11.3.

Полімеразна ланцюгова реакція у реальному часі

(Real-Time PCR)

Реальний час – це той час, який відбувається з нами зараз, у даний

момент. ПЛР у реальному часі – це метод, який дозволяє не чекати на
закінчення температурних циклів і аналіз наявності ампліконів методом
електрофорезу, а напроти, робить можливим відстеження результатів
ампліфікації вже під час температурних циклів. Відповідно, методи ПЛР
можна розділити на класичні, які потребують стадії електрофорезу для
візуалізації результатів реакції, і метод ПЛР у реальному часі.

В англомовній літературі замість «Real-Time PCR» частіше можна

зустріти термін «qPCR» – «quantative PCR». Це пояснюється тим, що на
відміну від класичної ПЛР, яка дозволяє оцінити результати тільки якісно
(«так/ні»), ПЛР у реальному часі за наявності стандартних зразків ДНК
відомих концентрацій дозволяє виявити первинну кількість ДНК у зразку,
тобто, – провести кількісний аналіз результатів реакції. Усі ці можливості
закладені у програмному забезпеченні до ампліфікаторів Real-Time.

Для того, щоб зафіксувати утворення амплікона, в Реал-Тайм ПЛР

використовують флуоресценцію сигнальних молекул. Відповідно,
ампліфікатор за своєю побудовою відрізняється від такого, що
застосовується у класичній ПЛР. Головною відмінністю є наявність
оптичного блоку, вмонтованого у кришку приладу (рис. 27).
 Рис. 27. Ампліфікатор для ПЛР у реальному часі (https://www.bio-
rad.com/en-ua/applications-technologies/introduction-qpcr-instrumentation?
ID=LUSO5YMNI)

Сигнали від світіння реакційної суміші фіксуються датчиками

оптичного блоку і виводяться на екран комп’ютера з відповідним
програмним забезпеченням у вигляді графіків одиниць флуоресценції (рис.
28).

Рис. 28. Криві зростання флуоресценції реакційної суміші вказують на

зростання кількості ампліконів, тобто – на наявність певного гена у зразку
(вертикальна вісь – RFU – relative fluorescence units, відносні одиниці
флуоресценції (англ.), горизонтальна – кількість циклів ПЛР).

Прилад, а також реакційні суміші, є більш дорогими, ніж обладнання і

реагенти для класичної ПЛР, але безперечними перевагами ПЛР у реальному
часі є більша чутливість, менша вірогідність контамінації ДНК через
відсутність стадії електрофорезу, і необхідність меншої площі лабораторій –
знову ж таки, завдяки відсутності електрофоретичного аналізу результатів.
Саме тому цей метод найчастіше застосовується у діагностичній практиці.

Флуоресцентні сигнали, що вказують на зростання кількості

ампліконів, тобто наявність певного гена у суміші, отримують двома різними
способами: шляхом додавання у реакційну суміш інтеркалюючих (тих, що
вбудовуються між двома ланцюгами ДНК) фарбників, наприклад, фарбника
SYBR® Green, або шляхом введення у реакційну суміш додаткового
компоненту – зонду, комплементарного до середини необхідного гена, який
несе на собі флуоресцентні мітки (технологія TaqMan®).

11.4. ПЛР у реальному часі з використанням SYBR® Green

Флуоресцентний фарбник SYBR® Green світиться зеленим кольором

при опроміненні його синім світлом. Його назва є комерційною і не
відображає складної структури даної речовини. SYBR® Green вносять у
реакційну суміш для ПЛР окремо, або він вже є присутнім у комерційних
наборах з відповідним маркуванням.

Молекули SYBR® Green вбудовуються між двома ланцюгами ДНК, при

цьому світіння щільно вбудованих молекул різко зростає у порівнянні зі
світінням поодиноких молекул, що знаходяться у вільному стані у реакційній
суміші (рис. 29).
 Рис. 29. Зростання флуоресценції за вбудовування молекул SYBR®
Green між двома ланцюгами ДНК (http://dyes.gene-quantification.info/).

Відповідно, чим більша кількість дволанцюгових ДНК присутня у

реакційній суміші, тим яскравіше суміш буде світитися. Збільшення кількості
ампліконів буде фіксуватися приладом як зростання флуоресценції, і на
графіку ми побачимо відповідну криву, яка буде свідчити про позитивний
результат ПЛР.

При введені програми температурних циклів ПЛР у програмне

забезпечення ампліфікатора крок зчитування флуоресценції в даному
випадку потрібно виставляти після стадії елонгації, тобто тоді – коли
кількість дволанцюгових ДНК у суміші є максимальною.
 Слід також приймати до уваги той факт, що у більшості випадків ПЛР
у реальному часі етапи відпалу та елонгації співпадають – їх проводять при
однаковій температурі (температурі відпалу праймерів), що стає можливим
через особливості ДНК-полімераз та високу чутливість реакції. У таких
випадках температурних режимів основних циклів усього два – денатурації
ДНК (94-95ºС) та відпалу-елонгації (частіше за все 60-68ºС). Можуть бути
також присутніми додаткові температурні полиці для активації ДНК-
полімерази, наприклад – 1 хв при 80ºС. Усе це залежить від тест-набору і
починаючи роботу з новим тест-набором, потрібно ретельно ознайомитися з
програмою ампліфікації, наданою в інструкції.

Використання фарбника SYBR® Green є універсальним, простим та

відносно недорогим, але в нього є суттєвий недолік: якщо під час реакції
утворюються непередбачувані та небажані неспецифічні амплікони,
зростання їх кількості буде враховуватися приладом так само, як і зростання
специфічних ампліконів. Саме тому більш надійними є методи вимірювання
флуоресценції реакційної суміші, що передбачають введення додаткового
зонду.

11.5. ПЛР у реальному часі, заснована на зондах, мічених

флуоресцентними фарбниками

У реакційну суміш, крім праймерів, комплементарних межам

специфічної ділянки ДНК, яку ми шукаємо та копіюємо у ПЛР, вводиться
додатковий компонент, також комплементарний цій ділянці, але підібраний
до її середини. І праймери, і зонди постачаються у готових реакційних
сумішах для проведення ПЛР у реальному часі. Зонд є міченим молекулами
флуорофора та гасника з використанням технології FRET (fluorescence
resonance energy transfer (англ.)) – перенесення енергії резонансної
флуоресценції між двома молекулами. Принцип полягає в тому, що дві
молекули, розташовані близько одна до одної, підібрано таким чином, що
одна з них (флуорофор або так званий репортер, reporter dye (англ.)) увесь час
випромінює світло, а інша – сусідня молекула (гасник або quencher (англ.)),
відразу ж його поглинає через те, що його спектр поглинання співпадає зі
спектром емісії флуорофора. Обидві ці молекули приєднані за допомогою
хімічних зв’язків до ДНК-зонду, комплементарного тому гену або його
ділянці, які ми шукаємо у ПЛР.

У результаті цілісний зонд не світиться, через те, що усе світло

флуорофора відразу ж поглинається гасником. Але при руйнуванні зонду або
ж віддаленні його компонентів у просторі флуорофор починає світитися
через те, що гасник тепер знаходиться від нього на відстані, яка не дозволяє
тому поглинати світіння.

Використання даної технології відбувається трьома способами:

подвійне мічення зонду, молекулярні «сигнальні вогні» та «хвіст скорпіона».

11.5.1. Подвійне мічення зонду

Зонд з 5,-кінця є міченим молекулою флуорофора, а з 3 ,-кінця –

молекулою гасника. На стадії відпалу зонд, так само як і праймери,
приєднується до комплементарної ділянки. У цілісному стані зонд не
світиться. Коли ДНК-полімераза рухається по ДНК, будуючи
комплементарний ланцюг, вона за рахунок своєї екзонуклеазної активності
руйнує зонд, що заважає її руху. У результаті гасник і флуорофор
виявляються відокремленими у просторі, і флуорофор починає світитися
(рис. 30). Спалахи флуоресценції зчитуються датчиками оптичного блоку
ампліфікатора.

Отже, один сигнал флуоресценції означає одну «пробіжку» («run»

англ.) ДНК-полімерази, тобто – відповідний синтез одного амплікону. З
наростанням кількості ампліконів інтенсивність сигналу зростає, що
відображається у підйомі кривих флуоресценції на графіках. Кількість
сигналів флуоресценції є пропорційним кількості ампліконів у суміші.

Рис. 30. Побудова зонду, міченого флуорофором і гасником, та

принцип його функціонування у реакційній суміші:
(https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/dual-labeled-
probes-for-digital-pcr.html?gclid=CjwKCAjwiaX8BRBZEiwAQQxGx7-
C7AbDWuOxB9tw94Skg0yn5160OndLQ9H9Gr13aPJlbqL61iqfVBoCD5UQAvD
_BwE).

Наразі у доступних комерційних тест-наборах даний принцип

застосовується найчастіше.

11.5.2. Молекулярні «сигнальні вогні» (Molecular Beacons)

Зонд типу «сигнального вогню» побудовано таким чином, щоб його

кінці у вільному стані утворювали «шпильку». За рахунок того, що кінці
«шпильки» розташовуються поряд, світіння флуорофора повністю
поглинається молекулою гасника (рис. 31).
 Рис. 31. Побудова зонду типу «сигнального вогню» та принцип його
функціонування: R – reporter, флуорофор; Q – quencher, гасник (Farrell R.E. et
al., 2017 https://www.sciencedirect.com/book/9780128046784/rna-
methodologies).

Під час денатурації молекула ДНК зонду розплітається так само, як і

ДНК мішені, і в такому стані приєднується до середини ділянки, яку ми
шукаємо у ПЛР. У прикріпленому до комплементарної ділянки стані зонд
розпрямляється, і гасник виявляється відокремленим у просторі від
флуорофора. Молекула флуорофора починає світитися (рис. 32).

У даному випадку считування сигналів має відбуватися відразу ж після

відпалу, перед роботою ДНК-полімерази. ДНК-полімераза за даної технології
підібрана таким чином, що вона не має екзонуклеазної активності: фермент
не руйнує такий зонд, він його витискає, і витиснутий зонд знову збирається
у «шпильку» і може бути використаним у наступному циклі ПЛР (рис. 33).
 Рис. 33. Гібридизація зонду типу «сигнальних вогнів» та його
відокремлення від ДНК-мішені: D – флуорофор, fluorescence dye; Q –
quencher, гасник (https://www.idtdna.com/pages/products/qpcr-and-pcr/custom-
probes/molecular-beacons).

Тест-системи, засновані на даній технології, застосовуються переважно

закордоном.

11.5.3. «Хвіст скорпіона»

Зонд, створений за типом «хвоста скорпіона», представляє собою

«шпильку», приєднану до праймера. Між праймером та зондом є спеціальна
ділянка – блокер, яка не розпізнається ДНК-полімеразою, отже, блокує
діяльність ферменту у відношенні до зонду (рис. 34).

На першому циклі ПЛР праймер разом із зондом приєднується до

комплементарної ділянки. Зонд при цьому не світиться, тому що він є
цілісним і нероз’єднаним у просторі. ДНК-полімераза, починаючи з
праймера, будує комплементарну копію молекули ДНК.
 Рис. 34. Побудова зонду типу «хвіст скорпіону» та принцип його
функціонування (https://www.sigmaaldrich.com/technical-
documents/articles/biology/scorpions-probes.html).

Упродовж наступного циклу на етапі денатурації «шпилька»

розплітається, розгортається і під час наступного зменшення температури
відпалюється з копією ДНК, ампліфікованою у попередньому циклі (рис. 35).

Рис. 35. Гібридизація зонду типу «хвіст скорпіона»: R – reporter,

флуорофор; Q – quencher, гасник (https://www.bio-rad.com/en-ua/applications-
technologies/introduction-pcr-primer-probe-chemistries?ID=LUSOJW3Q3).
 Виглядає це так, начебто зонд згинається наперед, до праймера, як
хвіст скорпіона. Через це дана технологія і отримала свою назву.
Відокремлений у просторі від гасника, флуорофор починає світитися.

11.5.4. Флуорофори і гасники ПЛР у реальному часі

Найбільш уживаними у тест-наборах є такі фарбники як 5-FAM, 6-FAM

(5(6)-карбоксифлуоресцеїн) і HEX (гексафлуоресцеїн) (рис. 36).

Рис. 36. Формули FAM і HEX.

Флуорофор FAM при опроміненні блакитним світлом світиться темно-

зеленим. HEX при опроміненні зеленим світлом світиться жовтувато-
зеленим.

При налаштуванні запуску ампліфікації потрібно обов’язково вводити

у відповідні віконця протоколу програми назви фарбників, які
використовується у тест-наборі. Тоді з оптичного блоку ампліфікатору
будуть спрямовуватися промені певної довжини, необхідні для збудження
електронів молекули певного флуорофору і його наступного світіння (рис.
37).

Рис. 37. Побудова оптичного блоку ампліфікатору: LED-array –

світлодіодні лампочки, розташовані над кожною лункою; excitation beam -
промені певної довжини від світлодіодних лампочок, призначені для
збудження електронів флуорофора; Fresnel lens – лінза Фрезнеля, яка
спрямовує проміні чітко в середину та з середини мікропробірки з
реакційною сумішшю; emitted light – промені від флуорофорів, які
вловлюються та детектуються високочутливими фотодіодами
(https://www.bio-rad.com/en-ua/product/miniopticon-real-time-pcr-system?
ID=2440b855-10d5-47f3-bee1-4a6f7239b94e).

Молекули гасників бувають двох типів: ті, що поглинають світло від

флуорофора і випускають отриману енергію у вигляді слабкого світіння (5 ,-
TAMRA – карбокситетраметилродамін, світиться слабким жовтим світінням),
і ті, що випускають отриману від флуорофора енергію у вигляді тепла, і при
цьому не світяться (гасники типу «чорних дір», Black Hole Quenchers, BHQ)
(рис. 38).
 TAMRA

Рис. 38. Формули деяких гасників

(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5-Tamra;
https://www.atdbio.com/content/35/FRET-fluorescence-quenchers).

Підбір флуорофора і гасника має відбуватися дуже ретельно для

максимального співпадіння їх спектрів емісії та поглинання.