1. Вивчити методи та навчитися правильно знаходити ембріони.

Зібрану в скляний циліндр під час вимивання ембріонів промивну рідину

накривають алюмінієвою фольгою, передають у стерильний бокс, де ставлять
на півгодини в термостат для відстоювання. Після відстоювання промивної
рідни відсмоктують за допомогою сифону її верхній шар, а залишених на дні
50–100 мл розливають обережно по 20–30 мл у чашки Петрі, дно яких для
зручності розкреслено на квадрати, розміром 1×1 см, і досліджують під
стереоскопічним мікроскопом (МБС-9) чи бінокулярною лупою при 15–25-
кратному збільшенні.
Досліджуючи уважно промивну рідину під мікроскопом, намагаються перш
за все “виловити” в ній усі ембріони та незапліднені яйцеклітини і перенести
їх у маленьку
чашку Петрі для детальної оцінки і дальшої роботи з ними.
Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії
розвитку ембріона його віку; форму прозорої оболонки та її цілість;
рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість
перивітелінового простору.
Біологічно повноцінні ембріони мають чітку кулясту форму, прозору
гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору оболонку, однакового
розміру бластомери з
щільним міжклітинним комплексом. Ембріони, що містять різних розмірів
бластомери з нечіткими клітинними мембранами та іншими ознаками
дегенерації, вважаються неповноцінними.

2. Ознайомитися та навчитися проводити оцінку ембріонів.

Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії
розвитку ембріона його віку; форму прозорої оболонки та її цілість;
рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість
перивітелінового простору.
Біологічно повноцінні ембріони мають чітку кулясту форму, прозору
гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору оболонку, однакового
розміру бластомери з щільним міжклітинним комплексом. Ембріони, що
містять різних розмірів бластомери з нечіткими клітинними мембранами та
іншими ознаками дегенерації, вважаються неповноцінними.
Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за
такими показниками: життєздатні – ембріони, стадія розвитку яких співпадає
з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені
(ретардовані) – ембріони, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку,
ніж очікувалося в зв’язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) – ембріони з
різними ознаками дегенерації.
Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні;
ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю
дегенерованих клітин.
М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки
ембріонів за морфологічними ознаками.
Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок
про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування
і від приживлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне – доступних
для виробництва методів поки що немає.
В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій
кількості поживного середовища на 30–40 хв. в термостаті для
діагностичного культи-вування.

3. Оволодіти практичними навиками короткотермінового зберігання та

культивування ембріонів.
Від видобування ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту
проходить звичайно не менше 3 годин. Протягом цього часу потрібно
зберегти життєздатність ембріонів.
Для цього ембріон можна помістити в 0,5 мл середовища на годинниковому
скельці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим
фільтру-вальним папером, накрити і поставити в термостат з температурою
37 °С.
Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в
ампулах, поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в
пайету таким чином, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці
довжиною 1–1,5 см. Закривають кінці пайети стальними кульками чи
поліетиленовими корками і поміщають в термостат при 37 ºС чи під шаром
стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи у пробірці.
В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24–48
годин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише
як вимуше-ний короткочасний захід.
В кінці культивування обов’язково перевіряють під мікроскопом
життєздатність ембріонів.
Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що
викликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

4. Навчитися проводити кріоконсервацію ембріонів.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є
рання бластоциста, овець і кіз – пізня морула чи рання бластоциста, свиней –
бластоциста; краще переносять заморожування свіжі ембріони.
Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися
криста-лізацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у
рідкій фазі. Ці два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча
кристалізація більш виражена при відносно швидкому, а осмотичні зміни –
при повільному заморожуванні.
Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато
складнішим від заморожування сперми, оскільки ембріони є
багатоклітинними утвореннями. Тому
дуже важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх
захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.
В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в
навколоклітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду,
тоді як в решті розчину зростає концентрація солей.
Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та
внутрішньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі
клітинами води в позаклітинне середовище.
Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу
середовища додають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи
гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень – штучно стимулюють
кристалізацію на певній стадії. Проте саме введення до складу середовища з
ембріонами кріопротектора, як і його видалення, може викликати осмотичні
зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять поступово, поміщаючи
ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку на 5–10-хв. у
0,25 М розчин ДМСО, тоді – в 0,5 М, 1,0 М і нарешті – 1,5 М розчин.
В останньому розчині ембріони витримують 15–20 хвилин. Якщо
кріопротектором служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10
хв. у 3,3 %-ий його розчин, тоді на 14 хв. у 6,6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-
ий розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від
кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією
кріопротектора в менш концентровані розчини.
Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по
пробірках, ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи
двоетапним методом, повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в
такій послідовності: середовище – повітря – середовище з ембріоном –
повітря – середовище. Кожен стовпчик повинен займати в пайеті біля 1–2 см
довжини. Один край пайети закривають зволоженим корком.
Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4–5 ºС
до початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину
зернину
льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет
(проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і
швидко торкаються ним поверхні рідини).

5. Оволодіти практичними навиками повільного та швидкого

заморожування та розморожування ембріонів.
Охолоджують ембріони від 20 ºС до –7 ºС зі швидкістю 1 ºС/хв., викликають
кристалізацію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 ºС/хв. до –36 °С далі – зі
швидкістю 0,1 ºС/хв. до –60 °С і переносять в рідкий азот.
Розморожують ембріони в спиртовій бані – скляній циліндричній колбі з
температурою –50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і
розморожують зі швидкістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв.
у водяну баню з температурою 20 °С. Нарешті, переносять ембріони в
середовище для видалення кріопротектора.
Швидке заморожування та розморожування ембріонів.
 Охолоджують ембріони у міні-пайетах – від 20 ºС до 7 ºС зі швидкістю 1
ºС/хв., викликають кристалізацію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 ºС/хв.
лише до –30 ºС і переносять в рідкий азот. Розморожують ембріони у водяній
бані з температурою 37 °С протягом 30 сек. зі швидкістю 3,0 °С/хв.
НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію
заморожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0,5 М
розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1,3 М
ДМСО, після чого, по 3–4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5
мл 1,0 М ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний
апарат для охолодження і заморожування.
Заморожування ведуть за такою програмою: від 22–25 °С до 6 °С зі
швидкістю 1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища
і заморожують від –7 °С до
–40 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв., від –40 °С до –60 º С – зі швидкістю 0,1 ºС/хв.,
після чого переносять пробірки з охолодженими до –60 °С ембріонами в
рідкий азот.
Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у
соломинках, які містять одночасно два середовища – для заморожування
(рідина Дюльбекко з 10%-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і
середовище для розморожування (рідина Дюльбекко з 20% фетальної
сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку
струшують (для змішування середовищ), витримають на 10–20 хв. при
кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.