CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU
 12 Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về chitosan

1.1.1. Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cách
deacetyl hoá chitin. Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác
như tôm, cua. Chitosan còn có thể được tìm thấy từ những loài vi sinh vật như nấm,
men.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo chitin và chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế
nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan được cấu tạo từ các mắc xích
D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [15], [25].
 13 Tổng quan tài liệu

1.1.2. Tính chất chitosan

9 Không độc, tính tương ứng sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh học
nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến
môi trường.

9 Cấu trúc ổn định.

9 Tan tốt trong dung dịch acid loãng (pH < 6,3) và kết tủa ở những giá trị pH
cao hơn, hóa tím trong dung dịch iod.

9 Có tính kháng khuẩn tốt.

9 Là hợp chất cao phân tử nên trọng lượng phân tử của nó giảm dần theo thời
gian do phản ứng tự cắt mạch. Nhưng khi trọng lượng phân tử giảm thì hoạt
tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi.

9 Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng.

9 Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dương cao.

9 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích
N-acetyl-D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amine, vừa là
amide. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế
O-, dẫn xuất thế N-.

9 Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau
bởi các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các
chất như: acid, baz, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [15], [25].

1.1.3. Ứng dụng của chitosan

Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làm
cốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợp
chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid. Chitin
được dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật.
 14 Tổng quan tài liệu

Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì
hương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau
quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm.

Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp
nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc
tăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh
cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây nuôi cấy mô.

Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại của
kính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein,
phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm…[15], [25].

1.2. Tổng quan về nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong
những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano. Chitosan
là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài động
vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Với nhiều tính năng như tính tương
thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành
nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học. Do đó, hạt nano chitosan trở thành
hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn [32].

Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000nm) nên dễ dàng đi
qua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài
da, dùng qua đường miệng, qua mũi…. Nano chitosan có diện tích và điện tích bề
mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vaccine,
vectơ chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư…. Khi sử dụng nano
chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan
khỏi sự phân huỷ sinh học. Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm
sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [28].

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục
đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát
 15 Tổng quan tài liệu

triển vectơ chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư. Một số công trình
tiêu biểu là điều chế hạt chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và
kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn
thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền
đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [11]. Ngoài ra, nano
chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [9], [24], ứng dụng trong thực
phẩm chức năng [5], [6]. Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ,
điện tích bề mặt hạt nano chitosan vì đây là những đặc tính rất quan trọng quyết
định hiệu quả gây nhiễm gen, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano [12]. Tuy
nhiên, các kết quả đạt được rất khác nhau [10], [20], [21], [30], [31].

Ở nước ta, số lượng bài nghiên cứu về nano chitosan rất ít. Mức độ cập nhật
của các nghiên cứu trong nước so với các nghiên cứu của các nhà khoa học khác
trên thế giới còn thấp, chỉ có nhóm của PGS. TS. Nguyễn Anh Dũng [2] và nhóm
của TS. Trần Đại Lâm [3] nghiên cứu về vấn đề này. Các khảo sát này bước đầu
cho thấy những kết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan làm chất mang
vaccine, thuốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa đi sâu vào khảo sát thực
nghiệm và đánh giá kết quả tạo hạt nano chitosan, chưa đáp ứng được hết những
tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con
người.

1.3. Các phương pháp chế tạo nano chitosan

Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan. Phương pháp được sử
dụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị
đơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do
đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và
thực phẩm chức năng [28].

Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt
và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hoá của chitosan. Hiệu
 16 Tổng quan tài liệu

quả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá trị pKa và độ hoà tan của
thuốc. Thuốc kết hợp với chitosan qua tương tác tĩnh điện, liên kết hidro, … [28].

Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan còn phụ thuộc vào bản
chất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau
[11].

Bảng 1.1. Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitosan làm chất dẫn các loại
thuốc, protein hoặc gen khác nhau.

Phương pháp điều chế nano chitosan Thuốc/ protein/ gen

Gel ion Insulin, ricin, BSA, cyclosporine A

Phương pháp giọt tụ/kết tủa DNA/Doxorubicin

Hợp nhất giọt nhũ tương Acid gadopentetic

Mixen đảo Doxorubicin

Theo S.A. Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano
chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương
pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ
tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation) và
phương pháp mixen đảo (reverse micellar) [4].
 17 Tổng quan tài liệu

1.3.1. Phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/v) được tạo ra bằng cách phân tán
dung dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề
mặt. Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp
như glutaraldehyde. Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm
–NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan [4].

Hình 1.2. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương
 18 Tổng quan tài liệu

1.3.2. Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung
dịch kiềm. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp
xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc
ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch
kiềm để tạo hạt nano [4].

Hình 1.3. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ.

 19 Tổng quan tài liệu

1.3.3. Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999. Phương pháp này sử
dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa. Thay
vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết
hợp với các giọt NaOH. Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với
thuốc tạo ra trong paraffin lỏng. Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung
dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên. Khi cả hai hệ nhũ
tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một
cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ [4].

Hình 1.4. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương.
 20 Tổng quan tài liệu

1.3.4. Phương pháp tạo gel ion

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích
điện dương và một polyanion như tripolyphosphate. Kỹ thuật này có ưu điểm là giai
đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước. Đầu tiên chitosan được
hòa tan vào dung dịch acid acetic. Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để
tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng. Kích
thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan
và polyanion khác nhau [4].

Hình 1.5. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion.

1.3.5. Phương pháp mixen đảo

Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung
môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo. Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc
được thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch. Pha lỏng
được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt. Sau đó tác nhân tạo nối
ngang dược thêm vào và khuấy qua đêm. Cô quay loại dung môi. Phần còn lại phân
tán lại trong nước. Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạt
 21 Tổng quan tài liệu

động bề mặt. Hỗn hợp được ly tâm. Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang
thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ. Đông cô chất lỏng thu được cho
ta bột thuốc [4].

Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo.

1.4. Ứng dụng của hạt nano chitosan

1.4.1. Chất mang dẫn truyền thuốc

1.4.1.1. Phân loại theo con đường sử dụng

Hạt nano chitosan có kích thước nhỏ nên nó thích hợp cho nhiều con đường
sử dụng thuốc khác nhau..

• Sử dụng bên ngoài đường tiêu hóa

Các hạt nano có thể được dùng trong tĩnh mạch bởi vì đường kính của các
mao mạch máu nhỏ nhất là khoảng 4µm. Sự phân bố sinh học của các hạt nano có
thể thay đổi tùy thuộc vào kích cỡ, điện tích bề mặt và tính kỵ nước của chúng. Các
hạt có bán kính lớn hơn 100nm sẽ bị hấp thu nhanh chóng bởi hệ lưới-nội mô trong
gan, lá lách, phổi và tủy xương. Ngược lại, những hạt nhỏ hơn có xu hướng có thời
gian luân chuyển kéo dài [28].
 22 Tổng quan tài liệu

Các loại thuốc hứa hẹn nhất đã được nghiên cứu rộng rãi để dẫn truyền theo
cách này là những tác nhân kháng ung thư. Sau khi tiêm vào tĩnh mạch, nhiều hệ
thống hạt nano bao gồm nano chitosan có xu hướng tích lũy lại trong một số khối u
(Brasseur, 1980; Kreuter, 1994). Những hạt nano chitosan mang doxorubicin làm
chậm sự tăng trưởng của khối u và nâng cao tỷ lệ sống sót của những con chuột bị
cấy khối u. Ngoài ra, những hạt nano chitosan có kích thước nhỏ hơn 100nm được
tạo ra cho thấy đã tránh khỏi hệ lưới-nội mô và luân chuyển trong máu được lâu
hơn [28].

Dẫn truyền những dược chất kháng bệnh như là kháng khuẩn, kháng virus,
kháng nấm và kháng ký sinh là một hướng sử dụng khác của hạt nano (Bender,
1996; Page-Clisson, 1998; Soma, 2000). Chỉ số điều trị của thuốc kháng nấm thấp,
thời gian bán hủy của những dược chất kháng virus ngắn và khả năng thâm nhập
vào tế bào bị bệnh trong khoang nội bào của thuốc kháng sinh kém làm cho những
hạt nano trở thành những ứng viên dẫn truyền lý tưởng. Những hạt nano một mặt
nâng cao hiệu quả điều trị, mặt khác làm giảm tác dụng phụ độc hại của thuốc. Trên
lý thuyết, nano chitosan là hệ thống chất mang hấp dẫn cho những loại thuốc này vì
chúng có nhiều thuận lợi như có bề mặt ưa nước và kích thước nano nhỏ hơn
100nm. Ngoài ra, sử dụng trong cơ và dưới da cũng có thể là hướng dẫn truyền khác
của hạt nano bởi vì khả năng giảm kích ứng tại điểm tiêm và bảo vệ thuốc không bị
enzyme phân hủy (Little, 1962) [28].

• Sử dụng qua đường uống

Ý tưởng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị enzyme phân hủy trong bộ
máy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành những hệ thống dẫn truyền
những phân tử lớn, protein và polynucleotide. Phương pháp này được nghiên cứu
rộng rãi sau một báo cáo rằng lượng đường trong máu của những con chuột mắc
bệnh tiểu đường giảm sau khi uống những hạt nano insulin (Damge,1990). Kích
thước hạt nhỏ hơn 500nm là một yếu tố then chốt cho phép vận chuyển qua niêm
mạc ruột theo cơ chế endocytotic. Bên cạnh enzyme, màng nhầy ngăn cản sự
 23 Tổng quan tài liệu

khuyếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấp thụ biểu mô là chướng ngại
chính chống lại sự hấp thụ thuốc protein qua thành ruột. Do đó, hoạt tính của thuốc
có thể được cải thiện bằng cách kiểm soát kích thước hạt cùng với kéo dài thời gian
lưu giữ thuốc trong bộ máy tiêu hóa. Trong số những hạt nano polymer, hạt nano
chitosan là chất dẫn thuốc lý tưởng vì chúng làm tăng mức hấp thu thuốc [28].

Khả năng cải thiện mức hấp thu của chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi.
Đặc tính bám dính của chitosan là do tương tác giữa chitosan tích điện dương và
niêm mạc tích điện âm. Điều này làm kéo dài thời gian tương tác của thuốc và bề
mặt hấp thụ [28].

• Sử dụng qua đường mắt

Các hạt nano được nhận thấy là chất mang tiềm năng để dẫn truyền qua
đường mắt. Nhiều thí nghiệm cho thấy hạt nano có khuynh hướng bám chặt vào bề
mặt biểu mô mắt. Kết quả kéo dài thời gian lưu giữ, tốc độ đào thải thuốc chậm hơn
so với những phương pháp điều trị mắt truyền thống, do đó cải thiện dược tính của
thuốc. Vì vậy, những hạt nano đã được dùng để dẫn thuốc kháng viêm, kháng dị
ứng cho những mục tiêu điều trị viêm mắt [28].

Chitosan đã được sử dụng như là chất mang dẫn thuốc điều trị chứng viêm
mắt bởi vì tác động thúc đẩy mức hấp thu thuốc. Chitosan không chỉ gia tăng thời
gian tương tác với giác mạc qua tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của nó và
niêm mạc tích điện âm, nó còn có khả năng xuyên qua lớp niêm mạc, nâng cao
dược tính của thuốc. Nhóm của Felt (1999) tìm thấy dung dịch chitosan kéo dài thời
gian lưu giữ thuốc kháng sinh trên giác mạc của thỏ. Những tác động tương tự cũng
được quan sát thấy khi sử dụng những hạt nano chitosan. Những hạt này được giữ
trên giác mạc và kết mạc của thỏ ít nhất 24 giờ. Nhóm của De Campos (2001) phát
hiện thấy sau khi sử dụng những hạt nano chitosan trên thỏ, hầu hết thuốc được tìm
thấy trong những mô ngoài mắt, giác mạc và kết mạc trong khi chỉ một lượng thuốc
nhỏ được tìm thấy trong những mô trong mắt, mống mắt và chất dịch lỏng [28].
 24 Tổng quan tài liệu

1.4.1.2. Phân loại theo ứng dụng trong điều trị bệnh

• Hoạt tính kháng ung thư

Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicin để ức chế
khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicin độc lập thì khối u ở chuột
vẫn tăng lên 900mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giải chậm
doxorubicin trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170mm3 và
chuột vẫn sống sau 90 ngày thí nghiệm [2].

L. Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nano
chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính
cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S 180 và hepatoma
H 22. Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống
2,5mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0,5mg/kg là
43-53%, trong khi đó chitosan chỉ là 30% [2].

Kết quả cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung
thư càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá chất thuốc
chống tới tế bào đích ung thư. Kích thước hạt nano khoảng 350nm. Hiệu quả chống
ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột
A549 đồng thời làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư [2].

• Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc

Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporine A (Cry A) bằng
cách hấp phụ trong dung dịch chitosan và hạt nano chitosan. Lượng thuốc phóng
thích trong thí nghiệm hấp phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn gấp 2,5-3 lần so với
đối chứng là dung dịch Cry A. Kết quả là nồng độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm
luôn luôn cao hơn so với nhóm đối chứng và hấp phụ trong dung dịch chitosan [2].

El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốc
cycloporine A để uống, kích thước hạt nano là 150nm. Kết quả cho thấy hiệu suất
mang thuốc là 94%, nồng độ cycloporine A trong máu là 2760ng/ml cao gấp 2,5 lần
 25 Tổng quan tài liệu

so với hạt nano sodium glycholate. Hoạt tính của cyclosporine A cố định trong hạt
nano chitosan tăng 72%, gelatin nano chitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium
glycholate lại giảm tới 36% so với đối chứng [2].

Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêm
mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-nano chitosan, kích thước hạt nano là
150-300nm. Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-nano
chitosan cao hơn so với PEG-chitosan là 30-40%. Kích thước hạt nano càng nhỏ,
diện tích bề mặt hạt càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên
nhân ảnh hưởng đến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi. Shedaghi
(2008) hạt nano trimethyl chitosan để làm vật liệu ly giải chậm insulin. Kết quả cho
thấy động học ly giải của insulin nhốt trong hạt nano trimethyl chitosan ổn định và
kéo dài hơn [2].

Kevin (2001) sử dụng hạt nano chitosan mang thuốc doxobucin,

anthracyline[2].

Zing Zhang (2007) nghiên cứu phức hợp nano oleyl-chitosan mang thuốc
thải chậm doxorubicin trong phòng trị ung thư. Hiệu suất hấp phụ thuốc là 52,6%.
Động học ly giải chậm thuốc phụ thuộc pH môi trường được ghi nhận trong hình
cho thấy lượng pH 7,4 tốc độ ly giải thấp hơn trong môi trường acid pH 3,8 [2].

Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, nano
dietylmethyl chitosan và nano trimethyl chitosan. Kết quả về động học ly giải chậm
insulin khá ổn định cho cả ba vật liệu hạt nano [2].

1.4.2. Chất mang dẫn truyền vaccine

Một lượng lớn protein kháng nguyên và chữa bệnh đã được phát hiện. Tuy
nhiên, ứng dụng chúng còn khó khăn do phương pháp dẫn truyền protein thích hợp
chưa có sẵn. Việc tạo ra những chất mang để dẫn vaccine qua những lớp niêm mạc,
ví dụ niêm mạc ruột và mũi đã được thử nghiệm. Được dùng làm chất mang
vaccine, chitosan được chuyển thành những dạng khác nhau: dạng viên, dạng hạt,
hạt micro và hạt nano. Các thông tin tích lũy trong những năm qua cho thấy tầm
 26 Tổng quan tài liệu

quan trọng của kích thước và lợi thế của hạt nano so với hạt micro. Cụ thể hơn, các
nhà nghiên cứu đã tìm thấy số lượng hạt nano qua biểu mô ruột nhiều hơn số lượng
hạt micro. Do đó, việc điều chế những hạt nano chitosan làm chất mang dẫn truyền
vaccine đã thu hút được nhiều chú ý [7].

Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan để mang vaccine
tetanus qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350nm, điện tích là +40mV, có
hiệu suất mang vaccine tetanus là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạt
nano chitosan cao gấp lần so với sử dụng kháng nguyên tetanus tự do sau 2 tuần,
tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệm
sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so với đối chứng gấp 2,5 lần và tăng lên theo
thời gian từ 2-24 tuần [2].

Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng nano trimethyl chitosan làm tá chất cho
một tiểu đơn vị (subunit) của vaccine cúm H3N2. Kích thước hạt nano chitosan là
800nm. Hiệu suất hấp phụ kháng nguyên (LE) là 78%, khả năng hấp phụ kháng
nguyên (LC) là 13% (w/w). Kết quả miễn dịch cho thấy là các chỉ số miễn dịch HI,
IgG ở thí nghiệm nano trimethyl chitosan là 103 và 105 cao hơn so với antigen trong
muối đệm phosphate là 0,8.102 và 103, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng nano
chitosan cũng cao hơn 102 lần so với tá chất là dung dịch trimethyl chitosan [2].

Những hạt nano được điều chế bằng phương pháp vi nhũ và phương pháp tạo
nối ngang cộng hoá trị đều không thích hợp cho việc sử dụng làm chất dẫn vaccine.
Trong khi đó những hạt nano chitosan tạo nối ngang với TPP sử dụng làm chất dẫn
vaccine đã được nghiên cứu rộng rãi [7].

Điểm đến của vaccine có thể ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thu. Các hạt nano
chitosan cho thấy là chất dẫn truyền hiệu quả cho những nhiều phân tử lớn qua
đường mũi, khí quản, miệng và niêm mạc mắt (Janes, 2001; Van der Lubben, 2001;
Takeuchi, 2001; Dyer, 2002) [7].
 27 Tổng quan tài liệu

1.4.3. Chất mang dẫn truyền gen

Những hệ thống dẫn truyền không virus (non-virus) trong liệu pháp gen đã
được đề xuất để thay thế những vectơ virus. Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng
miễn dịch từ vật chủ. Hơn nữa, chúng định được mục tiêu, dễ bảo quản và sản xuất
lượng lớn. Những lợi thế này tạo động lực cho sự phát triển của chúng. Polymer
cation được nhận thấy là chất mang hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyền
gen không virus. Chất mang gen polymer nổi lên với hiệu quả chuyển gen, xác định
mục tiêu điều trị và khả năng tương thích sinh học tốt [7].

Chitosan là một vectơ không virus thích hợp cho dẫn truyền gen. Tương tác
giữa chitosan và DNA là tương tác tĩnh điện (Roy, 1997; MacLaughlin, 1998) .
Tương tác điện này mạnh đến nỗi phức chitosan-DNA không bị tách ra cho đến khi
nó vào trong tế bào. Chitosan và những dẫn xuất của chitosan tụ lại bảo vệ DNA
khỏi sự phân hủy DNase. Những hạt nano chitosan/DNA có khoảng phân bố kích
cỡ hẹp được tạo ra bởi quá trình giọt tụ. Những hạt nano chitosan/DNA có kích
thước từ 20-500nm nhỏ hơn những hệ thống polymer khác nên thâm nhập vào tế
bào thuận lợi hơn qua cơ chế endocytosis và/hoặc pynocytosis, làm tăng tốc độ gây
nhiễm (Mao, 1997; Sato, 2001) [7].

Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm
ligand để có tương tác tế bào cụ thể, như transferrin hoặc galactose (Mutara, 1996;
Erbacher, 1998; Park, 2001; Christopher, 2001; Gao, 2003; Kim, 2004) [7].

Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống đều cho thấy khi
hạt nano chitosan/DNA vào trong cơ thể, chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu
và bám trên những cơ quan khác nhau. Kích cỡ hạt khác nhau thì phân bố trên
những cơ quan khác nhau (Mao, 2001; Yoo, 2005). Hàng loạt nghiên cứu trong ống
nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy chitosan là vật liệu thích hợp để dẫn truyền
vaccine DNA và gen không virus [7].
 28 Tổng quan tài liệu

1.4.4. Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Sự phát triển những thực phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe tạo
ra cơ hội nâng cao sức khỏe cộng đồng. Kết hợp những chất có hoạt tính sinh học
vào trong thực phẩm như peptide, vitamine là cách thức đơn giản để tạo ra những
thực phẩm chức năng mang lợi những lợi ích sinh lý và giảm thiểu những rủi ro
bệnh tật. Tuy nhiên, hiệu quả ngăn chặn bệnh của những sản phẩm này nằm ở khả
năng bảo quản được hoạt tính sinh học của những thành phần hoạt tính. Đây là một
thách thức lớn bởi vì hầu hết các phân tử này có thời gian lưu giữ trong dạ dày
ngắn, tính thấm và độ tan kém trong ruột. Hơn nữa chúng không bền trong những
điều kiện chế biến thực phẩm hoặc trong bộ máy tiêu hóa (pH, enzyme, sự hiện diện
của những dưỡng chất khác). Những hệ thống bao giữ (encapsulation system) có thể
được sử dụng để vượt qua những giới hạn này. Tuy nhiên, vì được dùng trong
những ứng dụng thực phẩm, những hệ thống dẫn truyền phải được công nhận là an
toàn [5].

Trong số những hệ thống dẫn truyền này, hạt nano chitosan thu hút nhiều chú
ý trong những năm gần đây do khả năng bám dính vào niêm mạc và xuyên qua lớp
niêm mạc. Kích thước nhỏ giúp chúng kéo dài thời gian lưu giữ trong bộ máy tiêu
hóa. Những công trình mới nhất cũng chỉ ra toàn bộ những hạt nano chitosan có thể
được hấp thu vào tế bào người [6].

Β-lactoglobulin (βlg), một loại protein chính trong sữa của động vật nhai lại,
đã được dùng nhiều trong thực phẩm do có giá trị dinh dưỡng. Khả năng tạo gel,
nhũ tương cho phép chúng trở thành nguyên liệu lý tưởng để bao giữ các hợp chất
có hoạt tính sinh học. Nó còn có khả năng kháng lại sự phân rã do pepsin có trong
dạ dày [6].

Lingyun Chen (2005) điều chế những hạt nano core-shell

chitosan/β-lactoglubulin làm chất mang dưỡng chất. Những hạt nano chitosan được
phủ lớp protein βlg này có khả năng bảo vệ những chất dinh dưỡng chống lại acid
và pepsin trong dạ dày. Khi tiến vào đường ruột, lớp phủ βlg bị phân rã bởi
 29 Tổng quan tài liệu

pancreatin, còn hạt nhân chitosan bám vào trong thành ruột, tạo thuận lợi cho sự
hấp thu dưỡng chất [6].

Như vậy hạt nano chitosan phủ βlg có hai tác dụng: lớp vỏ bảo vệ dưỡng
chất trong dạ dày còn hạt nhân cải thiện thời gian lưu giữ dưỡng chất trong thành
ruột, đồng thời điều khiển tốc độ phóng thích chúng.

Protein thực phẩm đã được điều chế thành nhiều loại chất nền ở dạng gel, hạt
micro, hạt nano đáp ứng yêu cầu cho những ứng dụng trong thực phẩm chức năng.
Khả năng kiểm soát kích cỡ hạt protein quyết định tốc độ phóng thích dưỡng chất
và lượng hấp thu vào cơ thể. Ở dạng gel và hạt micro, những dưỡng chất được
phóng thích khỏi chất nền để hấp thu vào thành ruột. Trong khi đó, hạt nano cải
thiện khả năng hấp thu dưỡng chất bằng cách kéo dài thời gian lưu giữ trong thành
ruột hoặc hấp thu trực tiếp bởi biểu mô ruột [5].

Hình 1.7. Hình minh họa những cơ chế hấp thu dưỡng chất
 30 Tổng quan tài liệu

1.4.5. Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu.
Theo những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trường
acid là do sự proton hóa nhóm -NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamine. Chitosan
mang điện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ
màng bằng cách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế
sự truyền dưỡng chất vào trong tế bào [24].

Hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan
thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan. L. Qi
(2004) nghiên cứu chế tạo nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn. Hạt nano
chitosan được chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong tripolyphosphate (TPP),
kích thước hạt 40nm [24]. Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano
chitosan trên 4 loại vi khuẩn E. coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus
cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan. Nồng độ ức chế
tối thiểu (MIC) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32μg/ml so với chitosan là 8-16μg/ml
và kháng sinh doxycyline là 1/4-4μg/ml.

Bảng 1.2. Chỉ số MIC (μg/ml ) và MBC (μg/ml) của chitosan, nano chitosan
(CNP), nano chitosan nhốt Cu (CNP-Cu) và doxycycline.

Chitosan CNP CNP-Cu Doxycycline

Vi khuẩn
MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC
E. coli K88 8 64 1/16 1 1/32 1 1 4
E. coli ATCC
8 64 1/32 2 1/32 1 2 16
25922
S. choleraesuis
16 32 1/16 2 1/32 1 4 32
ATCC 50020
S. typhimurium
16 64 1/8 4 1/16 2 2 32
ATCC 50013
S. aureus ATCC
8 32 1/8 4 1/16 2 1/4 8
2593
 31 Tổng quan tài liệu

Hình 1.8. Ảnh hiển vi nguyên tử lực (AFM) của tế bào S. choleraesuis sau khi xử
lý với nano chitosan theo thời gian. Chưa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1 giờ
(C), xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F).

Hình thái của vi khuẩn S. choleraesuis xử lý với nano chitosan được chụp
bằng AFM (hình 1.8). Khi xử lý vi khuẩn với lượng hạt nano chitosan là 64μg/ml
trong 30 phút, những tế bào này bị bao quanh bởi hạt nano. Khi xử lý được 60 phút,
tế bào từ dạng hình cầu bị thoái biến thành dạng đặc bất thường. Khi xử lý lâu hơn,
những tế bào này bị phá vỡ làm thoát những thành phần bên trong, tróc màng và
thủng. Những tế bào S. choleraesuis vỡ thành mảnh sau khi xử lý được 3 giờ [24].

Wen-Li Du (2009) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của những hạt
nano chitosan tripolyphosphate mang nhiều kim loại khác nhau như Ag+, Cu2+,
Zn2+, Mn2+ và Fe2+. Những vi khuẩn được chọn để thử nghiệm là Escherichia coli
25922, Salmonella choleraesuis ATCC 50020 và Staphylococcus aureus 25923.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được tiến
hành trong phòng thí nghiệm [9]. Kết quả được nêu trong bảng 1.3.
 32 Tổng quan tài liệu

Bảng 1.3. Giá trị MIC và MBC ức chế E. coli, S. choleraesuis và S. aureus
(µg/ml)

E. coli S. choleraesuis S. aureus

Mẫu
MIC MBC MIC MBC MIC MBC

Nano chitosan 117 187 117 187 234 281

Nano chitosan
3 6 3 6 6 12
mang Ag+

Nano chitosan
9 12 9 12 21 24
mang Cu2+

Nano chitosan
18 24 18 24 36 48
mang Zn2+

Nano chitosan
73 97 73 97 85 97
mang Mn2+

Nano chitosan
121 195 121 195 146 195
mang Fe2+

Ag+ 4 8 4 8 8 16

Cu2+ 256 512 256 512 448 512

Zn2+ 768 1024 768 1024 768 1024

Mn2+ 1472 1536 1472 1536 1600 1664

Fe2+ 1728 1856 1728 1856 1792 1856

Chlortetracycline 1 2 1 2 2 4

Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan đặc biệt tăng khi nhốt Cu2+ và
Zn2+.