCR(或多聚酶链

式反应)技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是引物、酶、原料、模板，该技术必

须用热稳定 DNA 聚合酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、

启动子和终止子之外，还需具有标记基因。

(2)从图中信息可知，SmaⅠ 酶的切割位点位于目的基因和 M 抗生素抗性基因上。分析抗盐

基因的 DNA 片段，可知该 DNA 含四种限制酶切点，其中 SmaⅠ 位于目的基因上，不宜采

用。EcoRⅠ 位于目的基因两侧，若用 EcoRⅠ 切割则目的基因会自身环化。BamH Ⅰ 与

HindⅢ 位于目的基因两端，且质粒中也有相应的适合的切割位点，因此用 BamH Ⅰ 和

HindⅢ 才能完整地切下该抗盐基因，同时防止自身环化，保证目的基因与质粒连接方式的

唯一性。

(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的抗盐基因 (或目的基

因)作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是将培育的烟草幼苗

栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态。