Professional Documents
Culture Documents
Pràctica Ouchterlony-Lucía Moreno
Pràctica Ouchterlony-Lucía Moreno
d’Ouchterlony
La Prova de Coombs és una tècnica basada en una rea cció d’hemaglutinació.
Permet la detecció d’anticossos lliures en sèrum que poden reaccionar “in
vitro” amb eritròcits.
Instruments i equips:
Material - Microones
- Micropipetes automàtiques i puntes
Mostres: - Espàtula o escuradents
• A antisèrum - Aigua destil·lada
Reactius: - Pipetes (5 o 10 ml)
• B Sèrum total (Antigen) - Retolador
• C Albúmina (Antigen) - Placa calefactora o Microones
• D IgG (Antigen) - Paper
• E Solució tampó - Parafilm
• AgarosaTM UltraSpec - Safata de plàstic (cambra d’incubació)
- Vas de precipitats
- Proveta
Proce1diment
A PREPARACIÓ DE L’AGAROSA
1. En un vas de precipitats de 500 ml, afegir tot el contingut del paquet de tampó en pols (component E) a 225 ml
d'aigua destil·lada. Agitar el vas de precipitats per dissoldre totalment la pols.
2. Afegir tot el contingut del paquet d'AgarosaTM UltraSpec al vas de precipitats (3 g). Agitar la suspensió per
dispersar els grumolls. Amb un retolador, indicar el nivell de volum de la solució a l'exterior del vas de precipitats.
3. Cal escalfar (fins a punt d'ebullició) la solució per dissoldre l'agarosa. Això es pot aconseguir amb una placa
calefactora. Cobrir el got amb Parafilm. Escalfeu la barreja fins que arribi a punt d'ebullició sobre una placa amb
agitació ocasional. Mantenir la barreja amb calor fins que tota la agarosa es dissolgui. Durant l'escalfament, retireu
ocasionalment el vas de precipitats de la calor i verifiqueu que no hi hagi partícules petites i clares d'agarosa.
Continuar escalfant amb agitació ocasional. La solució final ha de ser clara i transparent.
Preferiblement utilitzar un microones per fondre l'agarosa a temperatura alta en 30
segons. També es poden fer polsos d'escalfaments durant 2 minuts agitant el vas de
precipitats entre polsos. Verifiqueu que no hi hagi petites partícules clares d'agarosa.
La solució final ha de ser clara i transparent.
4. Si s'ha produït una evaporació detectable, afegir aigua destil·lada per emportar la solució al volum original
marcat al vas de precipitats al pas 2. El volum total ha de ser
d’un mínim de 230 ml.
5. Refredeu la solució d'agarosa a 55 °C en un bany d'aigua. Agitar el vas de precipitats al bany per facilitar la
dissipació de calor.
6. Preparar 3 alíquotes de 20 ml de la solució d'agarosa (55 °C) per a cada un de els
deu grups.
F. INCUBACIÓ
Col·locar les tapes en les plaques. Col·locar amb cura les plaques cobertes en la cambra d'incubació sobre
una capa de tovalloles de paper humides. No s'han d'invertir les plaques. Cobrir la cambra amb un embolcall de
plàstic i deixar incubar a temperatura ambient entre 24 i 48 hores per a permetre que es formin línies de
precipitació o la cambra es pot col·locar en un forn d'incubació a 37 °C.
6. Resultats
Placa 1: reacció d’identitat Placa 2: reacció d’identitat parcial Placa 3: reacció de no identitat