PCR, abbreviation of Polymerase chain reaction, is a standard laboratory method applied in molecular

biology for the amplification of specific segments of double-stranded DNA. PCR is based on the
mechanisms of DNA replication, though it’s performed in vitro.

First, the double-stranded DNA, the template, is separated by heat. Next, a DNA polymerase synthesizes
a new daughter strand on each single strand in one direction. By repeating these reaction continuously,
a defined segment of DNA, the target, is amplified exponentially.

At the start of the first cycle, the reaction mixture contains:

double-stranded template DNA
four different types of nucleotides
dATP (deoxyadenosine triphosphate)
dGTP (deoxyguanosine triphosphate)
dCTP (deoxycytidine triphosphate)
dTTP (deoxythymidine triphosphate)
special, heat-stable DNA polymerase which still functions after heating to high temps to denature the DNA. Such
thermostable polymerases originate from thermophilic bacteria, for example, Taq polymerase from the
microorganism Thermus aquaticus.
2 different primers. These are short sequences of nucleotides that serve as sequence-specific starting points for
DNA synthesis. DNA polymerases bind to the primers, using them to attach new nucleotides to form a new DNA
strand. Each primer facilitates the amplification of the bound DNA in one direction , restricting the strands’ length to
the desired target on one side.

Step 1: The temp is increased to approx. 90-95C to denature the DNA and separate the strands.
Step 2: The temp is decreased to 50-60C for the primers to attach to the complementary DNA
sequences. This process is called annealing.
Step 3: During the elongation step, temp is increased again to around 70C, the optimal temp for DNA
polymerase activity. The enzyme attaches nucleotides to the primers’ 3’ end, extending the strand in this
direction. Each attached nucleotide thereby serves as the attachment point for the next complementary
nucleotide. In the first amplification cycle, two long DNA strands are obtained, which exceed the desired
target on one side. The DNA fragment to be amplified is now present in two double-strands and,
therefore, duplicated.
After the second cycle, the DNA present in the reaction mixture doubles once more. In each cycle, by
undergoing the steps of denaturation, annealing and elongation, the number of DNA doubles.
With each subsequent PCR cycle, the number of DNA molecules of desired length increases rapidly.
Correspondingly, the amount of variable-length segments increases comparably slower and becomes
negligible. After around 30 cycles, the target DNA sequence determined by the choice of primers is now
amplified by a factor of 10 to the power of 6 to 10 to the power of 10. This factor depends on the
amplification efficiency.

The amplified DNA can now be analyzed. The DNA is, therefore, usually visualized using gel
electrophoresis. An example of the application of PCR is the detection of pathogen DNA. The methods’
high specificity even enables microorganisms to be detected that are difficult or impossible to cultivate.
Alternatively, the DNA can be further used and transferred, for example, into a bacterial genome. This
genetic engineering method is used to produce therapeutic proteins like recombinant human insulin.
So with PCR you can specifically look at specific sequences of DNA you’re interested in. Maybe you do
PCR to amplify viral DNA genes to see if they’re present or not. You add primers which are probes to
what you want to amplify and the device thermocycler does PCR for you and makes copies of that
specific viral gene. Then you run it in gel electrophoresis and if you see the band, …..
PCR, Abkürzung von Polymerase-Kettenreaktion, wird eingesetzt, um einen bestimmten kurzen Teil eines DNA-Strangs
zu vervielfältigen. Die PCR findet Anwendung in der Forschung aber auch beim Vaterschaftstest oder bei der Erstellung
genetischen Fingerabdrucks bei Verbrechen. Für die PCR benötigt man folgende Komponenten:
Das zu untersuchende doppelsträngige DNA-Stück dessen Sequenz, also die Abfolge der Basen uns bekannt ist.
Außerdem benötigen sog. Primer. Das sind kurze einzelsträngige Sequenzen mit einer definierten Basenreihenfolge. Sie
dienen als Startüunkt und stellen die äußeren Grenzen der DNA-Verdopplung dar.
Weiterhin brauchen wir sog. Nukleotide, die jeweils aus einer der vier Basen Adenin, Cytosin, Thymin oder Guanin einen
Zucker und einem Phosphat bestehen.
Für den Vervielfältigungsprozess selbst brauchen wir auch das Enzym Polymerase. Dieses Enzym kann aus einzelnen
Nukleotiden lange DNA-Ketten knüpfen.
Nun können wir mit der DNA-Vervielfältigung beginnen. Zunächst wird die Temperatur auf 95 Grad Celsius erhöht.
Dadurch werden die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen aufgelöst und es entstehen zwei
Einzelstrenge, die nun für die bereits genannten Komponenten der PCR zugänglich sind. Nach Abkühlung auf ca. 60
Grad Celsius lagern sich die Primer an die bekannten Start und Endsequenzen der beiden Einzelstrenge an. Die Basen
der Primer können sich nur an jeweils komplementären Basen anlagern. Adenin an Thymin und Cytosin an Guanin. Die
Lösung wird wieder erhitzt. Die Polymerase beginnt vom Primer aus mit der Anlagerung passender Nukleotide. Das
heißt, sie müssen zum vorhandenen DNA-Strang komplementär sein. Hitzestabile Polymerase wie die oft verwendete
Taq-Polymerase arbeiten am besten bei Temperaturen um die 70 Grad Celsius und verknüpfen bis zu 1000 Basen pro
Minute. Abhängig von der DNA-Stranglänge dauert es also nur wenige Minuten bis aus einer DNAzwei geworden sind.
Natürlich braucht man viel mehr Kopien. Deshalb wird der ganze Prozess mehrmals hintereinander wiederholt. Es wird
erhitzt, die Doppelstränge schmelzen auf, Primer lagern sich an und die Polymerase fügt die richtigen Basen ein.
Die PCR läuft meist in 30 bis 50 Zyklen ab wodurch mehrere Millionen Kopien eines DNA-Stangs erzeugt werden. Die
Fachbegriffe für die verschiedenen Zyklen sind: Denaturierung, Hybridisierung un Polymerisation.

Engineered helicase replaces thermocycler in DNA amplification while retaining desired PCR characteristics.
 This is how proteins run in a
polyacrylamide gel. SDS-PAGE is the first step of western blot, the proteins are reduced and negatively charged, so they
run in a measure proportional to their molecular weight. The molecular weight marker is a mix of known proteins used to
determine the weight of the protein of interest. Once the run is finished, the proteins are transferred into a nitrocellulose
membrane.

The function of Taq DNA polymerase in PCR is to amplify or synthesize DNA or gene of
interest for various downstream applications.