BÀI THỰC TẬP 3: CHUẨN ĐOÁN XÉT NGHIỆM VI KHUẨN, THỬ NGHIỆM

KHÁNG KHUẨN

1. CHUẨN ĐOÁN XÉT NGHIỆM VI KHUẨN DỰA VÀO MÔI TRƯỜNG CHỌN
LỌC
1.1 Nguyên tắc

Môi trường chọn lọc là môi trường ưu thế cho sự phát triển một loài hoặc một nhóm loài
vi sinh vật xác định, đồng thời ức chế sự phát triển vi sinh vật khác. Môi trường chọn lọc
được sử dụng cho mục đích phân lập và định danh vi sinh vật.

Môi trường chọn lọc có thể được thực hiện theo nhiều cách. Ví dụ, các sinh vật có thể sử
dụng một loại đường nhất định dễ dàng được sàng lọc khi đường đó là nguồn cacbon duy
nhất trong môi trường. Mặt khác, ức chế chọn lọc một số loại vi sinh vật bằng cách thêm
thuốc nhuộm, thuốc kháng sinh, muối hoặc chất ức chế cụ thể có ảnh hưởng đến sự trao
đổi chất hoặc hệ thống enzyme của các sinh vật. Như môi trường chứa kali tellurite, natri
azide hoặc thallium acetate (ở nồng độ 0,1 - 0,5 g/L) sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Gram âm. Bổ sung penicillin (5-50 đơn vị/mL) hoặc tinh thể tím (crystal violet, 2 mg/L)
sẽ ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram dương. Do đó agar tellurite được sử dụng để
chọn lọc vi khuẩn Gram dương, và thạch dinh dưỡng bổ sung với penicillin có thể được
sử dụng để lựa chọn cho Gram âm.

1.1.1. Môi trường MSA (Mannitol salt agar)

Là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Staphylococci gây bệnh. Thành phần môi trường
gồm có manitol, chỉ thị phenol red và 7.5% NaCl. Nồng độ NaCl cao ức chế sự phát triển
của hầu hết vi sinh vật, trừ nhóm Staphylococci. Trên môi trường thạch MSA, vi khuẩn
Staphylococcus aureus phát triển với khuẩn lạc màu vàng, là do vi khuẩn S.aureus lên
men mannitol, sản sinh acid làm đổi màu chất chỉ thị. Các nhóm Staphylococcus khác
không có khả năng lên men manitol, nên vẫn giữ màu đỏ hồng của môi trường.

Chỉ thị màu phenol red: thay đổi màu theo pH

+ pH > 7.4 (kiềm): hồng

+ pH = 7 (trung tính): cam

+ pH < 6.8 (acid): vàng

Trong các mẫu lâm sàng, các chủng phân lập dương tính với mannitol gợi ý về
Staphylococcus aureus và cần được xét nghiệm thêm.

Công thức môi trường

Chiết xuất thịt bò 1,0 g

Peptone hoặc polypeptone 10,0 g
NaCl 75,0 g
Manitol 10,0 g
Phenol red 0,025 g
Agar 15,0 g
Nước cất 1.000 mL
Điều chỉnh pH đến 7.4. Đun sôi để hòa tan thạch. Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Để nguội đến 55ºC và đổ vào đĩa petri.
Môi trường MSA cũng có sẵn trên thị trường ở dạng trộn sẵn.

1.1.2. Môi trường thạch EMB (Eosin Methylene Blue Agar)

EMB là môi trường môi trường chọn lọc cho nhóm vi khuẩn đường ruột Gram âm. Môi
trường EMB chứa thuốc nhuộm anilin (Eosin và xanh methylen), ức chế sự phát triển của
vi khuẩn Gram dương. Ngoài ra, môi trường còn chứa lactose dùng để phân biệt giữa các
sinh vật lên men lactose và những vi khuẩn không lên men. Saccharose cũng được bao
gồm trong môi trường vì một số thành viên của nhóm Enterobacteria hoặc coliform lên
men saccharose dễ dàng hơn so với khi lên men lactose.

Môi trường EMB thường được sử dụng để xác nhận sự hiện diện của E. coli trong mẫu
nước.

+ Vi khuẩn lên men lactose và sucrose (E. coli): khuẩn lạc tối màu, có ánh kim loại màu
xanh.

+ Vi khuẩn lên men lactose chậm: khuẩn lạc màu hồng (khuẩn lạc Enterobacter aerogenes
thường nhầy và lớn hơn các khuẩn lạc E. coli).

+ Vi khuẩn không lên men lactose hay sucrose (Salmonella): khuẩn lạc không màu hoặc
màu của môi trường.
Công thức môi trường

Peptone 10,0 g
Lactose 5,0 g
Sucrose 5,0 g
Dipotassium phosphate 2,0 g
Eosin Y 0,4 g
Methylen blue 0,065 g
Agar 13,5 g (có thể thêm 5%)
Nước cất 1.000 mL
Điều chỉnh pH đến 7.2. Đun sôi để hòa tan thạch. Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Để nguội đến 55ºC và đổ vào đĩa petri.
Môi trường EMB cũng có sẵn trên thị trường ở dạng trộn sẵn.

1.1.3. Môi trường MacConkey

Môi trường MacConkey là môi trường chọn lọc và phân biệt cho vi khuẩn Gram âm
(coliform), đặc biệt là các thành viên của họ Enterobacteriaceae và chi Pseudomonas.

Tính chọn lọc: Thuốc nhuộm crytal violet và muối mật (bile salt) ngăn chặn sự phát triển
của vi khuẩn gram dương. Điều này chỉ cho phép các loài gram âm, có màng ngoài tương
đối kháng mật, hình thành khuẩn lạc trên thạch MacConkey.

Tính phân biệt: Vi khuẩn gram âm phát triển trên đĩa MacConkey được phân biệt bởi khả
năng lên men đường sữa của chúng.

+ Vi khuẩn lên men lactose làm giảm pH của môi trường, sự giảm này được phát hiện
bằng màu đỏ trung tính (trở thành màu đỏ nếu pH dưới 6,8). Khi độ pH giảm xuống, màu
đỏ trung tính được vi khuẩn hấp thụ, xuất hiện dưới dạng khuẩn lạc màu hồng tươi đến đỏ
trên thạch: Escherichia coli, Enterobacteria, Klebsiella.

+ Vi khuẩn gram âm phát triển mạnh trên thạch MacConkey nhưng không lên men đường
sữa xuất hiện không màu trên môi trường và thạch xung quanh vi khuẩn tương đối trong
suốt : Salmonella, Proteus, Yersinia, Pseudomonas

Công thức môi trường

Peptone 20,0 g
 Lactose 10,0 g
NaCl 5,0 g
Crytal violet 1,0 mg
Neutral Red 30,0 mg
Bile Salts 1,5 g
Agar 13,5 g
Nước cất 1.000 mL
Điều chỉnh pH đến 7.1. Đun sôi để hòa tan thạch. Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Để nguội đến 55ºC và đổ vào đĩa petri.
Môi trường MacConkey cũng có sẵn trên thị trường ở dạng trộn sẵn.

1.1.4. Môi trường SS (Salmonella-Shigella, SS Agar)

Môi trường SS là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Gram âm. Thành phần môi trường có
chứa muối mật và thuốc nhuộm xanh (brillian green), ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Gram dương. Tương tự như môi trường MacConkey, vi khuẩn có khả năng lên men
lactose sẽ hình thành khuẩn lạc màu hồng, trong khi vi khuẩn không lên men lactose sẽ
cho ra các khuẩn lạc không màu. Ngoài ra, muối sodium thiosulfate và ferric citrate trong
môi trường SS sẽ giúp phân biệt vi khuẩn có khả năng sinh H2S bởi sự hiện diện của màu
đen ở giữa khuẩn lạc.

Công thức môi trường

Cao thịt 5,0 g

Peptone 5,0 g
Lactose 10,0 g
Bile Salts 5,6 g
Sodium citrate 10,0 g
Sodium thiosulfate 8,5 g
Ferric citrate 1,0 g
Brilliant green 0,330 mg
Neutral Red 25,0 mg
Agar 15,0 g
Nước cất 1.000 mL
Điều chỉnh pH đến 6,9. Đun sôi để hòa tan thạch. Khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
 Để nguội đến 55ºC và đổ vào đĩa petri.
Môi trường Salmonella Shigella cũng có sẵn trên thị trường ở dạng trộn sẵn.

1.2. Nội dung thực hành

1.2.1. Vật liệu

Môi trường thạch MSA, thạch EBM, thạch MacConkey, thạch SS

Que cấy, đèn cồn

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhi

1.2.2. Thực hành

- Chuẩn bị đĩa thạch chứa môi trường MSA, Mac Conkey thành 2 phần đều nhau,

- Dùng bút maker, chia đĩa thành 2 phần đều nhau.

- Đĩa thạch MSA: ria vi khuẩn S. aureus và E. coli.

- Đĩa thạch EBM: ria vi khuẩn E. coli và S. Typhi.

- Đĩa thạch MacConkey: ria vi khuẩn E. coli và S. Typhi.

- Đĩa thạch SS: ria vi khuẩn E. coli và S. Typhi.

- Ủ đĩa ở 37°C trong 1 ngày, quan sát khuẩn lạc.

1.2.3. Kết quả

- Môi trường MSA (Mannitol salt agar)

Hình : Staphylococcus aureus (trái) và Escherichia coli (phải) được cấy trong môi trường
MSA sau khi đã ủ 24 giờ.

*Nhận xét:
MSA là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Staphylococcus. Trong môi trường thạch
MSA, vi khuẩn Staphylococcus aureus phát triển với khuẩn lạc màu vàng là do vi khuẩn
S. aureus đã lên men mannitol (một trong những thành phần của môi trường), sản sinh
acid làm đổi màu chất chỉ thị phenol red (một trong những thành phần của môi trường).
Các nhóm Staphylococcus khác không có khả năng lên men manitol nên vẫn giữ màu đỏ
hồng của môi trường.
- Môi trường EMB (Eosin Methylene Blue Agar)

Hình : Escherichia coli (trái) và Salmonella (phải) được cấy trong môi trường EMB sau
khi ủ 24 giờ.

*Nhận xét:

EMB là môi trường chọn lọc cho nhóm vi khuẩn đường ruột Gram âm. Trong môi trường
EMB, vi khuẩn Escherichia coli lên men lactose và sucrose nên cho khuẩn lạc tối màu.
Còn vi khuẩn Salmonella không lên men lactose hay sucrose nên không cho khuẩn lạc
không màu hoặc màu của môi trường.

- Môi trường MacConkey

Hình : Salmonella (trái) và Escherichia coli (phải) được cấy trong môi trường
MacConkey sau khi ủ 24 giờ.

*Nhận xét:
MacConkey là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Gram âm (coliform), đặc biệt là các
thành viên của họ Enterobacteriaceae và chi Pseudomonas. Trong môi trường
MacConkey, vi khuẩn Salmonella không lên men đường lactose nên vẫn giữ màu của môi
trường. Vi khuẩn Escherichia coli lên men đường lactose nên làm giảm pH của môi
trường (màu môi trường trở thành màu hồng), vi khuẩn hấp thụ rồi xuất hiện dưới dạng
khuẩn lạc màu hồng.

- Môi trường SS (Salmonella-Shigella, SS Agar)

2. PHẢN ỨNG SINH HÓA

3. THỬ NGHIỆM KHÁNG KHUẨN (SUSCEPTIBILITY TEST)

3.1. Nguyên tắc