In this practicum, the qualitative the determination of cholesterol was carried

out using the Liebermann-Burchard method.

The determination of total cholesterol levels by the Liebermann-Burchard
method was first discovered by Liebermann-Burchard method was first discovered
by Liebermann in 1885 and shortly there after by Burchard used for cholesterol
analyst. At first, chlorophene was used as a solvent, but the Liebermann-Burchard
reaction now uses acetic acid-sulfuric acid-acetic anhydrate. Another widely used
method is the zak reaction which was first used in 1853 by Zlatkis, zak and Boyle
for cholesterol analysis, using acetic acid-sulfuric acid without acetic anhydrate.
To get the desired color, Fe3+ must be added.
The advantages of the Liebermann-Burchard method have many advantages,
among others, the implementation procedure is relatively easy and the temperature
factor doesn’t really affect the color reaction (
This sample used pure cow’s milk is to determine cholesterol level’s in dairy
products, to understand the impact of milk consumption on cholesterol levels in the
human body.
The first step is to prepare 1g sample that has been prepared and then put in
a test tube and then add acetone ethanol (1:1). The addition of acetone to milk
sample for cholesterol determination has the main purpose of separating
cholesterol from other components in milk, escpecially proteins and carbohydrates.
Acetone, as an organic solvent, helps precipitate protein in the sample, so that
cholesterol can be isolated more easily.
After that, the isolation was homogenized using a vortex. Acetone is a good
for cholesterol. By mixing the sample with acetone, the cholesterol with dissolve in
the acetone, allowing for effective extraction.
Reaction :

The homogenized test tube was then heated with a waterbath until it popped.
After that, the test tube was removed and cooled at room temperature for 15
minutes it aims to stop chemical reaction and improve phase separation. The next
step is that test tube containing the sample is centrifugated at 1700 rpm for 15
minutes. This is done to see phase separation and component separation. After that
two phases are formed, namely the clear part or supernatan containing water,
lactose, vitamins, minerals, and electrolytes and other nutrients. Components while
the bottom or sediment contains fats and proteins and other nutrients. Heating
carried out with a waterbath until a paste is formed aims to increase solubility and
facilitate phase separation or component heating can change the physical or
chemical properties of the components in the sample, thus facilitating phase
separation or isolation of certain components.
After that, put glacial acetate acid and complexing solution into the test tube
containing the residue and then homogenized and then allowed to stand for 5
minutes to be isolated to avoid exposure to sunlight this is done to protect from
exposure to sunlight, storage in the dark of avoided from sunlight can help prevent
unwated chemical reactions that can occur due to exposure to light, such as
degradation of certain substances or discoloration. The result obtained are clear
purple. This is because the composition in Bearbrand milk in the form of fat and
protein has small levels so that the results obtained in qualitative analysis for
cholesterol testing of fat in the sample can be categorized as low fat.
Surfactants, or surface agents are substances that have a dualty of
hydrophilic head and a hysophobic. The purpose pf concentrating surfactants is to
help create stability between two phases that are insoluble in each other and
emulsion strability : in formulations such as creams or suspersions, concentrated
surfactants can improve emulsion stability, which is the resistance of a mixture
between two phases that are insoluble in each other (usually oli and water). This
makes the product more resistant to separation and improves its quality.
Pada praktikum kali ini, penentuan kolesterol secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan
metode Liebermann-Burchard. Prinsip metode ini adalah ekstrak klomofor yang berisi kolesterol
akan bereaksi dengan asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat membentuk reaksi berwarna,
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu sapi murni untuk menentukan kadar
kolesterol dalam produk susu, untuk mengetahui dampak konsumsi susu terhadap kadar
kolesterol dalam tubuh manusia.

Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan 1g sampel yang telah disiapkan kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan aseton etanol (1:1). Penambahan aseton
pada sampel susu untuk penentuan kolesterol memiliki tujuan utama untuk fungsinya untuk
mengekstrak kuning telur tadi karena kolesterol bersifat non polar sehingga hanya dapat larut
dalam pelarut non polar. Setelah itu, hasil isolasi dihomogenisasi dengan menggunakan vortex.
Aseton sangat baik untuk kolesterol. Dengan mencampurkan sampel dengan aseton, kolesterol
akan larut dalam aseton, sehingga memungkinkan ekstraksi yang efektif.

Reaksi:

Tabung reaksi yang telah dihomogenisasi kemudian dipanaskan dengan penangas air
hingga meletup-letup. Setelah itu, tabung reaksi diangkat dan didinginkan pada suhu ruang
selama 15 menit, hal ini bertujuan untuk menghentikan reaksi kimia dan meningkatkan
pemisahan fase. Langkah selanjutnya adalah tabung reaksi yang berisi sampel disentrifugasi
dengan kecepatan 1700 rpm selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk melihat pemisahan fasa
dan pemisahan komponen. Setelah itu terbentuk dua fase, yaitu bagian bening atau supernatan
yang mengandung air, laktosa, vitamin, mineral, dan elektrolit serta nutrisi lainnya. Komponen
bagian bawah atau endapan mengandung lemak dan protein serta nutrisi lainnya. Pemanasan
yang dilakukan dengan waterbath hingga terbentuk pasta bertujuan untuk meningkatkan
kelarutan, menghilangkan pelarut yang digunakan tadi dan memudahkan pemisahan fase atau
komponen. Pemanasan komponen dapat mengubah sifat fisika atau kimia dari komponen dalam
sampel, sehingga memudahkan pemisahan fase atau isolasi komponen tertentu.
Setelah itu, masukkan asam asetat glasial dan larutan pengompleks, fungsi penambahan larutan
pengompleks untuk pemberi zat warna pada larutan ke dalam tabung reaksi yang berisi residu
kemudian dihomogenkan lalu didiamkan selama 5 menit untuk diisolasi agar terhindar dari
paparan sinar matahari, penyimpanan dalam keadaan gelap yang terhindar dari sinar matahari
dapat membantu mencegah reaksi-reaksi kimia yang tidak dikehendaki yang dapat terjadi karena
paparan cahaya, seperti degradasi zat tertentu atau perubahan warna. Hasil yang diperoleh adalah
warna larutan menjadi coklat.. Hal ini dikarenakan komposisi dalam susu Bear brand berupa
lemak dan protein memiliki kadar yang kecil sehingga hasil yang diperoleh pada analisis
kualitatif untuk pengujian kolesterol lemak pada sampel dapat dikategorikan rendah lemak.
Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang menghasilkan warna
coklat. Warna ini disebabkan karena adanya gugus hidroksi (−OH) dari kolesterol bereaksi
dengan pereaksi Lieberman Burchard dan meningkatkan konjugasi dari ikatan tak jenuh dalam
cincin yang berdekatan. Warna coklat ini menandakan hasil yang positif.

Pereaksi Lieberman Burchard merupakan campuran antara asam setat anhidrat dan asam
sulfat pekat. Asam asetat anhidrat digunakan untuk mengekstraksi kolesterol, memastikan media
bebas air dan membentuk turunan asetil dari steroid, asam sulfat pekat ditetesi melewati dinding
akan menghasilkan warna coklat untuk senyawa steroid termasuk kolesterol. Mekanisme yang
terjadi dalam uji ini ketika asam asetat glasial ditambahkan ke dalam campuran yang berisi
kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi
membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung
kromofor yang menghasilkan warna coklat. Warna ini disebabkan karena adanya gugus hidroksi
(−OH) dari kolesterol bereaksi dengan pereaksi Lieberman Burchard dan meningkatkan
konjugasi dari ikatan tak jenuh dalam cincin yang berdekatan. Warna coklat ini menandakan
hasil yang positif.