INTEGRANTES:

• VELASCO ARGUELLO RENE ALEXANDER

• VELIZ ARIAS SAMUEL ANTONIO
• ZAMBRANO AVEIGA JOSSELYN GISSELLA
• ZAMBRANO MORAN PEDRO JOSE
• ZAMBRANO PEÑARRIETA DIANA CAROLINA
• ZUÑIGA PINTO JONATHAN JAVIER
•

INGENIERO:
CANCHIGNIA MARTINEZ HAYRON FABRICIO

MÓDULO:
IV AGRONOMIA “A”

FECHA DE ENTREGA:
18 DE FEBRERO DEL 2024

TEMA:
Técnica De PCR-Q PCR En Tiempo Real

QUEVEDO-LOS RÍOS- ECUADOR

 TEMA EN INGLÉS:
TaqMan qPCR for quantification of clonostachys rosea used as a biological control
agent against Fusarium graminearum
TEMA EN ESPAÑOL:
TaqMan qPCR para la cuantificación de Clonostachys rosea utilizado como agente
de control biológico contra Fusarium graminearum
ENLACE ELECTRÓNICO: Artículo
RESUMEN INGLÉS: Clonostachys rosea is a biological control agent against
Fusarium graminearum in small grain cereals and maize. Infections with F.
graminearum do not only reduce the yield but, due to the production of mycotoxins,
also affect the entire value chain of food and feed. In addition, production of other
secondary metabolites such as hydrophobins, also known as gushing inducers, may
cause quality challenges for the malting and brewing industry.
Sustainable disease control strategies using C. rosea are treatment of infected
residues of the previous crop, direct treatment of the actual cereal crop or post-
harvest treatment during malting processes. Follow-up of growth and survival of
biocontrol organisms during these different stages is of crucial importance. In the
current study, we developed a quantitative real-time PCR detection method that
amends the currently available culture-dependent techniques by using TaqMan
chemistry with a highly specific primer and probe set, targeting the actin gene. We
established a sensitive assay that detects the biological control agent down to 100
genome copies per reaction, with PCR efficiencies between 90 and 100%.
The specificity of the assay was confirmed against a panel of 30 fungal and 3
bacterial species including 12 members of the Fusarium head blight complex and
DNA of barley, maize and wheat. The DNA of C. rosea was detected in Fusarium-
infected maize crop residues that were either treated in the laboratory or in the field
with C. rosea and followed its DNA throughout the barley malting process to estimate
its growth during grain germination. We used a standardized DNA extraction protocol
and showed that C. rosea can be quantified in different sample matrices. This
method will enable the monitoring of C. rosea during experiments studying the
biological control of F. graminearum on cereal crop residues and on cereal grains
and will thus contribute to the development of a new disease control strategy.
RESUMEN ESPAÑOL: Clonostachys rosea es un agente de control biológico contra
Fusarium graminearum en cereales de grano pequeño y maíz. Las infecciones por
F. graminearum no solo reducen el rendimiento, sino que, debido a la producción de
micotoxinas, también afectan a toda la cadena de valor de alimentos y piensos.
Además, la producción de otros metabolitos secundarios como las hidrofobinas,
también conocidas como inductores de chorro, puede causar problemas de calidad
para la industria de la maltería y la elaboración de cerveza.
Estrategias sostenibles de control de enfermedades utilizando C. roseason el
tratamiento de residuos infectados de la cosecha anterior, el tratamiento directo de
la cosecha de cereales real o el tratamiento poscosecha durante los procesos de
malteado. El seguimiento del crecimiento y la supervivencia de los organismos de
control biológico durante estas diferentes etapas es de crucial importancia. En el
estudio actual, desarrollamos un método cuantitativo de detección de PCR en
tiempo real que modifica las técnicas dependientes de cultivo actualmente
disponibles mediante el uso de la química TaqMan con un conjunto de cebadores y
sondas altamente específicos, dirigidos al gen de la actina. Establecimos un ensayo
sensible que detecta el agente de control biológico hasta 100 copias del genoma
por reacción, con eficiencias de PCR entre 90 y 100%.
La especificidad del ensayo se confirmó frente a un panel de 30 especies de hongos
y 3 de bacterias, incluidos 12 miembros del complejo de tizón de la cabeza de
Fusarium y ADN de cebada, maíz y trigo.C. rosea se detectó en residuos de cultivos
de maíz infectados con Fusarium que fueron tratados en el laboratorio o en el campo
con C. rosea y siguieron su ADN durante todo el proceso de malteado de cebada
para estimar su crecimiento durante la germinación del grano. Utilizamos un
protocolo de extracción de ADN estandarizado y demostramos que C. rosea se
puede cuantificar en diferentes matrices de muestra. Este método permitirá el
seguimiento de C. rosea durante los experimentos que estudian el control biológico
de F. graminearum en residuos de cultivos de cereales y en granos de cereales y
contribuirá así al desarrollo de una nueva estrategia de control de enfermedades.
Clonostachys rosea es tambien conocido como Gliocladium roseum, coloniza
plantas vivas. digiere el material en el suelo como un saprófito y también es
conocido como un parásito de otros hongos y nematodos. Aunque este también se
comercializa como un fungicida natural o bioestimulante por su capacidad para
antagonizar los patógenos, inducir la resistencia de la planta y promover vigor bajo
diferentes nombres comerciales utilizando conidios viables del hongo como el
ingrediente activo.
El objetivo de este artículo fue crear nuevos cabdores en un ensayo de qPCR para
la detección, cuantificación y seguimiento de ambas formas de C. rosea utilizadas
como BCA contra F. graminearum en residuos de cultivos y en cebada maltera. En
el primer cuadro encontramos los aislamientos Fungicos y bacterianos con sus
respectivos orígenes ya que se analizaron 46 aislados de hongos diferentes. Estos
se aislaron en agar de papa dextrosa y se tuvieron incubados por 4 dias a una
temperatura de 25° c, además de esto también se aplicaron 8 aislamientos de
Clonostachys rosea. Las especies incluidas fueron Pantoea agglomerans endofítica
de grano de cebada, así como BCA Lactobacillus plantarum y Leuconostoc citreum
ya que Pantoea agglomerans se cultivó en agar PCA y las bacterias del ácido láctico
se cultivaron en agar MRS.
Utilizando el el FastDNA Spin Kit for Soil se aislo muestras de plantas y microbios.
Se utilizo un homogeneizador ya que este es apto para la homogeneización de
distintos tipos de materiales, tales como tejidos, plantas, alimentos, suelo, y muchos
otros. En este caso con este elemento se realizó la lisis celular durante 2 x 60 sa 6
m / s. Tanto el hongo como las bacterias se cultivaron en sus respectivos medios de
crecimiento con una capa esterilizada de celofán o papel de filtro, esto se iso para
obtener material celular fresco para el aislamiento de cultivos puros. En el segundo
cuadro nos encontramos con una tabla que genera secuencias de cebadores para
la debida amplificación de Clonostachys rosea con TaqMan qPCR. Aquí se realizó
todas las reacciones de de qPCR en un instrumento de pcr en tiempo real utilizando
el software correspondiente ya que utilizando Lightcycler 480 Probes Master
TaqMan chemistry se evaluaron los cebadores con la sonda de hidrólisis.
En la inhibición de la PCR se aislaron 3 tipos de tejidos vegetales que son
1. El tallo del maíz
2. Granos de cebada
3. Granos de trigo
Estos fueron recolectados de plantas maduras ya que El ADN de la planta se aisló
de 100 mg de material finamente molido y con esto se prepararon diferentes
diluciones, se realizó con cantidades crecientes de ADN vegetal, lo que dio como
resultado entradas totales de 0 (control), 1, 10, 25, 50 y 100 ng de ADN vegetal por
reacción de PCR.
Las muestras de tallo se tomaron de un sembrio de maíz la cual se obtuvo dos
partes una para ser analizada en el laboratorio poniéndola en cajas Petri sobre
vermiculita saturada y esterilizada a 18 ± 2 ° C y 40 ± 2% de humedad relativa en
un NUV de 12/12 h y otra para distribuirlos entre hileras de trigo en suelo desnudo.
Ya que tanto en laboratorio como en el campo se isieron el diseño de bloques al
azar Para cuantificar el número de copias de C. rosea por ng de ADN con qPCR, se
prepararon extractos de los residuos tratados 10 semanas después de la
inoculación. El ADN se extrajo de una muestra de polvo homogenizado.
En los granos de la cebada El objetivo fue verificar si el BCA, asociado a la cebada
y al trigo, no tiene ningún impacto negativo en las propiedades de germinación del
grano y en la calidad final de la malta. Ya que no se cumplieron la distribución normal
de residuos y homogenidad de varianza por lo que se separaron en los diferentes
lotes de cebada y los datos se analizaron mediante ANOVA en rangos mediante la
prueba de Kruskal-Wallis. Y dio un nivel de significancia de 0.05 Con un tamaño de
150pb la amplificación dio un solo producto. En total, se analizaron 96 muestras de
ADN diferentes (de 48 lotes de tallos de maíz y 48 lotes de granos de cebada
malteada) en dos mediciones repetidas. Entre todas, el 60% de las muestras
mostraron una señal positiva por encima del límite de detección dentro de un rango
de amplificación entre 22 y 35 ciclos. Este estudio reveló un enfoque de qPCR para
la detección cuantitativa de diferentes cepas de C. rosea , probadas como
antagonistas contra F. graminearum en residuos de cultivos.

Link del artículo:

https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2019.01627/full