TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA DƯỢC

QUANTIFICATION METHODS

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 1

 CONTENT

1. Một số thông số

2. Calibration methods
• Sử dụng chuẩn ngoại

• Sử dụng chuẩn nội

• Thêm chuẩn

• Quy về 100 % (diện tích peak)

3. Thẩm định phương pháp

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 2
 MỘT SỐ THÔNG SỐ

Chiều cao và diện tích peak

- Điều kiện thí nghiệm đồng nhất, H và S: tuyến tính

với C
Có thể sử dụng H và S trong pp định lượng

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 3

 MỘT SỐ THÔNG SỐ

Chiều cao và diện tích peak

- H: chỉ đúng và chính xác khi độ rộng của peak
không bị ảnh hưởng (column conditions,…)
Yếu tố ảnh hưởng độ rộng peak:
+ retention factor (retention time)
+ NLT Keep them
+ As constant

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 4

 MỘT SỐ THÔNG SỐ

Chiều cao và diện tích peak

- Diện tích peak S không bị ảnh hưởng bởi sự mở
rộng peak => ổn định hơn chiều cao peak
- Tính tích phân tự động/máy tính
Do đó, diện tích peak được sử dụng rộng rãi hơn
trong công tác định lượng mẫu.

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 5

 CALIBRATION METHODS

Chất chuẩn – chất đối chiếu

- Chất chuẩn, chất đối chiếu: chất đồng nhất đã được
xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã
được quy định về hóa học, vật lý và sinh học.
- Tính chất của CĐC được so sánh với tính chất của
chất cần thử.
- Có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 6

 CALIBRATION METHODS

Chất chuẩn – chất đối chiếu

CĐC dùng cho các phép thử sau:
- Định tính bằng pp IR
- Định lượng bằng pp UV-Vis, FL
- Định tính và định lượng bằng pp sắc ký
- Định lượng bằng pp VSV
- Chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng
- Các phép thử sinh học
- Một số phép thử khác trong Dược điển VN
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 7
 CALIBRATION METHODS

Chất chuẩn – chất đối chiếu

Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc VN cho phép:
- Chất chuẩn DĐVN
- Dược liệu chuẩn được thiết lập, bảo quản và phân
phối tại Viện KN TW/TPHCM
- CĐC quốc tế, khu vực hay
quốc gia theo quy định hiện hành.

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 8

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn/ dãy dung dịch chuẩn: đã
biết nồng độ
- Dung dịch thử chuẩn bị độc lập với chuẩn
- Phân tích: chuẩn và thử được phân tích độc lập
dưới điều kiện đồng nhất
“Chuẩn ngoại”
- C chuẩn ~ C thử

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 9

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

- Xây dựng đường Calibration curve
18000000
chuẩn biểu thị mối 16000000
y = 32644x + 88194
quan hệ giữa R² = 0.9999
14000000

Speak/Hpeak với C 12000000

Peak area (mAu*s)

- Đường biểu diễn: 10000000

nên là 1 đường 8000000

6000000
thẳng (R) 4000000
- Dựa vào đường 2000000

chuẩn => C mẫu 0

0 100 200 300 400 500 600
thử Concentration (ppm)

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 10

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

Ví dụ: Xác định C của hợp chất X trong mẫu thử bằng
LC. C thử được xác định nằm trong khoảng 100-250
ng/ml. Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn X có nồng độ
100, 150, 200 và 250 ng/ml và tiến hành sắc ký.
C chuẩn (ng/ml) Peak area (mAu*s)
100 110952
150 159143
200 221645
250 270045
Thử (?) 175432

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 11

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

Ví dụ: Dựng đường hồi quy tuyến tính
y= 1080x +1523
y: peak area (mAu*s)
x: concentration (ng/ml)
Mẫu thử:
Ythử: 175 432
=> x=161.0 ng/ml

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 12

 CALIBRATION METHODS

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 13

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration
- Pp xác định độ tinh khiết / định lượng hoạt chất
bằng LC
- Khi pp đã được chứng minh là tuyến tính
 Không cần thiết xây dựng đường chuẩn
 Chỉ cần 1 dd chuẩn với C ~ C thử.
 PP thường được sử dụng trong các dược điển

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 14

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration

Allopurinol – USP 41
Cephalexin – DĐVN V

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 15

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration
- Tính toán kết quả:

Với As, Ar là diện tịch pic từ SKD mẫu thử, mẫu chuẩn
Cs, Cr là nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn
Cs = ?

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 16

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration
Ví dụ Allopurinol - USP 41

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 17

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration
Ví dụ:
- DD chuẩn: hòa tan 103.5 mg mẫu chuẩn vào bình
định mức 500 ml. Tiến hành HPLC với 25 uL dd,
diện tích peak: 153885.
- DD thử: hòa tan 99.6 mg mẫu vào bình định mức
500 ml. Tiến hành HPLC với 25 uL dd, diện tích
peak: 147906. Tính hàm lượng mẫu thử.
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 18
 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

One point calibration
Ví dụ: =
- Nồng độ mẫu chuẩn:
103.5/500 = 0.21 mg/ml
- Nồng độ thử Cs của dd thử là:
Cs = 0.21 * 147906/153885 = 0.19 mg/ml
- Khối lượng hợp chất cần phân tích trong dd là:
0.19 mg/ml * 500 ml = 99.5 mg
- Độ tinh khiết/ hàm lượng trong mẫu thử:
99.5 mg/99.6 mg * 100 % = 99.9 %

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 19

 CALIBRATION METHODS

1. PP dùng chuẩn ngoại

Đặc điểm:
- DD chuẩn và thử được hòa tan chính xác một lượng
mẫu đã biết trước
- Trường hợp mẫu được chuẩn bị phức tạp (chiết
xuất, cô cắn, etc.): chất phân tích bị mất trong quá
trình chuẩn bị => lượng chất phân tích chính xác
trong mẫu: không biết
PP chuẩn ngoại không sử dụng được.
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 20
 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

- Sai số gây ra do:
 Chất phân tích bị mất
trong quá trình chuẩn bị
 Sai số trong thể tích tiêm
mẫu (manual/GC,…)
Dùng nội chuẩn sẽ giải
quyết vấn đề này!!!
- IS: được thêm được thêm vào
dd chuẩn và dd thử với C biết
trước; sau đó tiến hành phân
tích.
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 21
 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Khi có sai số do mẫu bị mất/chuẩn bị mẫu hoặc do thể
tích tiêm mẫu không lặp lại:
• S hoặc H peak của từng thành phần (IS, STD,
analyte) thay đổi
• Giả sử sự mất/thay đổi đối với mỗi thành phần
trong mẫu là giống nhau
• Do vậy, tỷ lệ diện tích hoặc chiều cao peak của
Analyte:IS là giống nhau
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 22
 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Chọn chất nội chuẩn (IS) phải phù hợp:
 Có tỷ lệ thu hồi tương tự chất cần phân tích
 Tách khỏi các chất khác trong mẫu khi được phân
tích (VD: Resolution/LC, GC)
 Đáp ứng với đầu dò tương tự chất cần phân tích
(lamda max/UV, m/z/MSD, etc.)
 Nồng độ phù hợp để cho diện tích/ chiều cao tương
tự chất cần phân tích
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 23
 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn

Do đó, chất nội chuẩn (IS)
thường:
 Có tính chất lý hóa
tương tự như chất cần
phân tích
 Không đồng nhất với
chất cần phân tích
 Không xuất hiện
trong mẫu thử
*Đối với LC-MS, GC-MS:
thường dùng chuẩn nội đồng vị
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 24
 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Tiến hành:
• Pha dãy dd chuẩn và dd thử
• Thêm một lượng giống nhau của dd nội chuẩn vào
các dd chuẩn và thử đã chuẩn bị
• Sau đó, các mẫu này được tiến hành xử lý giống
như nhau: chiết xuất, cô dung môi, hòa tan lại, etc.
• Phân tích với điều kiện giống nhau

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 25

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Tiến hành:
• Từ các dd chuẩn, dựng đường tuyến tính của tỷ lệ
diện tích peak (chiều cao peak) của Analyte/IS theo
nồng độ
• Đường tuyến tính nên là một đường thẳng (R)
• Dựa vào đường tuyến tính và kết quả sắc ký mẫu
thử tính ra C thử.

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 26

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 27

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Ví dụ: Chuyên luận “Dung dịch Formaldehyde”

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 28

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Ví dụ: Chuyên luận “Dung dịch Formaldehyde”

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 29

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Ví dụ: Một mẫu chứa X chưa biết nồng độ được dự
đoán có C thuộc khoảng 100-250 ng/ml.
Các dung dịch chuẩn X có nồng độ lần lượt là 100, 150,
200 và 250 ng/ml; thêm vào các dung dịch này nội
chuẩn Y với nồng độ 150 ng/ml.
Các mẫu được xử lý rồi tiến hành sắc ký.
Kết quả như bảng sau.

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 30

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Ví dụ:

Diện tích peak X Diện tích peak

C chuẩn X Tỷ lệ
chuẩn IS
(ng/ml) diện tích peak
(mAu*s) (mAu*s)
100 110952 164302 0.675293
150 159143 163997 0.970402
200 221645 164204 1.349881
250 270045 164289 1.643719
Thử (?) 175432 164105 1.069023

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 31

 CALIBRATION METHODS

2. PP dùng nội chuẩn (Internal Standard)

Ví dụ: Dựng đường hồi quy tuyến tính
y: peak ratio of A/IS; x: concentration (ng/ml)
Mẫu thử:
Y=1.069023
 x=160.4
ng/ml

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 32

 CALIBRATION METHODS

3. PP thêm chuẩn
- Khi nền mẫu thử phức tạp bao gồm những chất làm
ảnh hưởng đến đáp ứng của detector với chất cần
phân tích.
 Dùng các dung dịch chuẩn tinh khiết để làm đường
chuẩn: kết quả không đúng.
- Giải pháp: thêm chất chuẩn với những lượng đã biết
khác nhau vào mẫu thử. Xây dựng đường chuẩn.

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 33

 CALIBRATION METHODS

3. PP thêm chuẩn

A B C
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 34
 CALIBRATION METHODS

3. PP thêm chuẩn

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 35

 CALIBRATION METHODS

BUT
3. PP thêm chuẩn
WHY?

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 36

 CALIBRATION METHODS

3. PP thêm chuẩn
Ví dụ: Một mẫu thử chứa chất X chưa biết nồng độ (dd
A0) có nồng độ ?.
DD thử A1: pha loãng 5.00 ml Ao thành 10.00 ml A1
DD thử A2, A3 và A4: trộn 5.00 ml Ao với 0.25, 0.50 và
0.75 ml dd chuẩn X 15 ng/ml, pha loãng thành 10 ml. Tính
C của X trong Ao Kết quả phân tích:
DD C của chất X (ng/ml) Peak area (mAu*s)
A1 Z 99151
A2 Z +? 149987
A3 Z+? 200132
A4 Z+? 249889

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 37

 CALIBRATION METHODS

3. PP thêm chuẩn
Ví dụ: Dựng đường hồi quy tuyến tính
x: concentration chuẩn thêm vào mẫu (ng/ml)
Mẫu thử:
Y=0
 x=0.494 ng/ml
 C dd thử
ban đầu = 2x
= 0.99 ng/ml
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 38
 CALIBRATION METHODS

4. PP quy về 100 % diện tích peak (Normalization)

- Định lượng một hỗn hợp bằng pp sắc ký
- Giả sử đáp ứng của đầu dò đối với các thành phần
trong hỗn hợp là như nhau
- Công thức:

% = × 100
∑
Trong đó: A là diện tích peak chất quan tâm
Ai là diện tích peak xuất hiện trong sắc ký đồ
5-Dec-23 H01024-Quantification methods 39
 CALIBRATION METHODS

4. PP quy về 100 % diện tích peak (Normalization)

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 40

 CALIBRATION METHODS

4. PP quy về 100 % diện tích peak (Normalization)

Ví dụ: Một hỗn hợp gồm 10 thành phần được tiến

hành sắc ký, trên sắc ký đồ các peak thành phần này
hoàn toàn phân tách với nhau. Tổng diện tích peak là
12533495 và của peak A là 957512.
Tính phần trăm của A trong hỗn hợp.
Đáp án: 7.64 %

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 41

 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 42

5-Dec-23 H01024-Quantification methods 43