Professional Documents
Culture Documents
Modern Technikák Kredit Kurzus - A Jelátviteli Folyamatok Molekuláinak Protein És RNS Szintű Vizsgálata - 20200317
Modern Technikák Kredit Kurzus - A Jelátviteli Folyamatok Molekuláinak Protein És RNS Szintű Vizsgálata - 20200317
Korszerű vizsgálómódszerek az
élettudományokban
A jelátviteli folyamatok molekuláinak
protein és RNS szintű vizsgálata
(immuncito- és hisztokémia, konfokális
mikroszkópia, Western blot, kvantitatív
„real-time” PCR)
Milyen anyagon?
- Szöveten – immunhisztokémia
- Sejten - immuncitokémia
Immuncito/hisztokémia - Alaplépések
Metszetek el- és előkészítése
- Fagyasztott, paraffinbe ágyazott (asszisztencia!)
- Antigénfeltárás a paraffinos metszetek esetében (főzés,
„kuktázás”, mikrohullám, különféle pH-jú pufferek)
Antitestek kiválasztása
- Egyszeres vagy többszörös jelölések
- NB!!! nagy figyelem az antitestek kiválasztását illetően –
SPECIES!!!
• Gyors
• Viszonylag kevés nem specifikus reakció
• A jel erősítése kicsi
• Erősen kifejeződő antigének kimutatására
• Nem a legelterjedtebb módszer
Kétlépéses indirekt módszerek
• Flexibilis
• Magasabb érzékenység
• Keresztreakciók az endogén immunglobulinokkal
→ Serum preinkubáció
Kétlépéses indirekt módszerek
Kettős jelölés
mk
• Ma a legelterjedtebb módszer
• Igen magas érzékenység
• Endogén biotinok gátlása szükséges lehet
• Az alapmódszer módosításával növelhető a
szenzitivitás, leegyszerűsíthető az eljárás
(Strept)avidin-biotin módszerek
Általános ABC eljárás és LSAB módszer
• Az avidin-(vagy
streptavidin) biotin- • Elsődleges antitest
enzimkomplex a biotinilált • Biotinilált másodlagos antitest
másodlagos antitesttel
• Streptavidin-enzim konjugátum
reagál
• Szubsztrát-chromogén reakció
• Avidin és biotinilált enzim
megfelelő aránya
(Strept)avidin-biotin festés
HSZ
HSZ
SBK
BK
400x 400x
400x
400x
ORS
ORS
IRS
IRS
dp
DP
mk DAB
TSA
Immunfluoreszcens
TGF2
TSA
Kontroll Kezelt
Polimerkapcsolt módszerek
• A próba túl hosszú idejű fixálása pl. • Fixálás standardizálása, antigén feltárás
formalinban
• Metszés során keletkezett artefaktumok
• A próba egy része nem fixált
3. A kontroll és a próbák háttérfestődése
PKC
PKC
PKC
PKC
Immuncitokémia
Texas Red & FITC (kettős jelölés)
PKCg (piros-Texas red) expressziója nő az humán vázizomsejtek
differenciálódásával (desmin; zöld-FITC) párhuzamosan
4d 8d 12d
16d 25d
Immuncitokémia
Texas Red & FITC & DAPI (hármas jelölés)
P2X2 receptor (piros-Texas red) expressziója humán vázizomsejtekben
(az izomspecifikus marker desmin; zöld-FITC) (magfestés: kék-DAPI)
KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA
Konfokális mikroszkópia
Általánosan
- minden olyan sejtalkotó kimutatható, amit a sejt termel
(peptidek és proteinek)
- enzimek, receptorok, citoszkeletális komponensek, etc.
- a szubcelluláris lokalizáció és integritás meghatározása
- kvantitatív meghatározás lehetséges (image analizáló
szofverek)
- csak fluoreszcens jelölések (lézeres gerjesztés)
- optikai „szeletelés”
- 3D képek
- „Real time” is kivitelezhető
Milyen anyagon?
- Szöveten
- Sejten
Konfokális mikroszkópia
Kontroll IGF-I Kontroll IGF-I
g z
Kontroll IGF-I
Jellemzők
- minden, ami fehérje (receptor, enzim, sejtalkotó, etc.)
- nagy specificitás
- kvantitatív!!!, az immunreaktív csíkok denzitometriás
vizsgálatával (OD)
Általánosan
- elektroforézis: töltéssűrűség & feszültséggradiens (CAVE!)
- anód (+) & katód (-)
- zóna elektroforézis:
- hordozó közegben (agaróz, poliakrilamid)
- molekulaszűrő hatás elválasztás méret szerint
Western blot
PAGE
- akrilamid & biszakrilamid polimerizáció
- AMPER & TEMED indukció & stabilizáció
- vátoztatható sűrűség (3.5-20%), tehát szűrőképesség
Western blot
SDS-PAGE
- SDS - detergens
- minden fehérje NEGATÍV töltésű
- minden fehérje EGYFORMA ALAKÚ
- segítség: DTT jelenlétében főzés (denaturáció & S-S híd bontás)
- Eredmény: a fehérjék MÉRET ALAPJÁN szétválaszthatók!!!
Western blot
Laemmli-féle diszkontinus puffer-gél rendszer
- felső gél: pH 6.8 koncentrálás a startvonalon
- alsó gél: pH 8.8 igazi szétválasztás
- puffer: Tris/Glicin
Western blot
• Protokoll
a sejtek összegyűjtése lízis-pufferben (hipotóniás, proteáz gátlók)
ultrahangos feltárás (szonikálás)
proteinmeghatározás
minták elkészítése SDS-mintapufferben
X%-os SDS-PAGE
elektrotranszfer nitrocellulóz-membránra
inkubáció egérben vagy nyúlban termelt elsődleges antitesttel (jelölés)
inkubáció torma-peroxidáz-konjugált anti-egér vagy -nyúl másodlagos antitesttel
vizualizálás ECL (kemilumineszcens) kit segítségével
Western blot – A minták el- és előkészítése
Western blot – A proteinmeghatározás
Western blot – A futtató rendszer
Western blot – A futtató rendszer
Western blot – Az alsó gél
Western blot – A felső gél
Western blot – A mintafelvitel (loading)
Western blot – A futtatás (SDS-PAGE)
Western blot – A blottolás (elektrotranszfer)
Western blot – Az immunfestés
Western blot – A mosás
Western blot – Az előhívás
Western blot – A proteinfestés
Western blot – A film
Western blot – A film
Western blot – A film
Western blot – A GelDoc rendszer
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A publikáció
BP ORS HaCaT
VR1
Western blot – A publikáció
Kvantitatív denzitometria
A B
Days of culturing
2 4 6 8 10
e
PKC 120
z
PKC 100
Normalized OD (%)
80
PKCe
60
PKC
40
PKC
20
PKC
0
PKCz
2 4 6 8 10
Days of culturing
Western blot – Előhívás helyett:
LAS-3000 Intelligent Darkbox
Western blot – Denzitometria helyett:
Kemilumineszcencia intenzitás
Western blot – Prezentáció
113 kDa
91 kDa
PKCα
49,9 kDa
Katalitikus alegység
35,5 kDa
RT-PCR
Mi a PCR?
“The polymerase chain reaction (PCR) is a biochemical technology in molecular
biology to amplify a single or a few copies of a piece of DNA across several
orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of a particular
DNA sequence.”
• Szervek
• Szövetek Funkciók és szabályozásuk
• Sejtek
A sejt molekulái
Kis molekulák
• Szerves molekulák
• Szervetlen molekulák
Makromolekulák
• Lipidek
• Fehérjék
• Nucleinsavak
Proteinek és nuklein savak
A fehérjék a fő “végrehajtók”
• Enzimek
• Receptorok
• Transporterek
• Regulátorok
• Stb.
A fenotípus fő meghatározói
A “hozzájárulásuk” expresszió és aktivitás függő
Expressziós vizsgálatok
Proteinek és nuklein savak
Nuklein savak
• DNS - genome
- Információ tárolás
• RNS - transcriptome
- messengerek
- regulátorok, etc.
A fehérjék és nukleinsavak közeli kapcsolata
– A gének…
A gén definiciója:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the synthesis of a
functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)
A gén definiciója:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the the synthesis
of a functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)
Definitions of a gene:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the the synthesis
of a functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)
mRNS
mRNS
anlízis:
(Q)PCR
Történelmi háttér
Hozzávalók:
- RNS templát
- Reverz transzkriptáz enzim
- Primerek:
- szekvencia specifikus primer
- oligo dT primer – mRNS specifikus
- random primer – minden RNS-t felismer
- dNTP
- puffer, ionok
- RNAse inhibitor (opcionális)
A klasszikus PCR elvei – a reakcióelegy
- DNs templát
- Hőstabil DNS polimeráz – Taq polymerase
- Forward és reverse primerek – Tm~ ugyanaz (2 oC)
- A polimeráz csak duplaszálú DNS-ről tud indulni
- Specifitás
- dNTP-k (Deoxinukleozid trifoszfátok)
- Puffer oldat
- Ionok (Mg2+!)
A klasszikus PCR elvei – az amplifikáció (sokszorozás)
20-40 cycle
21= 2 kópia
22= 4 kópia
23= 8 kópia
A klasszikus PCR elvei – a detekció
Agaróz-gélelektroforézis
Ethidium bromid jelölés (karcinogén)
UV fluoreszcencia
Minőségi analízis (specifitás): A termék (amplikon) mérete
Mennyiségi analízis: fluoreszcencia intenzitás
- semi-kvantitatív
- FONTOS: próbáljunk az amplifikáció exponenciális fázisában detektálni
- belső kontrollok használata
TGF2 565
547
418 -actin 420
359
Előnyök és hátrányok
• Optimalizáció szükséges
• Olcsó - primer koncentrációja
- primerek - Mg2+ koncentráció
- készülék - hőmérséklet
• Flexibilis → gradiens PCR
• különböző gének – különböző
protokoll → Sok munka, idő és minta!
• Ethidium bromid
• Szemikvantitatív
271 bp
MgCl2 (mM) 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4
primer (pmol/ul) 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1
Hagyományos vs. kvantitatív PCR
Hagyományos PCR QPCR
Ugyanazok az alapelvek
Detekció: Detekció:
- Gélelektroforézis után - A reakció során
- Fluoreszcens festék - Fluoreszcencia
- Végpont - Valósidejű (Real-time)
Szemikvantitatív Kvantitatív
- abszolút
- relatív
Optimalizálás szükséges Optimalizálás az alkalmazott detekciós
módszer (real-time chemistry) függvénye
Optimalizálás: Optimalizálás:
- Mint a hagyományos PCR estén - praktikusan nem szükséges
- optimalizált hagyományos PCR (előretervezett assayk esetében)
protokol adaptálható
Flexibilis, számos aplikáció
Flexibilis, mint a hagyományos PCR Universal conditions (predesigned
assays)
Minden primer esetén egyedi kondíciók
Multiplexing (egy csőben több
különböző reakció egyidőben)
lehetséges
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Reporter Quencher
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
20-40 ciklus
21= 2 kópia
22= 4 kópia
23= 8 kópia
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Fluoreszcencia
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
4. ciklus
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
5. ciklus
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
ciklusszám
Detekció SYBR Green festékkel
Real-time fluorescence
Fluorescence
End-point
Cycles
End-point
Cycles
A reakció végén a terméket
lassan fűtjük. Ilyenkor a
hibridizációs hőmérséklet
elérésekor a két szál disszociál
amit a festék
fluoreszceniájának csökkenése
kísér. Ha egy termék van csak,
a disszociáció egy lépésben, egy
adott hőmérsékleten
következik be – specificitás
ellenőrzése.
A detekció precizitása
Fluorescencia
- Nagy precizitás
- Exponentciális növekedés
Ciklusszám
Refrencia festék és Rn – fokozott precizitás
Egy passzív referencia
Fluoreszcencia
festék hozzáadása (ROX)
→ Normalizáció
- Intenzitás szórása ↓
- High precision
- Térfogat szórása↓ - Exponential growth
Normalizált reporter
Csökkent variabilitás
szignál (Rn)
Fokozott precizitás
Reporter szignál
Rn=
Passzív referencia
Ciklusszám
Lineáris y tengely
Logaritmikus nézet
Logaritmikus y tengely
A mennyiségi meghatározás alapjai– A „cycle
threshold” (Ct)
Fluoreszcencia
Ct érték
Küszöb
Alapvonal Ciklusszám
Mennyiségi meghatározás
Abszolút Relatív
kvantifikáció kvantifikáció
Ct
Ismeretlen minta
Ct
• - Actin (ACTB)
• Cyclophilin A (PPIA)
• Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)
0,003
0,002
0,001
0,000
control treated
0,003
0,002
0,001
0,000
control treated
0,003
0,002
0,001
0,000
control treated
4
x-fold increase
(control = 1) 3
0
treated treated2 treated3
Primerek:
- Tm: 58-60 oC
- ∆Tm < 2 oC
- Ne legyen comlementer szekvenicai a párok között
- Kerüljük a sorban azonos nukleotidokat egymás után
- G és C optimális száma és pozíciója
- stb.
Proba:
- Rövid
- Ne legzen belső homológia
- Ne legyen homológ a primerrel
- Ne legyen G az 5’ végen (jelcsilapítás)
- Proba Tm legyen magasabb mint a primer Tm (8-10oC)
- stb.
Assay tervezés és specifitás
Fehérjekódoló mRNS detekciójához exon-exon határt
célozzunk
Assay tervezés és specifitás
Fehérjekódoló mRNS detekciójához exon-exon határt
célozzunk
Kész megoldások:
Előre tervezett primerek
és próba egyetlen csőben
Assay tervezés és specifitás
Hs00234244_m1
Szövet
Mintagyűjtés
Tárolás
RNS tisztítás
RNS
Tárolás
DNáz kezelés
Reverz transzkripció
cDNA
Q-PCR
Expressziós
eredmények Rnases!!!
Minőségi (és mennyiségi) kontrol
Fotometriás mérés
- Nanodrop spektrofotometer
A280: Fehérjék
Bioanalyzer (Agilent)
Chip alapú mikrogélelektroforézis RNS
festékkel