GÉNEXPRESSZIÓ

VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK
2019

Bálint Bálint L.
E-mail: lbalint@med.unideb.hu
 A GÉNEXPRESSZIÓ
VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI
MIT LEHET VIZSGÁLNI?

1. Transzkripciós faktorok kötődése a DNS-hez,

a válaszadó elemhez

2. Promóterek aktivitásának vizsgálata

3. Egyes gének mRNS-ének kimutatása

4. Egy adott szövet vagy sejt összes mRNS-ének

globális vizsgálata
MIT LEHET VIZSGÁLNI?

1. Transzkripciós faktorok kötődése a DNS-hez,

a válaszadó elemhez
Electromobility shift assay (EMSA)
Kromatin immunoprecipitation (ChIP)

2. Promóterek aktivitásának vizsgálata

Reporter gének

3. Egyes gének mRNS-ének kimutatása

RT-PCR
Northern blot

4. Egy adott szövet vagy sejt összes mRNS-ének

globális vizsgálata
Microarray
ELECTROMOBILITY SHIFT ASSAY

Alapja: a szabad DNS és a fehérjekötött DNS

elektroforetikus mobilitása eltér. Ha az adott DNS-hez
kapcsolódik egy fehérje, lassabban vándorol.
ELECTROMOBILITY SHIFT ASSAY

Mi szükséges hozzá?
Duplaszálú DNS
Fehérje (tisztított, in vitro
transzlált,
magextrakt)
ELECTROMOBILITY SHIFT ASSAY

Láthatóvá kell tenni a DNS-t

vagy a fehérjét.
Általában a DNS-t jelölik.
Lehet radioaktív vagy
nem radioaktív jelölés.
Autoradiográfiával lehet
detektálni a radioaktivitás
eloszlását a gélen.
CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (ChIP)

Mit jelent ez a kifejezés?

Kromatin: Ahogy a sejtmagban a kétszálú DNS elhelyezkedik,
a fehérjék és a DNS együtt.
Immunoprecipitálás: Az immunsejtek termelnek fehérjéket,
melyek specifikusan képesek más fehérjéket felismerni, ezek
az antitestek.
Lehetőség van arra, hogy egy fehérje keverékből kivonjuk
(precipitáljuk) azt az egyféle fehérjét, amit szeretnénk, ha van
ez ellen a fehérje ellen készült antitestünk. Így elválasztjuk ezt
a kívánt fehérjét a többitől, ez az immunoprecipitálás
folyamata. Amennyiben a precipitált fehérje más molekulákkal
kapcsolódott, lehetőség van arra, hogy a precipitálás során
az interakcióban levő egyéb molekulákat is eltávolítsuk. Így
meghatározhatók az adott fehérjével interakcióban levő egyéb
molekulák.
IMMUNOPRECIPITÁLÁS
Kromatin Immunprecipitáció

Alapja: A DNS-kötő fehérjéket specifikus antitestekkel

precipitálva, elválasztható egy adott fehérje és a DNS-
szakasz, amihez kapcsolódott, és utólag meghatározható,
hogy melyik DNS-szakasz vett részt a fehérje megkötésé-
ben, azaz, az adott fehérje a DNS melyik részéhez
kapcsolódott.
Kromatin Immunprecipitáció
Kromatin Immunprecipitáció

Mi szükséges hozzá?
Élő sejtek
Fixálás: biztosítja, hogy a folyamat során az eredeti állapotban
rögzüljön a fehérje a DNS-hez
Fragmentálás: a kromatint kis darabokra bontja szét, ez szabja
meg, hogy a fehérje DNS-hez kötődése milyen finom fel-
bontással határozható meg (pl. 2 kb-os DNS fragmentek
esetén csak annyit lehet megmondani, hogy az adott fehérje
valahol a 2 kb-on belül kötődik, 500 bp-os DNS darab esetén,
a fehérje kötődése már 500 bp-ra lokalizálható).
Jó antitest az immunprecipitáláshoz.
Kromatin Immunprecipitáció

A gént indukálja az ösztogén receptor, B gént nem.

Az ösztrogén receptor, ami egy transzkripciós faktor, amit az
ösztrogén aktivál, lekötődik azon gén (jelen esetben az A gén)
promóteréhez (ösztrogén receptor response element), amit
szabályoz.
Kromatin Immunprecipitáció

Detektálás: a precipitált fehérje elválasztása során még kötve

van a DNS-hez. A következő lépés a DNS tisztítás
Ezután azt kell meghatározni, hogy mi ez a DNS.
Ez történhet:
Szekvenálással
PCR segítségével
Hibridizációval (microarray technológia)
REPORTER GÉNEK

Reporter gén: olyan gén, amiről a képződő fehérje szintje

könnyen mérhető pl. egy enzimaktivitás méréssel és a mért
aktivitás arányos a gén előtt levő promóter darab aktivitásával.
REPORTER GÉNEK

Alapja: A vizsgálni kívánt promótert vagy annak egy darabját

beklónozzuk egy reporter gént kifejező vektorba. Ezt a vektort
bejuttatjuk valamilyen sejtbe, ahol róla kifejeződhet a reporter-
nek megfelelő fehérje. A célnak megfelelően változtatjuk
a promóter aktivitását és mérjük a reporter aktivitását, ez
alapján meghatározható, hogy bizonyos stimulusok az adott
promóteren keresztül szabályozzák-e a gén kifejeződését.
REPORTER GÉNEK
RT PCR

Alapja: az RNS-t átírjuk cDNS-sé a reverz transzkriptáz

enzimmel, a cDNS PCR reakció templátjául szolgálhat és
felsokszorozható. Így meghatározható, hogy egy adott gén
kifejeződik-e vagy nem, a primerek megválasztásával
eldönthető melyik splice variáns fejeződik ki.
RT PCR

Mi szükséges hozzá?
RT: Totál RNS vagy mRNS sejtekb!l izolálva.
Reverz transzkriptáz, ribonukleotidtrifoszfátok,
reverse primer
PCR: cDNS templát
dezoxinukleotid-trifoszfátok
Taq DNS polimeráz
Forward és reverse primerek
PCR készülék
REVERZ TRANSZKRIPTÁZ

Retrovirusokra jellemző fehérje. Ezek a vírusok RNS genommal

rendelkeznek és a reverz transzkriptáz írja át az RNS-t cDNS-sé.
Három enzimaktivitással rendelkezik:
RNS-függő DNS polimeráz
RNáz H
DNS-függő DNS polimeráz
RT PCR

Detektálás: PCR termék

Agaróz gélelektroforézis - interkalálódó festék
CCD kamera - fluoreszcens szignál, ami arányos a keletkező
termék mennyiségével, ez a kvantitatív PCR

Példa:
A gén - 2 alternatív splice variáns: 1. 1-5 exon, 1000 nukleotid
2. 2-8 exon, 1500 nukleotid
Kérdés: kifejeződik-e ez a mRNS és melyik splice variáns
expresszálódik a különböző szövetekben?
Válasz: RT PCR két primer párral, az első primer pár a 1-2.
exonra van tervezve, a másik primer pár a 7-8. exonra.
RT PCR
NORTHERN BLOT

Alapja: sejtekből izolált RNS-t gélelektroforézissel elválasztjuk

méret szerint, majd transzferáljuk (=blottoljuk) egy membránra,
amihez a detektálni kívánt mRNS-nek megfelelő szekvenciájú,
jelölt specifikus oligo/polinukleotidot (probe) hibridizálunk,
majd a jelölésnek megfelelően detektáljuk a mRNS jelenlétét
vagy hiányát, meghatározzuk mennyiségét, hosszát.
NORTHERN BLOT
NORTHERN BLOT

Mi szükséges hozzá?
Sejtekből, szövetekből izolált totál RNS
Gélelektroforézis készülék
Specifikus probe, ami a detektálni kívánt 1 adott génről átírt
mRNS-sel képes bázispárosodni.
RNS GÉLELEKTROFORÉZIS

mRNS-ek mérete széles határok között változik, ezért nem adnak

egy diszkrét band-et, hanem egy elkent árnyékként látszanak.
NORTHERN BLOT

Detektálás: a probe jelölésétől függ. Legérzékenyebb a radio-

aktív jelölés, ekkor autoradiográfiával lehet detektálni
a helyeket, ahova a probe hibridizált.
NORTHERN BLOT

Az egyes transzkritek hossza megállapítható.

MICROARRAY (CHIP)

Alapja: egy adott sejt vagy szövet összes mRNS-ének egyidejű

detektálására és az egyes mRNS-ek szintjében mutatkozó
különbségek kimutatására alkalmas technika. Szemben
az előző módszerekkel itt nem egy mRNS-t tanulmányozunk
egy időben, hanem mindet.
Egy tárgylemezen helyezkednek el az egyes génekre specifikus
oligonukleotid vagy cDNS szekvenciák. Ezek egy-egy
meghatározott helyen (spot-ban) vannak. A minta mRNS-t
megjelöljük és hibridizáljuk a tárgylemezen levő cél-
szekvenciákhoz. Minél magasabban fejeződik ki egy adott
gén, annál több a mRNS, annál erősebb lesz a jel, az adott gén
poziciójában. Minél alacsonyabban fejeződik ki, annál
gyengébb lesz a jel. Ezt leolvasva, a jelintenzitás arányos lesz
az adott mRNS szintjével.
MICROARRAY
MICROARRAY
MICROARRAY

Mi szükséges hozzá?
Sejtekből, szövetekből izolált totál RNS
Ezek jelölése
Microarray
Scanner
Adatfeldolgozó szoftverek

53500 különböző transzkript

detektálása egyidejűleg.
MICROARRAY

Detektálás: kemilumineszcens szignál vagy fluoreszcens

szignál mérése attól függően, hogy milyen jelölést alkalmaztunk.
Lehet egy színű vagy kétszínű.
Egyszínű: 1 minta van hibridizálva egy microarray-hez.
Kétszínű: 2 minta két külön színnel jelölve verseng a microarray-
hez való kötődésért. A microarray-n az adott génnél az a szín
dominál, amelyik mintában az adott gén magasabban
expresszálódik.
MICROARRAY

Attól függően, hogy milyen szekvenciákat visznek fel a

tárgylemezre, sok fajta microarray létezik. Amennyiben
genomikus szekvenciát, akkor lehetőség van a chromatin
immunoprecipitáció eredményének a chip-re hibridizálására,
és a transzkripciós kötőhelyek egész genomszinten való
meghatározására (ChIP-on-chip). A teljes humán genom
a repetitív szekvenciák nélkül 14 tárgylemezre (chip-re) fér el.
LEGFONTOSABB FOGALMAK

EMSA

Kromatin immunoprecipitálás

Reporter gén

Reverz transzkriptáz

RT-PCR

Northern blot

Microarray