See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/331399497

Doğrulama Aşamasında Kullanılan Kromatografik Yöntemler

Chapter · May 2018

CITATION READS

1 592

4 authors:

Hasan Ertas Rukiye Döğer Aslan

Ege University Ege University
44 PUBLICATIONS 365 CITATIONS 25 PUBLICATIONS 45 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Melike Aydoğdu Fatma Nil Ertaş

Ege University Ege University
15 PUBLICATIONS 46 CITATIONS 71 PUBLICATIONS 956 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Hasan Ertas on 28 May 2020.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 VALİDASYON

Ar. Gör. Melike AYDOĞDUb,

Ar. Gör. Rukiye DÖĞERb,

Doç. Dr. Hasan ERTAŞa

a
Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü, Bornova İzmir
b
Ege Üniversitesi Madde Bağımlılığı, Toksikoloji ve İlaç Bilimleri Enstitüsü , Bornova,
İzmir

melike.gungor@ege.edu.tr, rukiye.doger@ege.edu.tr, hasan.ertas@ege.edu.tr

Dünyada binlerce laboratuvarda her gün milyonlarca test, ölçüm ve deneme

yapılmaktadır. Bu çalışmalar, ticareti desteklemek amacıyla mallara değer biçmek, sağlık
hizmetlerini desteklemek; içme suyu, yiyecek ve yem kalitesini kontrol etmek, bir alaşımın
temel bileşimini analiz ederek uçak yapımında kullanıma uygunluğunu teyit etmek; cezai
soruşturmalarda vücut sıvılarının adli analizi gibi sayısız neden vardır. Toplumun neredeyse
her yönü, analitik bir çalışma ile bir şekilde desteklenir.

Bu ölçümlerin maliyeti yüksektir ve elde edilen sonuçlar nedeniyle büyük zararlar ortaya
çıkabilir. Örneğin, yiyeceklerin tüketim için uygun olmadığını gösteren testler tazminat
talepleriyle sonuçlanabilir, yasaklı maddelerin varlığını doğrulayan testler; kişiler için ceza,
tutukluluk veya hatta bazı ülkelerde infaz ile sonuçlanabilir. Bu gibi nedenlerle, doğru bir
ölçüm yapmak ve sonuçların doğru olduğunu göstermek çok önemlidir.1 Bir analistin
laboratuvarda gerçekleştirdiği faaliyetlerdeki en önemli hedefi; yapmış olduğu analizlerin
geçerli bir yöntemle, doğru ve gerçekçi sonuçlar üretmesi, elde edilen sonuçlardan büyük bir
güven duyması olmalıdır. Bu sonuçların üretilebilmesi için, laboratuvarda ya da analiz yapılan
birimlerde karşılaşılabilen sorunlar, aşamalar ve gerçekleştirilmesi gerekli prosedürler bu
bölümde anlatılmıştır:

1. Yeterlilik/Kalifikasyon

Ürün kalitesine önem veren endüstriler için laboratuvarlar çok önemlidir. Cihaz ve
ekipmanlardaki anlık tutarsızlıklar, istenmeyen sonuçlara neden olabilir.2 Yeterlilik;
nitelendirme ve yeniden nicellendirme kapsamında, etki değerlendirmesi ve risk analizi
esaslarına göre belirlenmelidir. Risk yönetim ilkeleri, yeterliliklerin kapsamı ve aşamaları
dikkate alınarak değerlendirilmelidir.3

Bir cihaz, tasarım ve denetim aşamalarındaki her bir kriteri karşıladıktan sonra piyasada
yer almaktadır. Bu süreç ve kriterler; Tasarım Yeterliliği (design qualification, DQ), Kurulum
Yeterliliği (installation qualification, IQ), Operasyonel Yeterlilik (operational qualification,
OQ), Performans Yeterliliğinin (performance qualification, PQ) protokollerinden
oluşmaktadır. Bu süreçler; üretim proseslerinin önceden belirlenmiş kalite gereksinimlerini
karşılayan ürünleri sürekli üretebilmesi için, kullanılan veya kurulan ekipmanın yüksek
derecede kalite güvencesi sağlayacağını belirleme yollarıdır.2 DQ, IQ, OQ ve PQ
hazırlanması da dâhil olmak üzere yeni araç ve teçhizatlar tüm aşamalarından geçmelidir.3

Şekil 1. Dört önemli yeterliliğin şematik gösterimi

Tasarım Yeterliliği (DQ): Proses, tesis, sistem, ekipman ve yardımcı programların henüz
tasarım aşamasında İyi Üretim Uygulamasının (GMP), kalite ve yasal gereklilikleri, önceden
kullanıcı tarafından belirlenen gereklilikleri sağladığının yazılı olarak ispatlanmasıdır.4

Kurulum Yeterliliği (IQ): DQ aşaması tamamlanmış olan proses, tesis veya servislerin
tasarım edildiği şekilde, özelliklerine uygun olarak monte edildiğinin veya mevcut sisteme
doğru adapte edildiğinin yazılı olarak ispatlandığı validasyon aşamasıdır.4 Kurulum Yeterliliği
(IQ), kalifiye edilecek cihazın veya donanımın yan sistemlerinin ve yardımcı sistemlerin
imalatçının teknik özelliklerine veya kurulum kontrol listesine göre teslim edildiğini,
kurulduğunu ve yapılandırıldığını doğrular. Başarılı bir yeterlilik/kalifikasyon için kurulum
aşağıdaki gibi üreticinin gereksinimlerini karşılamalıdır2:

 Kurulum yeri ve taban alanı

 Güç, gaz kaynağı ve diğer enerji kaynakları
 Çevresel ve işletme koşulları
 Ambalajın açılması ve hasar kontrolü
 İçeriği ambalajlama listesine göre çapraz kontrol etme
 Bilgisayar kontrollü enstrümantasyon belgeleri
 Yazılım kurulumunu ve temel erişilebilirliği kontrol etme
 Montaj yardımcı aletleri ve seçenekleri
 Çevresel birimlerle bağlantıları ve iletişimi doğrulama
 Ürün yazılımı versiyonlarını ve seri numaralarını kaydetme
 Aletleri IQ etiketleri ile etiketleme
 IQ için kullanılan ekipmanların kalibrasyon ve geçerlilik tarihlerini kaydetmek
 Tüm el kitaplarını ve uygunluk belgelerini toplama

Operasyonel/İşletim Yeterliliği (OQ): IQ aşaması tamamlandıktan sonra, önceden

tanımlanmış özelliklere uygun şekilde fonksiyonlarını gerçekleştirildiğinin belgelendirilerek
ispatlanmasıdır. OQ, normalde IQ’yu takip eder, ancak ekipmanın karmaşıklığına bağlı
olarak, birleştirilmiş Kurulum/Çalışma Kalifikasyonu (IOQ) olarak gerçekleştirilebilir.4 IQ
aşamasının her protokolü yerine getirildiğinde, ekipmanın performansının kullanıcı
gereksinimi özellikleri ile uyumlu olduğunu kontrol etmek için Operasyonel Yeterliliği (OQ)
gerçekleştirilir. OQ aşamasında, test planındaki tüm öğeler ayrı ayrı test edilir ve
performansları belgelenir. Bu ekipmanın ve tesisin teknik olarak kabul edilmesi için bir ön
şarttır, bu yüzden ancak IQ başarılı olduktan sonra gerçekleştirilebilir. İlk kurulum sonrasında
yeterliliğin yanı sıra, herhangi bir önemli bakım çalışması veya ekipman üzerinde
değişiklikler yapıldıktan sonra veya düzenli bir kalite güvence programının parçası olarak
yeniden kalifikasyonun yapılması gerekir.2

Operasyonel Yeterlilik;

i. Sistemin tasarlandığı gibi çalışmasını sağlamak için süreçler, sistemler ve ekipman

bilgisi ile geliştirilen testler,
 ii. İşletmenin en alt sınırları ve/veya “en kötü senaryo” koşullarında çalışabilme
özelliklerini içermelidir, ancak bunlarla sınırlı değildir.4

Başarılı bir OQ’nun tamamlanması, standart işletim ve temizlik prosedürlerinin, operatör

eğitiminin ve koruyucu bakım gereksinimlerinin sonuçlandırılmasına izin vermelidir. OQ’nun
temel amacı, nihai ürün kalitesini etkileyebilecek ekipmanın özelliklerini tanımlamak ve
incelemektir. Gerekli özellikler aşağıdaki gibi sıralanabilir: 2

 Görüntüleme üniteleri ve sinyal lambaları

 Sıcaklık kontrolleri ve dalgalanmalar
 Aşırı ısınma ve düşük sıcaklık koruma sistemleri ve alarmları
 Basınç/Vakum kontrol sistemleri
 CO2 kontrol sistemleri
 Nem ölçme ve kontrol sistemleri
 Fan ve fan hızı denetleyicileri
 Servo motorlar ve hava kanalı kontrolörleri
 Kart okuyucuları ve erişim denetleyicileri
 DIN 12880: 2007-05 uyarınca sıcaklık dağılımı

Performans Yeterliliği (PQ): OQ aşaması tamamlanmış olan tesis ve sistemlerin amaçlanan

fonksiyonun, sürekli bir şekilde önceden belirlenen özelliklere uygun olarak yerine
getirildiğinin yazılı olarak ispat edilmesidir. İlk uygunluk onayı sonrası PQ çalışmaları belirli
aralıklarla gözden geçirilir ve tekrar validasyon çalışmaları için PQ çalışmaları yinelenir.4 PQ
ekipman için yeterlilik/kalifikasyon işlemlerinin son adımıdır ve bu adım, ekipmanın belirli
bir çalışma aralığında tekrarlanabilir şekilde çalıştığının doğrulanmasını ve belgelendirmesini
içerir. Yeterlilik başlamadan önce, süreç açıklamalarına dayalı ayrıntılı bir test planı
hazırlanır. Süreç Performans Yeterliliği (PPQ) protokolü, sürecin belirli bir süre boyunca
belgelendirilmesiyle süregelen ürün kalitesini sağlamak için kullanılan süreç doğrulama ve
yeterliliğinin hayati bir parçasıdır. Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug
Administration, FDA) yönergeleri, PQ ve PPQ protokollerinin bir parçası olarak aşağıdaki
ölçütleri içermesini önermektedir: 2

 Ekipman kısıtlılığı, çalışma parametreleri ve bileşen girişleri gibi üretim koşulları

 Kalibrasyon ve doğrulama sırasında kaydedilmesi veya analiz edilmesi gereken veriler
ve testlerin bir listesi
 Çeşitli üretim adımlarında kaliteyi sağlamak için yapılması gereken testler
  Üretim gruplarında ve arasında yapılan örnekleme yöntemlerini özetleyen bir
örnekleme planı
 İstatistiki veriler temel alınarak veri, bilimsel ve risk odaklı karar verme analiz
metodolojisi
 Uyumluluk için değişkenlik sınırlarını ve ihtimal planlarını tanımlama
 İlgili bölümler tarafından PPQ protokolünün onaylanması

DQ, IQ, OQ ve PQ uygulamalarıyla donanım yeterliliği, imalatçıların ve laboratuvarların

ekipmanlarının tutarlı kalitede olmasını sağlayabilmeleri GMP’nin bir parçasıdır. Küçük
laboratuvarlar düzenli olarak dış ekipman doğrulama servislerini plan içine alarak fayda
sağlayabilir.2

2. Sistem Uygunluk Parametreleri

Sistem uygunluk testi birçok analitik prosedürün ayrılmaz bir parçasıdır. Testler; analiz
edilecek ekipman, elektronik, analitik işlemler ve numunelerin değerlendirilebileceği ayrılmaz
bir sistem oluşturduğu kavramına dayanmaktadır. Belirli bir prosedür için kurulacak sistem
uygunluğu test parametreleri, onaylanan prosedürün türüne bağlıdır. Ek bilgi için bkz.
Farmakopeler.5

FDA’ya göre Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) verilerinin doğruluğu ve

kesinliği iyi hazırlanmış bir kromatografik sistem ile başlamaktadır. Sistemin uygunluk
özellikleri ve testleri, bu amaca ulaşmada yardımcı olan parametrelerdir. Bu bölüm, Şekil 2’de
belirtilen koşulları açıklar ve öneriler sağlar.6
 Şekil 2. Sistem uygunluk parametreleri için kullanılan terimlerin tanımı

Wx = Pik yüksekliğinin olduğu zemin’in %5’i (0.05) veya %10’undaki (0.10) pik genişliği
olarak belirtilir.

f= Wx’deki maksimum pik ve ön pik arasındaki mesafe

to = Boşluk hacminin veya tutunmayan (alıkonmayan) bileşenlerin elüsyon süresi

tR = Analitin alıkonma süresi

tw = Pik taban genişliği

2.1. Alıkonma (Retention) Faktörü (k')

𝑘′ = (𝑡𝑅 − 𝑡0 )/ 𝑡0

Alıkonma faktörü; boşluğun hacmine, yani net alıkonma sürelerinin, tutunmayan

(alıkonmayan) bileşenin elüsyon süresine göre oranını gösteren bir ölçümdür.

Öneriler: Pik diğer piklerden ve boşluk hacminden iyi ayrılmalıdır. Genellikle k' değerinin
>2 olması gerekir.

2.2.Kesinlik/Enjeksiyon Tekrarlanabilirliği

Bağıl Standart Sapma (BSS/RSD) olarak ifade edilen enjeksiyon kesinliği, bağlantı
elemanları, kolon ve çevresel koşulları, numunelerin analiz edildiği zamanı içeren HPLC
performansını belirtir. Numune hazırlama ve üretim kaynaklı varyasyonlarının dikkate
alınmadığı unutulmamalıdır.

Öneriler: n ≥5 için ≤ %1 olan BSS/RSD değeri istenir.

2.3. Bağıl Alıkonma (Relative Retention, α)

∝= 𝑘1′ / 𝑘2′

Bağıl alıkonma; iki pikin bağıl konumunun bir ölçüsüdür. Ayırım/Resolution (Rs)
belirtildiği sürece, bu kritik bir parametre değildir.

2.4. Ayırım (Piklerin Ayrılması, Resolution, Rs)

𝑅𝑠 = (𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1 )/(1⁄2) (𝑡𝑊1 + 𝑡𝑊2 )

Rs, iki pikin ne kadar iyi ayrıldığının bir ölçüsüdür. Güvenilir nicelleme için, iyi ayrılmış
pikler çok önemlidir. Olası girişim pik(ler)i açısından, yararlı bir parametredir. Rs’ye en yakın
potansiyel bir maddeyi çözgenle diğerinden ayrıştıran pik, ölçülen iki bileşiğin oranından
önemsiz derecede etkilenir. Rs değerlerine bağlı olarak gösterilen piklerin ayırımı Şekil 3’te
gösterilmektedir.

Öneriler: İlgili pik ve en yakın olası girişim piki (safsızlık, ilaç katkı maddeleri, bozunma
ürünü, iç standart, vb.) arasında Rs değerinin >2 olması istenir.

2.5. Kuyruklanma Faktörü (Tailing Factor, T)

𝑇 = 𝑊𝑥 /2𝑓

İntegratördeki pikin nerede ve ne zaman bittiği ve dolayısıyla pik eğri altındaki alanın
hesaplanmasında karşılaşılan zorluklardan dolayı nicellemenin doğruluğu, pikin
kuyruklanmasındaki artış ile azalır. İntegratör değişkenleri, ilgili pik alanın optimum hesabı
için analist tarafından önceden belirlenmiştir. Şekil 4 ve 5, kuyruklanma faktörlerini ve
nicelleme üzerindeki etkiyi göstermektedir. İntegratör pik çizimlerinde aşağı veya yukarı
doğru olan eğimleri tam olarak belirleyemez ise doğruluk azalır.

Öneriler: T ≤ 2

2.6. Teorik Plaka Sayısı (Theoretical plate number, N)

𝑁 = 16 (𝑡𝑅 /𝑡𝑤 )2 = 𝐿/𝐻

Teorik plaka sayısı; kolon verimliliğinin bir ölçüsü olup kromatogramda birim çalışma
zaman dilimi başına kaç adet pikin yer alabileceğini göstermektedir. Sabit çalışma
koşullarında elde edilen bir kromatogramda her pik için N değeri büyük oranda sabit kalır.
Teorik eşdeğer plaka yüksekliği (H veya HETP) , kolonun birim uzunluğu (L) başına kolon
verimliliğini ölçer. N veya H’yi etkileyen parametreler; pikin konumu, kolondaki parçacık
boyutu, hareketli fazın akış hızı, kolon sıcaklığı, mobil fazın viskozitesi ve analitin molekül
ağırlığıdır. A gibi bir bileşiğin üç farklı kromatografik koşul altındaki farklı alıkonma süreleri
Şekil 6’da farklı kromatogramlar tek bir birleştirilmiş kromatogramda göstermektedir.
İncelendiğinde, pikler görsel olarak benzer görünse de teorik plaka sayılarının farklı olduğu
görülmektedir.

Öneriler: Teorik plaka sayısı elüsyon süresine bağlıdır, ancak genel olarak >2000 olmalıdır.

Genel Öneriler: Sistem uygunluk testi, kromatografik sistemin kalite performansının

güvencesi için gereklidir. Gerekli test miktarı, test yönteminin amacına bağlı olacaktır.
Ayrışma/çözünme (dissolution) veya harici bir standart yöntem kullanılan serbest
bırakma/salma profili test yöntemleri için; k', T ve BSS/RSD asgari olarak önerilen sistem
uygunluk testleridir. Dış veya iç standart yöntemleri kullanılan kabul, serbest bırakma,
kararlılık veya safsızlık/bozunma için; k', T, Rs ve BSS/RSD, asgari olarak önerilen sistem

Şekil 3. Rs değerleri ile gösterilen piklerin ayrılması

Şekil 4. Çeşitli kuyruklanma faktörlerine sahip HPLC piki

 Şekil 5. Nicelleme (kantitasyon) üzerine pik kuyruklanmasının etkisi

Rt (dk) N k’

A1
29,642 25128 4,884
(Akış hızı= 0.5 ml/dk)
A2
26,747 3817 4,349
(Akış hızı= 1.0 ml/dk)
A3
25,253 4250 4,051
(Akış hızı= 1.5 ml/dk)

Şekil 6. Alıkonma zamanlarının teorik plakalar üzerine etkisi

uygunluk parametreleridir. Uygulamada, doğrulama için sunulan her yöntem, sistemin

gerekli özelliklerini tanımlayan uygun sayıda sistem uygunluk testlerini içermelidir.

2.7. Üzerinde Durulması Gereken Önemli Noktalar

1. Örnek ve standart, mobil fazda çözünmelidir. Eğer mümkün değilse, mobil fazdaki
seviyeye kıyasla çok yüksek oranda organik çözücü kullanmaktan kaçınılmalıdır.
 2. Örnek ve standardın derişimleri aynı olmasa da birbirlerine yakın olmalıdır.
3. Analitik yöntemin uygulama sürecinde numunelerin ölçüm aşamasında, ölçüm dizini
(sequence) kalite kontrol ile başlayıp kalite kontrol ile sonlanmalıdır.
4. Enjeksiyon öncesi bazen örneklerin filtrasyonu gerekli olabilir. Filtrasyon, kolonları
tıkayabilecek partikülleri (santrifüj işlemi aynı işlevi yapar) giderecektir. Analitin
filtreye yapışması (adezyon) da gerçekleşebilir. Bu, özellikle düşük seviyeli
safsızlıklar için önem arz edecektir. Bu problemi gösteren durumu valide etmek için
gerekli veriler sunulmalıdır.6

3. Analitik Yöntem Geliştirme

Analitik cihazda gerçekleştirilen bir dizi sistem uygunluk testlerinden sonra, cihazın
ölçüm ve analizler için yeterli özellikte olduğu saptanarak, analitik yöntem geliştirme
aşamasına geçmek gereklidir. Bu süreçte; cihazda gözlenen kimi varyasyonların artık
cihazdan kaynaklanmadığı, aksine analitik yöntem geliştirme aşamalarında bilerek yapılan
değişikliklerden; örneğin akış hızı değişimi, kolon değişimi ve sıcaklık değişimi vb.
parametrelerden kaynaklandığına yönelik mutlak bir ilişki kurulması söz konusudur. Bu
nedenle, sistem uygunluk testleri yapılmadan gerçekleştirilecek bir analitik yöntem geliştirme
çabasının, büyük olasılıkla sonuçsuz kalacağı açıktır.1 (Bknz. Bölüm....)

4. Yöntem Validasyonu

Yöntem validasyonu, temelde bir analitik gereksinimin tanımlaması ve incelenen

yöntemin, uygulaması gerektirdiği esaslara uygun olduğuna dair bir onaylama sürecidir.
Tablo 1’de validasyonun farklı rehberlere göre kelime anlamı yer almaktadır.

Yöntem validasyonu, genelde yöntem geliştirme ile çok yakından bağlantılı olarak
düşünülür. Yöntem validasyonu ile ilişkili olan yöntem performans özelliklerinin çoğu,
genellikle yöntem geliştirmenin parçası olarak değerlendirilir (Tablo 2). Bununla birlikte,
yöntemin son halinin resmi olarak onaylanması oldukça önemlidir. Bir yöntem, performans
özelliklerinin belirli bir amaçla kullanım için yeterli olduğunun kanıtlanması gerektiği
durumlarda valide edilmelidir.

• Standart olmayan yöntemler,

• Laboratuvar tarafından tasarlanmış/geliştirilmiş yöntemler,

 • Amaç dışında kullanılan standart yöntemler,

• Standart yöntemlerin yükseltilmesi ve modifikasyonları durumunda laboratuvarların

validasyon yapması gerekmektedir. Validasyon, kullanım veya uygulama ile ilgili
gereksinimleri karşılamak için yeterli kapsamda olmalıdır. Validasyonun kapsamı;
uygulamaya, yapılan değişikliklerin niteliğine ve yöntemin kullanılacağı koşullara bağlı
olacaktır. Validasyon, yeni geliştirilen bir yöntem ve mevcut standart/düzenleyici yöntem gibi
iki farklı yöntemle elde edilen sonuçların eşdeğerliğini göstermek için de gereklidir.1

Tablo 1. ISO 9000, ISO / IEC 17025 ve VIM’de “Validasyon” kavramının tanımları1

Tanım Referans

Objektif delillerin sağlanması yoluyla, özellikle amaçlanan bir kullanım ISO 9000a
veya başvuru için şartların yerine getirilmesinin teyidi

İnceleme yoluyla teyit ve belirli bir amaca yönelik kullanım için özel ISO/IEC 17025
şartların yerine getirildiğine dair nesnel kanıt sağlanması

Belirlenen gerekliliklerin amaçlanan kullanım için yeterli olduğu yerde VIMb

doğrulama

a
ISO 9000 "Yeterlilik Süreci"ni "belirtilen şartları yerine getirme kabiliyetini göstermek için
kullanılan süreç" olarak tanımlar.

b
VIM "doğrulamayı" "belirli bir maddenin belirtilen şartları yerine getirdiğine dair nesnel kanıt
sağlanması" olarak tanımlar.

Tablo 2. Yöntem validasyonu sırasında yaygın olarak değerlendirilen performans özelliklerine

genel bakış
Performans Özellikleri

Seçicilik

Saptama Alt Sınırı (LOD) ve Belirtme Alt Sınırı (LOQ)

Çalışma Aralığı
 Analitik Hassasiyet

Gerçeklik (Trueness)

 Hata, Gerikazanım
Kesinlik

 Tekrarlanabilirlik, Ara Kesinlik, Tekrarüretilebilirlik

Ölçüm Belirsizliği*

Sağlamlık

*
Ölçüm belirsizliği, belirli bir ölçüm prosedürünün performans
karakteristiği değil, ölçüm prosedürü kullanılarak elde edilen sonuçlardır.

4.1. Validasyon & Doğrulama

Genel olarak validasyon; yeni geliştirilen bir yöntem ya da standart bir yöntem
bulunmadığı zaman yapılır. Doğrulama işleminde ise; yöntem geliştirme işlemi yapılmış,
yöntem daha önce valide edilmiş ve standart bir yöntem haline getirilmişse, bu durumda,
baştan itibaren validasyon yapılmasına ihtiyaç yoktur. Yalnızca, tekrarlanabilirlik çalışmaları
yapılarak standart yöntemdeki tekrarlanabilirlik (r) ve tekrarüretilebilirlik değerleri (R)
karşılaştırılır. Laboratuvarda yapılan doğrulama çalışmalarında söz konusu değerlerin, r ve R
değerlerinden küçük olduğu saptandığında, yöntem doğrulanmış kabul edilir.1

5. Analitik Yöntem Validasyonu

Biyolojik matrikslerdeki (serum, plazma, kan, idrar ve tükürük gibi) madde derişimlerinin
ölçülmesi, Adli Toksikolojinin önemli bir parçasıdır. Bu tür veriler, yeni aktif ve jenerik
maddelere yönelik uygulamaların yanı sıra, onaylı ilaç ürünlerinde yapılan değişiklikler için
de gerekli olabilir. Uygulanan biyoanalitik yöntemlerin, güvenilir sonuçlar elde etmek için
standartlara uygun olarak iyi karakterize edilmiş, tam valide ve belgelenmiş olması büyük
önem taşımaktadır. Biyoanalitik yöntemlerin validasyonu ve insanlardaki klinik araştırmalar
için çalışma örneklerinin analizi, İyi Klinik Uygulamaları ilkelerine göre yapılmalıdır.7

5.1.Analitik Yöntemin Tam Validasyonu

Yeni veya literatür bazında herhangi bir analitik yöntem için yöntem tam validasyonu
yapılmalıdır. Yöntem validasyonunun asıl amacı; kan, serum, plazma, idrar veya tükürük gibi
biyolojik matrikslerde analit derişiminin belirlenmesi için belirli bir yöntemin güvenilirliğini
göstermektir. Buna ek olarak antikoagülan kullanılan bir yöntemde, validasyon çalışma
örnekleri aynı antikoagülan kullanılarak yapılmalıdır. İlgili her tür ve matriks için tam
validasyon yapılmalıdır. Bazı durumlarda, validasyon çalışmaları için örneklerin matriksine
kıyasla özdeş bir matriks elde etmek zor olduğu durumlarda sentetik olarak hazırlanmış uygun
farklı bir matriks kullanılabilir.7

Analitik sonuçların performans ve güvenilirliğinin kabul edilebilirliği için gerekli olan

biyoanalitik yöntemin ana özellikleri şöyledir: Seçicilik, özgüllük (spesifite), belirtme alt
sınırı (LOD), en düşük saptama alt sınırı (LLOD), yanıt fonkonsiyonu (response function) ve
kalibrasyon aralığı (kalibrasyon eğrisi performansı), doğruluk, kesinlik, tekrarlanabilirlik,
matriks etkisi, biyolojik matriks içerisinde analit(ler)in kararlılığı, sağlamlık, analit(ler)in ve
iç standartların stok (ana) çözelti ve çalışma çözeltilerindeki kararlılığı, ekstraktların saklama
ve çalışma koşullarındaki kararlılığı şeklindedir.5,7

İlk aşamada genellikle bir analit belirlenmelidir, ancak bazen birden fazla analitin
ölçülmesi de gerekebilir. İki farklı madde, metabolitleri olan bir ana madde veya bir
maddenin enantiyomerlerini veya izomerlerini de içerebilir. Bu durumlarda validasyon ve
analiz prensipleri ilgilenilen tüm analitlere uygulanmalıdır.

5.1.1. Seçicilik (Selectivity)

Analitik yöntem, ilgili analit(ler)i ve iç standardı, numunedeki ve matriksteki diğer

bileşenlerden ayırt edebilmelidir. Seçicilik, ayrı kaynaklardan elde edilen en az 6 ayrı kör
matriksin kullanılmasıyla, girişimler açısından ayrı ayrı analiz edilir ve değerlendirilir. Türüne
ender rastlanan matrikslerin olduğu durumda, daha az miktarda numune kullanımı kabul
edilebilir. Normalde, yanıtın (response), analit için saptama alt sınır değerinin %20’sinden ve
iç standart için %5’inden az olduğu durumlarda, girişim yapan bileşenlerin yok olduğu kabul
edilmektedir.

İncelenen maddeler popülasyonda normal olarak kullanılan ilaçlarla birlikte potansiyel

olarak girişim yapabilirler. Madde metabolitlerinin neden olduğu girişimlerin, numune
hazırlama sırasında oluşan bozunma ürünlerinden gelen girişim ve birlikte uygulanması olası
maddelerden kaynaklanan girişimlerin kapsamını araştırmak da gerekebilir. Araştırılan konu,
popülasyonda normalde kullanılan ilaçlarla birlikte, potansiyel olarak etkilenebilirler, yöntem
doğrulama aşamasında, bir çalışmaya özgü veya bileşik bazında dikkate alınmalıdır.
 Analizin ardışık basamakları (ekstraksiyon prosedürleri veya MS kaynağı) sırasında
bir metabolitin ana analit haline dönüşümü olasılığı da değerlendirilmelidir (Potansiyel olarak
dengesiz metabolitler örneğin; asidik metabolitler ester, kararsız N-oksitler veya Glukuronid
metabolitleri, lakton halka yapıları vb.). Bu dönüşümün kapsamı belirlenmeli ve çalışma
sonuçları üzerindeki etkisi tartışılmalıdır. Bazı durumlarda ilgili metabolitlerin elde
edilmesinin çok zor olduğu bilinmektedir. Alternatif olarak, bir metabolitin ana analit haline
geri dönüşümü, numunenin yeniden analizini yaparak kontrol edilebilir. Bununla birlikte, bu
durumda örnek çalışılması (prosesing) sırasında potansiyel geri dönüşüm göz ardı edilemez.7

5.1.2. Özgüllük (Spesifite, Specifity)

Özgüllük, var olması beklenen bileşenlerin yanında analiti açıkça değerlendirebilme

yeteneğidir. Genellikle bunlar, safsızlıkları, matriksi vb. içerebilir. Bireysel bir analitik
prosedürün özgüllüğünün olmaması, diğer destekleyici analitik prosedür(ler) tarafından telafi
edilebilir. Bu tanım aşağıdaki uygulamaları içerir:

Tanımlama: Bir analitin kimliğini sağlamak.

Saflık Testleri: Yapılan tüm analitik işlemlerin, bir analitin ilgili maddeler testi yani ağır
metaller, artık çözücüler içeriği vb. yabancı madde içeriğinin doğru bir şekilde ifade
edilmesini sağlamaktır. Tanımlama testlerinin validasyonu, safsızlıkların belirlenmesi ve
analiz sırasında özgüllüğünün araştırılması yapılmalıdır. Özgüllüğü göstermek için kullanılan
prosedürler, analitik prosedürün planlanan amacına bağlı olmalıdır. Analitik bir prosedürün
belirli bir analit için özgül olduğunu göstermek (tam ayrım) her zaman mümkün değildir. Bu
durumda, gerekli düzeyde ayrıma ulaşmak için iki veya daha fazla analitik prosedürün bir
kombinasyonu önerilir.

Tanımlama: Uygun tanımlama testleri, mevcut olması muhtemel yakından ilişkili yapıların
bileşimlerini ayırt edebilmelidir. Bir prosedürün ayırım yeteneği, analiti içeren numunelerden
gelen olumlu (pozitif) sonuçlar (belki de bilinen bir referans materyal ile karşılaştırma
yapıldığında) ve analiti içermeyen numunelerden gelen olumsuz (negatif) sonuçlarla
birleştiğinde teyit edilebilir. Buna ek olarak, tanımlama testi yapısal olarak benzer veya
olumlu bir cevabın elde edilmediğini teyit etmek için analit ile yakından ilişkili olan
materyallere uygulanabilir. Potansiyel olarak girişim yapan bu tür materyaller, meydana
gelebilecek müdahaleler göz önüne alınarak sağlam bilimsel karara dayalı olarak seçilmelidir.
Analiz ve Safsızlık Test(ler)i: Kromatografik prosedürlerde özgüllüğü göstermek için
temsili kromatogramlar kullanılmalıdır ve tekli bileşenler uygun şekilde etiketlenmelidir.
Diğer ayırma tekniklerine de benzer önem verilmelidir. Kromatografide kritik ayrımlar,
uygun bir seviyede araştırılmalıdır. Kritik ayrımlar için, birbirine en yakın çıkan iki bileşenin
ayrışmasıyla özgüllük gösterilebilir. Özgül olmayan bir analizin (deneyin) kullanıldığı
durumlarda (olgularda), genel özgüllüğü göstermek için diğer destekleyici analitik prosedürler
kullanılmalıdır. Örneğin, piyasaya sürülecek bir ilaç maddesinin tayini için bir titrasyonun
uygulandığı durumlarda, analiz ve safsızlıklar için uygun bir testin kombinasyonu
kullanılabilir. Yaklaşım, hem analiz hem de safsızlık testleri için benzerdir:
Safsızlıklar var olduğunda: Analitin safsızlıklar ve/veya ara maddeler varlığında
ayrımının gösterilmesi; uygun seviyelerde safsızlık ve/veya ara maddeler içeren saf
maddeler ile standart katım yapılarak, sonuçların bu materyallerin varlığından
etkilenmediğini göstererek yapılabilir. Safsızlık testi için, ayrım; ilaç maddesi veya
ilaç ürününün uygun seviyelerde safsızlıklarla birlikte katılması ve bu safsızlıkların
tek tek ve/veya numune matrisindeki diğer bileşenlerden ayrılmasının gösterilmesi
yoluyla oluşturulabilir.
Safsızlıklar olmadığında: Safsızlık veya bozunma ürün standartları yoksa özgüllük,
saf olmayan veya indirgeyici ürünler içeren numunelerin test sonuçlarının,
farmakope tipi yöntem veya diğer valide analitik prosedür (bağımsız prosedür) gibi
iyi tanımlanmış ikinci bir yöntemle karşılaştırılması yoluyla gösterilebilir. Uygun
olduğunda, bu yöntem, ışık, ısı, nem, asit/baz hidrolizi ve oksidasyon gibi ilgili stres
koşulları altında depolanan örnekleri içermelidir.

 Analiz için iki sonuç karşılaştırılmalıdır.

 Safsızlık testleri için safsızlık profilleri karşılaştırılmalıdır.

Pik saflık testleri, analit kromatografik pikinin birden fazla bileşene

dayandırılmadığını (örneğin, diyot dizilimi, kütle spektrometresi) göstermek için yararlı
olabilir.

Deney (içerik veya etki): Bir numunedeki analitin içeriği veya potansiyeli hakkında doğru
bir açıklama ile kesin bir sonuç sağlamaktır.5

5.1.3. Belirtme Alt Sınırı (Limit of Detection, LOD)

 Tek bir analitik prosedürün belirtme alt sınırı, bir numunedeki analitin tespit edilebilen
ancak mutlak kesin bir değer olarak nicelleştirilemeyen en düşük miktarıdır. İşlemin
enstrümantal olup olmamasına bağlı olarak belirtme alt sınırının belirlenmesi için çeşitli
yaklaşımlar mümkündür. Aşağıda listelenenler dışındaki yaklaşımlar da kabul edilebilir.

Görsel Değerlendirmeye Dayalı: Görsel değerlendirme, enstrümantal yöntemler için

kullanılabildiği gibi, enstrümantal olmayan yöntemlerle de kullanılabilir. Belirtme alt sınırı
bilinen analit derişimlerine sahip numunelerin analizi ve analitin güvenilir şekilde tespit
edilebileceği minimum seviyeyi belirleyerek saptanır.

Sinyal/Gürültü Oranına Dayalı:

Bu yaklaşım, yalnızca zemin gürültüsünü gösteren analitik prosedürlere uygulanabilir.
Sinyal/gürültü oranının belirlenmesi, analitin bilinen düşük derişimlere sahip numunelerden
alınan ölçüm sinyallerinin boş numunelerinkiyle karşılaştırılması ve analitin güvenilir şekilde
tespit edilebileceği minimum derişimin sağlanmasıyla gerçekleştirilir. 3 veya 2:1 arasındaki
bir sinyal/gürültü seviyesi genellikle belirtme alt sınırını tahmin etmek için kullanılan kabul
oranını verir.
Yanıtın (Response) ve Eğimin (Slope) Standart Sapmasına Dayalı: Belirtme alt sınırı şu
şekilde ifade edilebilir:
3.3 𝜎
𝐷𝐿 =
𝑆
ơ =Yanıtın (response) std. sapması

S= Kalibrasyon eğrisinin eğimi

Eğim (S), analitin kalibrasyon eğrisinden tahmin edilebilir. ơ değerinin tahmin
edilmesi aşağıdaki gibi çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir:

Körün (Blank) Standart Sapmasına Dayalı: Analitik arka plan (background) yanıtının
büyüklüğünün ölçülmesi, uygun sayıda kör örnek analiz edilerek ve bu yanıtların standart
sapmasını hesaplayarak gerçekleştirilir.
Kalibrasyon Eğrisine Dayalı: Belirli bir kalibrasyon eğrisi, belirtme alt sınırı aralığında
analit içeren numuneler kullanılarak incelenmelidir. Bir regresyon çizgisinin artık (residual)
standart sapması veya regresyon çizgilerinin y-kesişim (intercept) standart sapması, standart
sapma olarak kullanılabilir.
Önerilen Veriler: Belirtme alt sınırı ve belirtme alt sınırının belirlenmesi için kullanılan
yöntem sunulmalıdır. Belirtme alt sınırı, görsel değerlendirme veya sinyal/gürültü oranına
dayalı olarak belirlenirse, ilgili kromatogramların sunumu gerekçe olarak kabul edilebilir.
Belirtme alt sınırı için tahmini bir değerin hesaplama veya ekstrapolasyon ile elde edildiği
durumlarda, bu tahmini, daha sonra belirtme alt sınırında veya yakınında hazırlanmış uygun
numune örneklerinin bağımsız analizi ile doğrulanabilir.5

5.1.4. Saptama Alt Sınırı (Limit of Quantification, LOQ)

İşlemin enstrümantal olup olmamasına bağlı olarak saptama alt sınırının

belirlenmesine yönelik çeşitli yaklaşımlar mümkündür. Aşağıda listelenenler dışındaki
yaklaşımlar da kabul edilebilir:

Görsel Değerlendirmeye Dayalı: Görsel değerlendirme, enstrümantal yöntemler için

kullanılabildiği gibi, enstrümantal olmayan yöntemlerle de kullanılabilir. Saptama alt sınırı
genel olarak bilinen analit derişimlerine sahip numunelerin analizi ve analitin kabul edilebilir
doğruluk ve kesinlikle saptanabileceği minimum seviyeyi belirleyerek saptanır.
Sinyal/Gürültü Oranına Dayalı: Bu yaklaşım, yalnızca zemin (baseline) gürültü gösteren
analitik prosedürlere uygulanabilir. Sinyal/gürültü oranının belirlenmesi, analitin bilinen
düşük derişimlerine sahip numunelerden alınan ölçüm sinyallerinin, kör numunelerinkiyle
karşılaştırılması ve analitin güvenilir şekilde saptanabileceği minimum derişimin
sağlanmasıyla gerçekleştirilir. Tipik bir sinyal/gürültü oranı 10:1’dir.
Yanıtın (Response) ve Eğimin (Slope) Standart Sapmasına Dayalı: Saptama alt sınırı şu
şekilde ifade edilebilir:
10 𝜎
𝑄𝐿 =
𝑆
ơ =Yanıtın (response) std. sapması

S= Kalibrasyon eğrisinin eğimi

Eğim (S), analitin kalibrasyon eğrisinden tahmin edilebilir. ơ değerinin tahmin
edilmesi aşağıdaki gibi çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir:

Körün (Blank) Standart Sapmasına Dayalı: Analitik arka plan (background) yanıtının
büyüklüğünün ölçülmesi, uygun sayıda kör örnek analiz edilerek ve bu yanıtların standart
sapmasını hesaplayarak gerçekleştirilir.
Kalibrasyon Eğrisine Dayalı: Belirli bir kalibrasyon eğrisi, saptama alt sınırı aralığında bir
analit içeren numuneler kullanılarak incelenmelidir. Bir regresyon çizgisinin artık standart
sapması veya regresyon çizgilerinin y-kesişim (intercept) standart sapması, standart sapma
olarak kullanılabilir.

Önerilen Veriler: Saptama alt sınırı ve saptama alt sınırını belirlemek için kullanılan yöntem
sunulmalıdır. Sınır, daha sonra, saptama alt sınırının yakınında veya sınırında hazırlanmış
olduğu bilinen uygun sayıda numunenin analizi ile doğrulanmalıdır.5

Avrupa İlaç Ajansı (European Medicines Agency, EMEA)’na göre; en düşük saptama
alt sınırı (Lowest Limit of Quantification LLOQ) bir örnekteki analitin, kabul edilebilir
doğruluk ve hassaslıkla güvenilir bir şekilde miktarının ölçülebildiği en düşük derişimidir.
LLOQ, en düşük kalibrasyon standardı olarak kabul edilir. Buna ek olarak, LLOQ örneğinin
analit sinyali, kör bir örneğin sinyalinin en az 5 katı olmalıdır. LLOQ beklenen derişimlerde
ve çalışmanın amacına göre uyarlanmalıdır. Örneğin, biyoeşdeğerlik çalışmaları için LLOQ,
Cmax’ın %5’inden daha yüksek olmamalı, böyle düşük bir LLOQ değeri farmakokinetik
araştırma çalışmaları için gerekli olmayabilir.7

5.1.5. Kalibrasyon Eğrisi (Calibration Curve)

Cihazın analit derişimine göre cevabı bilinmeli ve belirli bir derişim aralığında
değerlendirilmelidir. Kalibrasyon standartları; derişimi bilinen analit, çalışılmak istenen kör
matrikse katım yapılarak hazırlanmalıdır. Yöntem validasyonunda incelenen her bir analit ve
analitik çalışma için bir kalibrasyon eğrisi olmalıdır.

İdeal olarak, analitik yöntemin validasyonunu yapmadan önce hangi derişim aralığının
beklendiği bilinmelidir. Bu aralık, en düşük kalibrasyon standardı olan LLOQ ve en yüksek
kalibrasyon standardı olan ULOQ tarafından tanımlanan kalibrasyon eğrisi aralığını
içermelidir.

Kalibrasyon aralığı, ilgili analitin farmakokinetiğinin yeterli tanımlanmasına olanak

sağlamalıdır. En az altı derişim seviyesi, kör (blank) (analit ve IS içermeyen işlem görmüş
matriks) ve sıfır (zero) (IS ile işlem görmüş matriks) numuneleri kullanılmalıdır. Her bir
kalibrasyon standardı tekrarlanabilir olmalıdır.

Analitin derişimi açısından cihazın yanıtını basitçe ve yeterince açıklayan bir ilişki
olmalıdır. Kalibrasyon eğrisi parametrelerini hesaplamak için kör ve sıfır numuneler dikkate
alınmamalıdır. Doğrusal uyum halinde eğim ve kesişim parametrelerini içeren kalibrasyon
eğrisi parametreleri rapor edilmelidir. Buna ek olarak, kalibrasyon standartlarının geri
hesaplanan derişimleri hesaplanan ortalama hassasiyet değerleri ile birlikte sunulmalıdır.
Doğrulama sırasında (veya kabul edilebilir) elde edilen tüm mevcut eğrilerin en az 3 tanesi
rapor edilmelidir.

Kalibrasyon standartlarının geri hesaplanan derişimleri, gerçek değerin ±%15’i,

LLOQ’nun ±%20’si dâhilinde olması gerekir. Kalibrasyon standartlarının en az %75’i, en az
altı kalibrasyon standart seviyesi ile bu kriteri yerine getirmelidir. Tekrarlar kullanılırsa, her
bir derişim başına test edilen kalibrasyon standartlarının en az %50’si için kriterler (LLOQ
için ±%15 veya ±%20) uygulanmalıdır. Bir kalibrasyon standardının bu kriterlere uymaması
halinde, standart numune reddedilmelidir. Kalibrasyon standardı bulunmayan eğriler
regresyon analizi de dahil olmak üzere yeniden değerlendirilmelidir. LLOQ veya ULOQ
kalibrasyon standardının tüm tekrarları reddedilirse, tüm seri (batch) validasyondan
çıkarılmalıdır, hatanın olası kaynağı belirlenip gerekirse yöntem revize edilmelidir. Bir
sonraki doğrulama serisi de başarısız olursa, validasyon işlemini başlatmadan önce yöntem
gözden geçirilmelidir. Kalibrasyon eğrisi tercihen yeni açılmış örnekler kullanılarak
hazırlansa da, uygun kararlılık verileri ile destekleniyorsa önceden hazırlanmış ve depolanmış
kalibrasyon numuneleri de kullanılabilir.7

5.1.6. Aralık (Range)

Bir analitik prosedürün çalışma aralığı, analitik prosedürün uygun kesinlik düzeyine,
doğruluğa ve doğrusallığa sahip olduğu kanıtlanmış numunedeki analitin üst ve alt derişimi
arasındadır. Belirtilen aralık normalde doğrusallık çalışmalarından türetilir ve prosedürün
planlanan uygulamasına bağlıdır. Analitik prosedürün belirtilen aralığının sınırları içinde veya
dışında analit miktarı içeren numunelere uygulandığında, analitik prosedürün kabul edilebilir
derecede doğrusallık, doğruluk ve kesinlik sağladığını doğrulayarak belirlenir. Adli
toksikoloji açısından çalışma aralığı, örnek için tahmin edilen değerin çıkabileceği en yüksek
derişim değerinden, en düşük derişim yani saptama alt sınırına kadar olan derişim bölgesini
kapsar. Dinamik aralık çalışma aralığından dah büyük olabilir.

Aşağıda belirtilen asgari aralıklar ilaç üretim sürecinde dikkate alınmalıdır:

 Bir ilaç maddesinin veya bitmiş bir ürünün denenmesi için: normalde test derişiminin
%80’i ile %120’si;
  İçerik homojenliği için, test derişiminin en az %70’i ile %130’ arasındaki derişim
aralığını kapsayan bölgede test yapılır. Daha geniş bir aralık kullanılmamasının
nedeni gerekçelendirilmelidir. Bu genellikle dozaj formunun doğasından ileri gelebilir
(örn., ölçülü doz inhalerleri)
 Çözünürlük testi için: belirtilen aralıkta ±%20 olmalıdır. Örneğin, kontrollü salınan bir
ürünün özellikleri bir bölgeyi %20’den, 1 saat sonra,%90’a kadar kapsadıysa, 24 saat
sonra valide aralık, etikette belirtilenin %0-110’u kapsayacak şekilde olacaktır.
 Bir safsızlığın belirlenmesi için: safsızlık raporlama seviyesindeki düzeyinden
belirtilen düzeyin %1 ile %120’sine kadar,
 Olağandışı derecede güçlü (potent) olduğu bilinen safsızlıklar toksik veya beklenmedik
farmakolojik etkilerin görülmesi için, belirtme/saptama alt sınırı, safsızlıkların kontrol
edilmesi gereken seviyeyle orantılı olmalıdır;

Not: Geliştirme sırasında gerçekleştirilen safsızlık test prosedürlerinin validasyonu

(geçerliliği) için aralığın önerilen limitin civarında olması gerekebilir.

 Eğer analiz (deneme, assay) ve saflık; bir test olarak birlikte uygulanıyorsa ve yalnızca
%100 standart kullanılırsa, doğrusallık, safsızlıkların raporlama seviyesinden test
özelliğinin (spesifikasyonunun) %120’sine kadar olan aralığı kapsamalıdır.5

5.1.7. Doğrusallık (Linearite, Linearity)

Doğrusallık, analit derişiminin veya içeriğinin bir fonksiyonu olarak sinyallerin grafiğinin
görsel denetimi ile değerlendirilmelidir. Doğrusal bir ilişki varsa, test sonuçları uygun
istatistiksel yöntemlerle, örneğin en küçük kareler yöntemiyle bir regresyon çizgisinin
hesaplanmasıyla değerlendirilmelidir. Bazı durumlarda, testler ile örnek derişimleri arasında
doğrusallık elde etmek için, test verilerinin regresyon analizinden önce matematiksel bir
dönüştürmeye tabi tutulması gerekebilir. Regresyon çizgisinden elde edilen veriler,
doğrusallık derecesinin matematiksel tahminlerini sağlamakta yardımcı olabilir.

Korelasyon katsayısı, y kesişim (intercept), regresyon çizgisinin eğimi ve artık kareler

toplamı sunulmalıdır. Veriler bir grafiğe dâhil edilmelidir. Buna ek olarak, gerçek veri
noktalarının regresyon çizgisinden sapmasının bir analizi de doğrusallığı değerlendirmede
yardımcı olabilir. İmmunoassay gibi bazı analitik prosedürler herhangi bir dönüşümden sonra
doğrusallık göstermez. Bu durumda analitik cevap, bir numunedeki bir analitin derişiminin
(miktarı) uygun bir fonksiyonu ile tanımlanmalıdır. Doğrusallık kurulması için minimum 5
derişim önerilir. Diğer yaklaşımlar gerekçeli olarak gösterilmelidir.5

5.1.8. Doğruluk (Accuracy)

Analitik bir yöntemin doğruluğu, yöntem tarafından analitin gerçek derişimine göre
elde edilen değerin yüzde cinsinden yakınlığını açıklar. Doğruluk, analit miktarları bilinen
standart katımlı numuneler, kalite kontrol (KK) numuneleri üzerinden değerlendirilmelidir.
KK numuneleri ayrı olarak hazırlanmış ana (stok) çözeltiler kullanılarak kalibrasyon
standartlarından bağımsız olarak standart katım yapılmalıdır.

KK numuneleri, kalibrasyon eğrisine karşı analiz edilir, elde edilen derişimler

beklenen değer ile karşılaştırılır. Doğruluk, beklenen değerin yüzdesi olarak rapor edilmelidir.
Doğruluk, tek bir çalışma içerisinde (çalışma içi doğruluk) ve farklı çalışmalarda (çalışmalar
arası doğruluk) elde edilen KK numunelerinin değerlerine göre değerlendirilmelidir. Tek bir
analiz dizinindeki zamanla oluşacak herhangi sistematik farklanmanın değerlendirmesini
yapabilmek için, KK numunelerinin doğruluğunu ve hassaslığını, çalışma örneklerinin
prospektif analitik çalışmasına eşdeğer bir boyutta en azından birinde gösterilmesi önerilir.7

Çalışma-içi Doğruluk (Within-run accuracy): Çalışma-içi doğruluk; kalibrasyon eğrisi

aralığını kapsayan 4 derişim düzeyinin, seviye başına LLOQ, LLOQ değerinin üç katı (düşük
KK), kalibrasyon eğrisi aralığının yaklaşık %30-50’si (orta KK) ve en üst kalibrasyon eğrisi
aralığının en az %75’inde (yüksek KK) olmak üzere en az 5 örnek analiz ederek
belirlenmelidir. Ortalama derişim, KK numuneleri için gerçek değerlerin %15’i olmalıdır,
ancak LLOQ gerçek değerin %20’si içinde olmalıdır.

Çalışmalar-arası Doğruluk (Between–run accuracy): Validasyonda çalışmalar-arası

doğruluk; LLOQ, düşük, orta ve yüksek KK numuneleri en az iki farklı günde en az üç
çalışmadan elde edilen analiz sonuçları dikkate alınarak değerlendirilmelidir. Ortalama
derişim, KK numuneleri için gerçek değerlerin %15’i olmalıdır, ancak LLOQ gerçek değerin
%20'si içinde olması gerekir.

Bildirilen yöntem validasyon verisi, doğruluğun ve hassaslığın belirlenmesi, hataların

bariz olduğu ve belgelendiği durumlar dışında elde edilen tüm sonuçları içermelidir.7

İlaçların İnsan Kullanımına İlişkin Teknik Gerekleri Uyumlaştırma Uluslararası Konseyi

(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals
for Human Use, ICH)’ne göre doğruluk; analitik prosedürün belirtilen aralığı boyunca
saptanmalıdır:5

Analiz (Deney, assay): Doğruluğu belirlemenin çeşitli yöntemleri mevcuttur:

a) Saflığı bilinen bir analite analitik bir prosedürün uygulanması (örneğin, referans
materyal),
b) Önerilen analitik prosedürün sonuçlarının, doğruluğu belirtilmiş ve/veya tanımlanmış
ikinci iyi karakterize edilmiş prosedürün sonuçları ile karşılaştırılması,
c) Kesinlik, doğrusallık ve özgüllük belirlendikten sonra doğruluk ölçülebilir.
Safsızlıklar (Nicelleme, Impurities): Doğruluk, safsızlıkların bilinen miktarları ile standart
katımı yapılmış numuneler üzerinde (ilaç maddesi ilaç ürünü) değerlendirilmelidir.
Belirli safsızlıkların ve/veya bozunma ürünlerinin numunelerinin alınmasının mümkün
olmadığı durumlarda, bağımsız bir prosedürle elde edilen sonuçların karşılaştırılması kabul
edilebilir. İlaç maddesinin yanıt (tepki, response) faktörü kullanılabilir. Majör analit ile ilgili
olarak, her durumda, tekli veya toplam safsızlıkların (örneğin ağırlık/ağırlık veya alan
yüzdesi) nasıl belirleneceği açık olmalıdır.5

5.1.9. Kesinlik (Precision)

Analitik bir prosedürün kesinliği, aynı homojen numunenin belirtilen şartlar altında çoklu
örneklemesinden elde edilen bir dizi ölçüm arasında uyum (dağılım derecesi) olduğunu
gösterir. Kesinlik; tekrarlanabilirlik, ara kesinlik ve tekrarüretilebilirlik olarak üç düzeyde
değerlendirilebilir. Kesinlik; homojen, gerçek (otantik) örnekler kullanılarak araştırılmalıdır.
Ancak, homojen bir numune elde etmek mümkün değilse, yapay olarak hazırlanmış
numuneler veya numune çözeltisi kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Analitik prosedürün
kesinliği; genellikle, bir dizi ölçümün varyansı, standart sapması veya varyasyon katsayısı
olarak ifade edilir.

Tekrarlanabilirlik (Repeatability): Tekrarlanabilirlik; kısa bir zaman aralığında aynı

çalışma koşulları altındaki kesinliği ifade eder, aynı zamanda, deneme-içi (intra assay) olarak
da adlandırılır.
Tekrarlanabilirlik, aşağıdaki çalışmalar yapılarak değerlendirilmelidir:

a) Prosedür için belirtilen aralığı kapsayan her biri 3 derişim/3 paralel gibi en az 9 analiz,
veya
 b) %100 test derişiminde en az 6 analiz.
Ara Kesinlik (Intermediate Precision): Ara kesinlik; farklı günler, farklı analistler, farklı
ekipmanlar vb. ile gerçekleştirilen çalışmalar laboratuvarlar içindeki varyasyonları ifade eder.
Ara kesinliğin ne ölçüde sağlanacağı, prosedürün uygulanacağı koşullara bağlıdır.
Rastgele olayların analitik prosedürün kesinliği üzerine etkileri belirlenmelidir. İncelenecek
tipik değişkenler; günler, analistler, ekipman vb. içerir. Bu etkileri tek tek incelemek gerekli
değildir. Deneysel bir tasarım kullanımı önerilir.

Tekrarüretilebilirlik (Reproducibility): Tekrarüretilebilirlik laboratuvarlar arasındaki

kesinliği ifade eder (ortak çalışmalar, genellikle yöntemin standardizasyonu için uygulanır).
Numune ve safsızlıkların nicel tayinine ilişkin testlerin geçerliliği, kesinliğin araştırılmasını
içerir. Tekrarüretilebilirlik, laboratuvarlar arası bir deneme yoluyla değerlendirilir. Bir analitik
prosedürün standartlaştırılması durumunda, örneğin, farmakopelerde prosedürlerin dâhil
edilmesi için tekrarüretilebilirlik göz önüne alınmalıdır.

Önerilen Veriler: Araştırılan her bir kesinlik tipi için standart sapma, bağıl (rölatif) standart
sapma (değişim, varyasyon katsayısı) ve güven aralığı bildirilmelidir.5
EMEA’ya göre analitik yöntemin kesinliği; analitin tekrarlanan bireysel ölçümlerinin
yakınlığı olarak tanımlamaktadır. Kesinlik, varyasyon katsayısı (VK/CV) olarak ifade edilir.
LLOQ, düşük, orta ve yüksek KK numuneleri için, tek bir çalışma içerisinde ve farklı
çalışmalar arasında, yani doğruluğun gösterilmesi için olduğu gibi aynı çalışmalar ve verileri
kullanarak kesinlik gösterilmelidir.7
Çalışma-içi Kesinlik (Within-run precision): Validasyonda çalışma içi kesinlik için LLOQ,
düşük, orta ve yüksek KK numunelerinde derişim başına en az beş numune olmalıdır. Çalışma
içi VK/CV değeri KK örnekleri için %15’i geçmemelidir, LLOQ %20’yi aşmamalıdır.

Çalışmalar-arası Kesinlik (Between–run precision): Validasyonda çalışmalar-arası kesinlik

için LLOQ, düşük, orta ve yüksek KK numuneleri en az iki farklı günde ve en az üç
çalışmadan elde edilen sonuçlara göre değerlendirilmelidir. Çalışmalar arası VK/CV değeri
KK numuneleri için %15’i geçmemelidir, LLOQ %20’yi aşmamalıdır.7

5.1.10. Seyreltme Tamlığı (Dilution Integrity)

Numunelerin seyreltilmesi doğruluğu ve hassasiyeti etkilememelidir. Seyreltmenin

tamlığı matriske ULOQ’un üzerinde bir analit derişiminin standart katımı ve bu numuneyi kör
matriks ile sulandırarak gösterilmelidir (Seyreltme faktörü başına en az beş tayin
yapılmalıdır). Doğruluk ve hassasiyet; belirlenen kriterler yani ±%15 içinde olmalıdır.
Seyreltme tamlığı, çalışma numunelerine uygulanan seyreltmeyi kapsamalıdır.7

5.1.11. Matriks Etkisi (Matrix Effect)

Matriks etkisi; kütle spektrometrik yöntemlerle en az 6 gönüllüden (donörden) alınan

boş matriks kullanılarak araştırılmalıdır. Matriks havuzu kullanılmamalıdır.

Her bir analit ve iç standart için matriks faktörü, her bir matriks lotu için
hesaplanmalıdır. Bu hesaplama, matriks varlığındaki pik alanının (kör matriksin analit
katıldıktan sonra ekstaksiyonu yapılıp ölçülen pik alanı), matriks yokluğundaki pik alanına
(söz konusu analitin saf çözeltisinin pik alanı) oranıyla gerçekleştirilir. Bunun yanı sıra iç
standart yoluyla normalize edilmiş matriks faktörü de hesaplanmalıdır. Burada da, analitin
matriks faktörü iç standart matriks faktörüne bölmek suretiyle hesaplanır. 6 matriks lotundan
elde edilen iç standart ile normalize edilerek hesaplanmış matriks faktörünün bağıl standart
sapması değeri %15’ten büyük olmamalıdır. Bu sapma düşük (LOQ derişiminden fazla) ve
yüksek (ULOQ değerine yakın bir bölge) derişim düzeylerinde yapılmalıdır.

Bu yaklaşım, örneğin online numune hazırlığı durumunda kullanılamazsa, lottan lota

verilen cevabın değişkenliği değerlendirilmelidir. LLOQ’un maksimum 3 katı ve ULOQ’nun
yakınında derişim seviyesinde standart katımlı en az 6 lot matriksi analiz edilmelidir.
Validasyon raporunda, analitin ve IS'nin pik alanları ve her bir numune için hesaplanan
derişim bulunmalıdır. Derişim için hesaplanan genel VK/CV, %15’ten fazla olmamalıdır.

Matriksi elde etmek zorsa, 6’dan az farklı matriks kullanılabilir, ancak bu

gerekçelendirilmelidir. Bununla birlikte, matriks etkileri hala araştırılmaktadır. Deneklere
veya hayvanlara uygulanacak enjeksiyon için bir formülasyon matriks etkilerinden sorumlu
olduğu bilinen polietilen glikol veya polisorbat gibi dış kirleticileri içeriyorsa, matriks etkileri
kör matrikse ek olarak bu dış kirleticileri içeren matriks ile incelenmelidir. Bu
değerlendirmede kullanılan matriks, dış kirleticilerin metabolize olmadığı veya in vivo olarak
dönüşümü gösterilmediği sürece dış kirletici, kişilerden veya hayvanlardan elde edilmelidir.
Yardımcı maddelerin etkisi, MF’nin belirlenmesi veya dış kirletici içermeyen kör matriks ile
yüksek derişimlerde çalışma örneğinin seyreltme çalışmasıyla incelenebilir. Normal matriksin
yanı sıra hemolizli ve hiperlipidemik plazma örnekleri gibi diğer numuneler üzerindeki
matriks etkilerinin araştırılması önerilir. Özel popülasyondan (böbrek veya karaciğer
yetersizliği olan popülasyonlar gibi) örnekler analiz edilmek isteniyorsa, bu popülasyonlardan
matriks kullanarak matriks etkilerini incelemek önerilir.7

5.1.12. Taşınma (Carry-Over)

Yöntemi geliştirme sırasında taşınma parametresi ele alınmalı ve olabildiğince

küçültülmelidir. Validasyon çalışmalarında taşınma, yüksek derişimdeki bir numuneden veya
en yüksek kalibrasyon standardından sonra kör örnek enjekte edilerek değerlendirilmelidir.
Yüksek derişimde olan standarttan sonra çalışılan kör örnek (LLOQ) %20’sinden ve iç
standardın %5’inden büyük olmaması gerekmektedir. Taşınmanın kaçınılmaz olduğu
görülüyorsa, çalışma örnekleri rastgele seçilmemelidir. Validasyon sırasında özel önlemler
düşünülmeli, test edilmeli, doğruluk ve hassaslığı etkilememesi için çalışma numunelerinin
analizi sırasında uygulanmalıdır. Yüksek derişimde olması beklenen örneklerin ardından kör
örneklerin enjeksiyonu ve sonrasında diğer örneklerin analizi şeklinde olmalıdır.7

5.1.13. Kararlılık (Stability)

Kararlılığın değerlendirilmesi, numune hazırlama ve numune analizi sırasında yapılan her

adımın yanı sıra kullanılan saklama koşullarının analit derişimini etkilememesi için
gerçekleştirilmelidir.

Analitik yöntemdeki her basamak için kararlılık sağlanmalıdır, yani, numune matriksi,
antikoagülan, koruma malzemeleri, depolama ve analitik koşullar gibi kararlılık testlerine
uygulanan koşulların gerçek çalışma örnekleri için kullanılanlara benzer olması gerekir.
Analitin çalışılan matriksteki kararlılığı, düşük ve yüksek KK numuneleri (kör matrikse
maksimum 3 kat LLOQ ve ULOQ yakınında standart katımı yapılmış) kullanılarak
hazırlandıktan hemen sonra ve saklama koşullarından sonra analiz edilerek değerlendirilir.
KK numuneleri, yeni hazırlanmış kalibrasyon standartlarından elde edilen bir kalibrasyon
eğrisine karşı analiz edilir ve elde edilen derişimler gerçek derişimlerle karşılaştırılır. Her
seviyedeki ortalama derişim, beklenen derişiminin ±%15’i dâhilinde olmalıdır.
 Ana (stok) ve çalışma çözeltilerinin kararlılığı, dedektörün doğrusallığı ve ölçüm
aralığı dikkate alınarak uygun bir seyreltme ile test edilmelidir. Kararlılık çalışmalarında
farklı zaman periyotlarında depolama koşullarının uygunluğu araştırmalıdır.

• Analit ve iç standartın stok ve çalışma çözeltilerindeki kararlılığı,

• Matriksteki analitin dondurucu saklama koşullarından oda sıcaklığına veya numune çalışma
sıcaklığına kadar dondurulması ve çözülmesi,

• Analitin oda sıcaklığında veya numune çalışma sıcaklığında matrikste kısa süreli kararlılığı,

• Dondurucuda depolanan matriksteki analitin uzun süreli stabilitesi kararlılık testleri olarak
çalışılmalıdır.

Ayrıca mümkünse aşağıdaki testler de yapılmalıdır:

• İşlem görmüş numunenin oda sıcaklığında veya çalışma sırasında kullanılacak depolama
koşullarında (kuru ekstre veya enjeksiyon fazında) kararlılığı,

• İşlem görmüş numunenin, enjektör veya oto-örnekleyici sıcaklığında cihaz üstü/otomatik

örnekleyicideki kararlılığı.

Donma/çözülme kararlılığı ile ilgili olarak: KK numuneleri dondurucuda istenilen sıcaklıkta

dondurularak saklanır ve bundan sonra oda veya işlem sıcaklığında eritilir. Erimenin
tamamlanmasından sonra, numuneler tekrar aynı koşullar uygulanarak yeniden dondurulur.
Her devirde, numuneler çözülmeden önce en az 12 saat donmuş olmalıdır. Dondurma-
çözülme kararlılığındaki döngü sayısı, çalışma numunelerinin dondurma/çözülme
döngülerinin sayısına eşit veya bundan fazla olmalıdır.

Dondurucuda depolanan matriksteki analitin uzun süreli kararlılığı ile ilgili olarak: KK
numuneleri, aynı saklama koşulları altında ve en azından çalışma numuneleri ile aynı süre
boyunca dondurucuda saklanmalıdır. Küçük moleküller için, bir “Bracket Tasarımı”
uygulamak uygun olabilir. Örneğin -70°C ve -20°C’de kararlılığın kanıtlandığı durumda,
aradaki sıcaklıklarda kararlılığın araştırılması gerekli değildir.

“Bracket Tasarımı”; ana kılavuza göre sözlükte tanımlandığı gibi belirli tasarım
faktörlerinin uçlarındaki örneklerin tam bir tasarımda olduğu gibi tüm zaman noktalarında test
edilmesini sağlayan bir kararlılık çizelgesinin tasarlanmasıdır. Tasarım, ara seviyelerin
kararlılığının, test edilen aşırılıkların kararlılığı ile temsil edildiğini varsayar. Bir tasarımın
kullanılması, test için seçilen kuvvetlerin veya kap boyutlarının ve/veya dolgularının
kesinlikle aşırı olduğu gösterilemiyorsa uygun sayılmaz. Büyük moleküller (peptitler ve
proteinler gibi) için, çalışma örneklerinin depolandığı her sıcaklıkta kararlılık çalışılmalıdır.
Çalışma örnekleri KK örneklerine ek olarak kullanılabilir, ancak örneklerin derişimi tam
olarak bilinmediğinden, sadece çalışma örneklerinin kullanımı yeterli sayılmamaktadır. Uzun
süreli kararlılığın değerlendirilmesinin sonuçları, çalışma raporu hazırlanmadan önce mevcut
olmalıdır.

Ana (stok) ve çalışma çözeltilerinin kararlılığı konusunda: Çalışma çözeltilerinin her

bir derişim seviyesinde kararlılığını incelemek gerekli değildir, “Bracket Tasarımı”
kullanılabilir. Analitin kararlılığı gösterildiğinde aynı koşullar altında herhangi bir izotop
değişim reaksiyonu meydana gelmediği gösterilirse, kararlı izotop işaretli iç standartların
kararlılığını incelemek gerekmez.

Çok analitli bir çalışmada ya da biyoeşdeğerlik çalışmalarına da, tüm analitleri içeren
matriksteki analitlerin kararlılığına dikkat edilmelidir. Analitik yöntem ile elde edilen
derişimlerin numunelerin kan örneklemesi ve depolamadan önce hazırlanmasının hemen
ardından numune alınan matriksteki analitin kararlılığına dikkat edilmelidir. Olgudan alınan
kan örneklemesinden hemen sonra ve depolama öncesi hazırlık işlemlerinde, analitin anlık
olarak olgudaki derişimi yansıtmasını sağlamak için matrikste analitin kararlılığına dikkat
edilmelidir. Analitin yapısına bağlı olarak kararlılığın gösterimi gerekli olabilir.7

5.1.14. Sağlamlık/Dayanıklılık (Robustness)

Bir analitik prosedürün sağlamlığı, yöntem parametrelerinde kasıtlı küçük değişikliklerden

etkilenmeden kalma kapasitesinin bir ölçüsüdür ve normal kullanım sırasında güvenilirliğinin
bir göstergesidir. Sağlamlığın değerlendirilmesi, geliştirme aşamasında dikkate alınmalı ve
incelenen prosedürün türüne bağlı olmalıdır. Yöntemin parametrelerindeki kasıtlı
değişikliklerle ilgili bir analizin güvenilirliğini göstermelidir.

Ölçümler analitik koşullarda değişikliklere açıksa, analitik koşullar uygun bir şekilde
kontrol edilmeli veya prosedürde bir uyarı niteliğinde beyan bulunmalıdır. Sağlamlığın
değerlendirilmesinden elde edilen bir çıkarım, analitik prosedürün geçerliliğinin kullanılınca
muhafaza edilmesini sağlamak için bir dizi sistem uygunluğu parametresinin (örn.,çözünürlük
testi) oluşturulması olmalıdır.

Tipik değişkenlere örnekler:

  analitik çözümlerin stabilitesi,
 ekstraksiyon zamanı,
Sıvı kromatografisinde tipik değişken örnekleri:

o mobil fazdaki pH değişikliklerinin etkisi,

o mobil faz bileşimindeki değişimlerin etkisi,
o farklı kolonlar (farklı partiler ve / veya tedarikçiler),
o sıcaklık,
o akış hızı.
Gaz kromatografisinde tipik değişken örnekleri:

 farklı kolonlar (farklı partiler ve / veya tedarikçiler),

 sıcaklık,
 akış hızı.5

5.2. KISMİ VALİDASYON

Valide edilmiş bir analitik yöntem üzerinde ufak değişiklikler olduğu durumlarda,
uygulanan değişikliklerin niteliğine bağlı olarak tam validasyon gerekmeyebilir. Kısmi
validasyona ihtiyaç duyulabilecek durumlar; biyoanalitik yöntemin başka bir laboratuvara
aktarılması, ekipman değişikliği, kalibrasyon derişim aralığı, sınırlı numune hacmi, başka bir
matriks veya tür, antikoagülan değişimi, numune işleme prosedürü, saklama koşulları vb.
olabilir. Tüm değişiklikler rapor edilmeli, tekrar validasyonun kapsamı veya kısmi geçerliliği
gerekçelendirilmelidir. Kısmi validasyon, çalışma-içi kesinlik ve doğruluğun
belirlenmesinden çok az bir aralığa kadar, neredeyse tam validasyona kadar değişebilir.7

5.3. ÇAPRAZ VALİDASYON

Farklı yöntemleri kullanarak çalışma içi ve çapraz çalışma verilerini karşılaştırarak ya da

aynı yöntemi kullanarak farklı laboratuvarlarda yapılan çalışmalarla verilerin karşılaştırılması
gerekir ve uygulanan analitik yöntemlerin çapraz geçerliliği yapılmalıdır. Numune hazırlama
farklılıkları veya başka bir analitik yöntemin kullanılması, çalışma alanları arasında farklı
sonuçlar doğurabilir. Çapraz validasyon, mümkünse analiz edilen çalışma örneklerinin
öncesinde yapılmalıdır. Çapraz validasyon için, aynı KK numuneleri veya çalışma örnekleri
her iki analitik yöntemle analiz edilmelidir. KK örnekleri için, farklı yöntemlerle elde edilen
ortalama doğruluk %15’in altında olmalıdır fakat gerekçelendirilirse daha geniş olabilir.
Çalışma örnekleri için, elde edilen iki değer arasındaki fark; ortalamanın %20’si, tekrarların
en az %67’si içinde olmalıdır. Çapraz validasyonun sonucu, elde edilen verilerin güvenilir
olup olmadığını ve karşılaştırılabilir olup olmadıklarının belirlenmesinde kritik önem taşır.7
EK-1 UYGULAMA ÖRNEĞİ

Aşağıda idrarda morfin tayinine yönelik analitik yöntem validasyonu uygulama örneği
sunulmuştur.

1-Seçicilik

6 kör örneğin her birisinin belirlenmiş olan yöntem koşullarında analizi sağlanır. Kütle
spektrometresi kullanılıyorsa 50 ng/ml, UV dedektör gibi bir sistem kullanılıyorsa 10 mg/ml
gibi derişimde matriks içine standart katılarak kromatogram gözlenir. Matriks içerisinde daha
önceden elde edilmiş olan kromatogramda herhangi bir sinyalle morfin pikinin çakışıp
çakışmadığı kontrol edilir.

 Çakışma varsa, özgüllük/seçicilik yok demektir. Numune ya da yöntem geliştirmesi

yapmak gerekebilir.
 Çakışma yoksa, ilgili pikin en az zemin düzeyinde pik ayrımı (baseline resolution)
olması gerekir. Eğer bu durum sağlanırsa, yöntemin seçicilik/özgüllük validasyon
kriteri yönünden yeterli olduğu söylenebilir. (Bölüm 2.4.Şekil 3.)
2- Belirtme Alt Sınırı, Saptama Alt Sınırı, Kalibrasyon Eğrisi, Aralık, Doğrusallık

Belirli derişimlerde çalışılan örneklere karşı elde edilen alan değerleri aşağıdaki
tablodaki gibidir. Farklı bir deyişle x bağımsız değişkenine karşı y bağımlı değişkeninin
verileri toplanıp kalibrasyon eğrisi çizilir. Kalibrasyon eğrisi korelasyon katsayısı (R 2) ile
kontrol edilir. Korelasyon katsayısı, derişim ve sinyal arasındaki ilişkinin derecesini
gösterir ve 1’e yakın olması istenir. Rehberlere göre kabul edilen değerler değişmekle
birlikte 0.99’a yakın değerler uygun değerlerdir. En az 5 derişimde çalışılması önemlidir.
 Bu değerlere göre, 25-2000 ng/ml arasında çizilen kalibrasyon eğrisi ve R²=0.9903
olduğu görülmektedir. Ancak bu kalibrasyon eğrisinin geçerli olması için yeterli değildir.
Kalibrasyon eğrisi denklemi, her bir değişken için % bağıl hatalar yönünden de test
edilmelidir.

y=25.836x+556.7 denkleminde y yerinde kromatogramdan bulunan alan değerleri konularak

Xtahmin değerleri elde edilir.

(𝑋𝑡𝑎ℎ𝑚𝑖𝑛−𝑋)
%Hata= 𝑥100 olarak hesaplanır.
𝑋

Kalibrasyon standartlarının geri hesaplanan derişimleri, gerçek değerin ±%15’i,

LLOQ’nun ±%20’si dâhilinde olması gerekir. Bu nedenle 25 ng/ml derişim değeri
kalibrasyon eğrisi aralığından çıkarılmalı ve işlemler tekrarlanmalıdır.

60000
y = 25.684x + 753.2
50000 R² = 0.9893

40000

30000

20000

10000

0
0 500 1000 1500 2000 2500
 R²=0.9893 olmasına rağmen % bağıl hatalar yönünden test edildiğinde 50 ng/ml’lik
derişimde halen %27.3 bağıl hata olduğu saptanmıştır. Bu durumda standartların
başlangıç değerleri 100 ng/ml’den başlamalıdır.

60000
50000 y = 25.577x + 893.19
R² = 0.9873
40000
30000
20000
10000
0
0 500 1000 1500 2000 2500

Bu değerler için Excel’de 5x2 hücre seçilerek =DOT(B2:B7;A2:A7;1;1) komutu ile Linest
fonksiyonu kullanılır ve aşağıdaki tablo elde edilir.
 Eğim Kesişim (İntercept)
Eğimdeki hata Kesişimdeki hata (İntercept)
Regresyon Regresyondaki hata
Fisher F Serbestlik derecesi
Regresyon toplam Artık kareler toplamı
kareler

LOD ve LOQ’nun teorik olarak hesaplanması Validasyon 5.1.3. ve 5.1.4.

bölümlerinde ayrıntılı olarak anlatılmıştır. Kullanılan yöntemde anlamlı ve ölçülebilir bir kör
sinyali elde edilmesi mümkün değil ise; kalibrasyon eğrisine dayalı olarak LOD ve LOQ
hesaplanarak tahmin edilebilir. Bu işlemler için; kalibrasyon eğrisinin, regresyon çizgisinin
artık (residual) standart sapması veya regresyon çizgilerinin y-kesişim (intercept) standart
sapması, standart sapma olarak kullanılabilir. Buna göre;

𝟑.𝟑(𝑺𝒚/𝒙) 𝟑.𝟑(𝑺𝒂)
LOD= LOD=
𝒃 𝒃
𝟏𝟎(𝑺𝒚/𝒙) 𝟏𝟎(𝑺𝒂)
LOQ= LOQ= olarak iki farklı şekilde LOD ve LOQ değerleri
𝒃 𝒃
hesaplanabilir. Her iki yöntemde LOD ve LOQ değerlerini teorik olarak tahmin etmede
kullanılabilir. Tahmin edilen değerler, matriks ortamına katılarak çalışılmalı ve
doğrulanmalıdır.

Aralık, numunedeki miktarı belirli doğruluk ve kesinlikle saptayabildiğimiz derişim ile

sinyal arasındaki ilişkiyi gösteren bölgedir. Bu örnek için çalışma aralığı 100-2000 ng/ml
olduğu söylenebilir.

3-Doğruluk

Matriks ortamına morfin standardı düşük, orta ve yüksek olacak şekilde 3 değerde
katılır. Bu çalışma için 100, 500, 1000 ng/ml değerleri seçilmiştir. Bu katılan numunelerdeki
sinyal değerleri kalibrasyon eğrisi üzerinden hesaplanır ve teorik olarak katılan değerle
karşılaştırılır. Geri kazanımın farklı günlerdeki dağılımı izlenir.
 4- Kesinlik (ANOVA)

Kesinlik, tekrarlanabilirliğin bir göstergesidir. Laboratuvarda 3 farklı yöntemle, 3

farklı kişiyle ya da aynı kişi tarafından 3 farklı günde aynı numuneden 3’er kez analiz
yapılmış olsun. Laboratuvar tekrarlanabilirliği ve laboratuvar arada kesinliğini bulabilmek
için standart referans materyalden çıkılarak, 1250 ng/ml morfin içeren numune kullanılarak
laboratuvarda çalışan 3 kişi, aynı numuneyi 3’er kez analizleyerek morfin derişimi (ng/ml)
için aşağıdaki sonuçlar elde edilmiş olsun:

Bu verilere göre; laboratuvarın tekrarlanabilirliği ve laboratuvar arada kesinliği (inter-

presicion) değeri, tek faktörlü ANOVA istatiksel komutu ile Excel’de hesaplama yapılabilir.
Elde edilen sonuçlar:

Sr=√𝑀𝑆𝑊𝑖𝑡ℎ𝑖𝑛 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑠= 44.34

Sbet=√(𝑀𝑆𝑏𝑒𝑡𝑤𝑒𝑒𝑛 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑠 − 𝑀𝑆𝑤𝑖𝑡ℎ𝑖𝑛 𝐺𝑟𝑜𝑢𝑝𝑠)/3= 23.63

 SI= √((𝑆𝑟)2 + (𝑆𝑏𝑒𝑡)2 )/3) =50,24 Laboratuvar tekrarlanabiliriliği olarak
değerlendirilebilir.

Kişilerin aynı numune için 3 tekrarlı yapmış olduğu analiz sonuçlarına göre, elde
edilen sonuçlar arasında önemli bir farklanma olmadığını Fcrit>Fdeneysel (5,14>1.85)’den
büyük olması ile anlamaktayız (%95 güven aralığı).

5-Seyreltme Tamlığı

Kimi zaman çalışma aralığının dışında numune derişimleri ile karşılaşılabilir.

Numune, matriks (kör) ya da mobil faz ile seyreltilerek çalışılmalıdır. Elde edilen yeni çözelti
derişiminin sinyali ilgili aralığın içinde saptanmalıdır. Seyreltme faktörü ile çarpılarak sonuç
verilmelidir. 2000 ng/ml üzerinde çıkan bir değer, 1:10 oranında seyreltilerek tekrar
çalışıldığında kalibrasyon eğrisinde 528 ng/ml sonuç elde edilmiştir. Raporda 528 ng/ml x
10=5280 ng/ml olarak sonuç verilmelidir.

6-Matriks Etkisi

Morfin standardı için kullanılan çözgen genellikle metanoldür. Metanol içerisinde

morfine ait bir kalibrasyon eğrisi çizilir. İdrar matriksi içerisine de morfin belirli derişimlerde
katılarak ikinci kalibrasyon eğrisi çizilir. Bu iki eğrinin eğimleri oranı matriks etkisini verir.

Metanole ait kalibrasyon eğrisi: y1=b1x1+a1

Matriks içerisinde çizilen kalibrasyon eğrisi: y2=b2x2+a2 olsun.

y2/y1 oranı matriks etkisini, b2/b1 oranı kalibrasyon duyarlılığını verir.

7-Kararlılık

Düşük ve yüksek KK numuneleri (100 ve 1000 ng/ml standart katımı yapılmış)

hazırlandıktan sonra donma/çözülme kararlılığı ile ilgili olarak numuneler dondurucuda -
200C’de dondurulur ve sonrasında oda sıcaklığında eritilir. Erimenin tamamlanmasından
sonra, numuneler tekrar aynı koşullar uygulanarak yeniden dondurulur. Aşağıdaki tablodaki
değerler 3 dondur-erit döngüsü sonucunda elde edilmiştir. Bu değerlere göre; 100 ng/ml’lik
düşük KK numunesi için 3.döngü ±%15 hata sınırları dışında kalmış ve bu koşullarda kararlı
olmadığı görülmüştür.
KAYNAKLAR

1. The Fitness for Purpose of Analytical Methods, A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics, 2014. URL: https://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf
/MV_guide_2nd_ed_EN.pdf Son Erişim Tarihi: 20.07.2017

2. What is IQ OQ PQ, URL: http://www.rscal.com/what-is-iq-oq-pq/ Son Erişim Tarihi:

20.07.2017

3. Guidelines On Validation – Appendix 6, Validation on Qualification of Systems, Utilities

And Equipment, World Health Organization 2016, Working document QAS/16.673 June
2016. URL: http://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_assurance/
Guidelines_validation_qualification_systems-utilities-equipment_QAS16-673.pdf?ua=1 Son
Erişim Tarihi: 20.07.2017

4. Guidelines for Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and
Veterinary Use Annex 15: Qualification and Validation. European Commission Directorate-
General for Health and Food Safety, 2015 URL: https://ec.europa.eu/health/sites/
health/files/files/eudralex/vol-4/2015-10_annex15.pdf Son erişim Tarihi: 20.07.2017

5. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for

Pharmaceuticals for Human Use (ICH), Validation of Analytical Procedures: Text And
Methodology Q2 (R1) URL: https://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/
ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf Son Erişim Tarihi:
20.07.2017

6. Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods, Food and Drug

Administration (FDA) 1994 URL: https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/
UCM134409.pdf Son Erişi Tarihi: 20.07.2017

7. Guideline on bioanalytical method validation, European Medicines Agency (EMEA), 2011

URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/
2011/08/WC500109686.pdf Son Erişim Tarihi: 20.07.2017
View publication stats