DIAGN. LAB.

, 1978, XIV, nr 5

TERESA LESZCZYŃSKA

PRÓBA OZNACZANIA AKTYWNOŚCI FOSFATAZY ZASADOWEJ,

ALDOLAZY FRUKTOZO-DWUFOSFORANOWEJ, DEHYDROGENAZY
MLECZANOWEJ, DEHYDROGENAZY (NADP) IZOCYTRYNIANOWEJ
I AMINOPEPTYDAZY LEUCYNOWEJ W MOCZU PO ZAGĘSZCZENIU
I ODSOLENIU NA SEPHADEXIE G-25

Z Zakładu Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytutu Medycyny Pracy w Łodzi

Podjęto próbę oznaczania aktywności następujących enzymów w mo-

czu po zagęszczeniu i odsoleniu na Sephadexie G-25: fosfatazy zasado-
wej, aldolazy fruktozo-dwufosforanowej, dehydrogenazy mleczanowej,
dehydrogenazy (NADP) izocytrynianowej i aminopeptydazy leucynowej.
Próba oznaczenia aktywności wymienionych enzymów, po dializie moczu
jak również po sączeniu molekularnym na Sephadexie G-50 Medium,
nie dały zadowalających wyników. Wykazano, że w przeciwieństwie
do danych literaturowych można stwierdzić mierzalną aktywność aldo-
lazy fruktozo-dwufosforanowej i dehydrogenazy (NADP) izocytrynia-
nowej także w moczu ludzi zdrowych. Dla grupy 11—27 osób zdrowych
wyznaczono zakres zmienności fizjologicznej i dla 10 osób wyliczono
wartości klirensów enzymatycznych pięciu oznaczanych eznymów jako
odsetek klirensu kreatyninowego. |

Mimo że pierwszy pomiar aktywności a-amylazy w moczu został prze-

prowadzony przez Wohlgemuta już w 1909 roku, to jednak wykorzysta-
rie badania aktywności innych enzymów dla celów diagnostycznych nie
nabrało aż do lat ostatnich większego znaczenia. Na przestrzeni kilku
ubiegłych lat wielu autorów podjęło tę tematykę, wykazując przydatność
oznaczania aktywności enzymów w moczu dla diagnostyki, śledzenia prze-
biegu schorzeń nerek (4,5, 7, 8,9, 14, 17, 18,19), a także jako wskaźnik
nasilenia wczesnej i opóźnionej reakcji alergicznej (15, 16).
Oznaczanie w moczu aktywności enzymów, których źródłem jest suro-
wica, komórki kanalików nerkowych, komórki gruczołów płciowych i na-
błonek wyścielający drogi moczowe, utrudnione jest przez dwa czynniki.
Pierwszym i podstawowym jest występowanie w moczu naturalnych in-
hibitorów aktywności wielu enzymów. Drugim czynnikiem utrudniają-
cym wykorzystanie enzymów moczu dla celów diagnostycznych jest niska
aktywność (13). Być może te trudności sprawiły, że dotychczas nie udało
się oznaczyć aktywności dehydrogenazy (NADP) izocytrynianowej i aldo-
lazy fruktozo-dwufosforanowej w moczu ludzi zdrowych (16, 17).
Celem obecnej pracy było ustalenie postępowania analitycznego, umoż-
liwiającego pomiar w moczu aktywności następujących enzymów: fosfo-
hydrolazy monoestrów ortofosforanowych (3.1.3.1.)-fosfatazy zasadowej
(AP), D-gliceraldehydo-3-fosforano-liazy fruktozo-1,6-dwufosforanu (4.1.
2.13)-aldolazy fruktozo-dwufosforanowej (Ald), oksydoreduktazy D-mle-
czanu: NAD (1.1.1.27)-dehydrogenazy mleczanowej (LDH), oksydoreduk-
tazy (dekarboksylującej) treo-D,-izocytrynianu: NADP (1.1.1.42.)-dehy-
 282 | T. Leszczyńska Nr 5

drogenazy (NADP) izocytrynianowej (ICDH) i hydrolazy 1-leucylopep-

tydu (3.4.1.1.)-aminopeptydazy leucynowej (LAP).
Podjęto także próbę ustalenia zakresu aktywności tych enzymów w mo-
czach ludzi zdrowych oraz wyliczenia fizjologicznych wartości klirensów
enzymatycznych. Zgodnie z nowoczesną interpretacją oznaczania aktyw-
ności enzymów w moczu (4) postuluje się bowiem wyrażenie aktyw-
ności enzymów jako odsetku klirensu kreatyninowego.

MATERIAŁ I METODY

Oznaczeń aktywności enzymów dokonywano w 11—27 (w zależności od

oznaczanego enzymu) dobowych zbiórkach moczu ludzi zdrowych. Po-
miary aktywności przeprowadzano bezpośrednio po zakończeniu zbiórki
Celem oddzielenia elementów morfotycznych zawartych w moczu, próbki
moczu o objętości 50 ml odwirowywano przez 10 min (3 000 obrotów/min).
Dla usunięcia naturalnych inhibitorów zawartych w moczu stosowano
trzy postępowania: dializę wg Dubacha (8), sączenie molekularne na Se-
phadexie G-50 Medium wg Wernera (21) oraz zagęszczanie i odsalanie
moczu na Sephadexie G-25 (1, 6).
Dializa wg Dubacha: 25 ml płynu znad osadu umieszczano w woreczku
dializacyjnym (Dialysierscshlauch Nr 38). Przed przystąpieniem do dia-
lizy woreczki były trzykrotnie zagotowywane w wodzie destylowanej
i przechowywane w niej do chwili oznaczeń w temperaturze 4 C. Bez-
pośrednio przed użyciem woreczki płukano w wodzie destylowanej i osu-
szano z zewnątrz. Dializę prowadzono przez 90 min wobec wody demine-
ralizowanej. W tak przygotowaonym moczu oznaczano aktywność en-
zymów. |
Sączenie molekularne wg Wernera: szklaną kolumnę o średnicy 1 cm
i długości 40 cm wypełniano odpowiednio przygotowanym Sephadexem
* G-50 Medium * do wysokości 14,5 cm. Objętość żelu w kolumnie wynosiła
11,6 cm”. Do kolumny wlewano 3 ml moczu zmieszanego z 2 ml roztworu
soli fizjologicznej. Pierwsze 5 ml wycieku z kolumny odrzucano, po czym
napełniano kolumnę dalszymi 6 ml roztworu soli fizjologicznej i wycie-
kający przesącz zbierano do oznaczeń.
Zagęszczanie moczu na Sephadexie G-25 Coarse przeprowadzono uży-
wajac lejkow Schotta 1G3 zgodnie z propozycją Adamkowskiego i wsp.
(1). Do trzech lejków Schotta, umieszczonych w probówkach plastikowych
wsypywano po 4 g sephadexu, a następnie wlewano po 15 ml moczu. Po
10 min umieszczano probówki z lejkami w wirówce i wirowano przez
20 min przy 2000 obrotów*min. Uzyskaną łączną objętość przesączu I
(około 18 ml) wlewano w równych objętościach do dwóch lejków Schotta
z których każdy był wypełniony 3 g sephadexu i po 10 min wirowano
przez 20 min w warunkach jak wyżej. Uzyskany przesącz II, wlewano
do lejka Schotta zawierającego tylko 1 g sephadexu i postępowano jak
wyżej. Uzyskiwano ostatecznie około 2,4 ml przesączu III, który podda-
wano dodatkowo odsoleniu na Sephadexie G-25 Fine.
Określanie moczu na Sephadexie G-25 Fine: 20 g sephadexu zalewano
100 ml wody destylowanej i gotowano przez 1 godzinę we wrzącej łaźni
wodnej. Do lejka Schotta 1G3 wlewano około 10 ml uzyskanej zawiesiny.
Lejek umieszczano w probówce plastikowej i wirowano przy 2000 obro-
* 20 = Sephadexu G-50 Medium zalewano 100 ml wody destylowanej i umiesz-
czano we wrzącej łaźni wodnej na jedną godzinę. Zawiesinę studzono a następnie
wypełniano nią kolumnę.
 ` №5. Próba oznaczania aktywności niektórych enzymów w moczu 283

_ tow/min przez 20 min. Na tak przygotowany sephadex nanoszono prze-

sącz III. Po 10 min odwirowywano w warunkach jak wyżej. Otrzymany
płyn służył do pomiaru aktywności enzymów. Celem ustalenia powta-
rzalności, charakteryzującej przedstawioną metodę analityczną dla próby
moczu zebranej od jednej i tej samej osoby (część dobowej zbiórki) i wy-
noszącej około 500 ml, powtarzano 6—8 krotnie całe postępowanie, obej--
mujące wszystkie etapy zagęszczania i odsalania a także końcowy pomiar
aktywności enzymów. Średnią aktywność (x) wyliczono jako średnią aryt-
metyczną z wszysktich przeprowadzonych pomiarów. Informację na te-
mat uzyskanych powtarzalności zamieszczono w tabeli I.
Podjęto próbę oznaczenia aktywności enzymów w próbkach przygoto-
wanych trzema, powyżej opisanymi, sposobami. Zestawienie metod enzy-
matycznych, którymi przeprowadzano oznaczenia, znajduje się w tabeli I.
„Stężenie kreatyniny w surowicy oznaczano metodą Folina-Wu a stężenie
kreatyniny w moczu metodą Folina (wg Homolki (10, 11)).

Tabela I. Wykaz metod stosowanych przy oznaczaniu aktywności enzymów

ow moczu

|
Enzym Metoda wg Warunki oznaczania Powtarzalność

AP Bessey'a i wsp. (2) metoda kolorymetryczna n =$8

37°C, kuwety 0 d=1 cm X = 262 mU/V
Spectrofotometr VSU2-P s/o = 22
Ald Brunsa (3) metoda kolorymetryczna n=6
37°C, kuwety 0 d=1 cm X = 26,04 mU/V
_# Spectrofotometr VSU2-P s%/o = 11
LDH. Warburga (20) test optyczny, 25°C, kuwety n=8
o d= 1 cm | х = 116 mU/V
Spectrofotometr Acta C III 5%. = 29
Beckman, czas zapisu 3 min.
ICDH Wolfsona 1 wsp. (22) test optyezny, 25°C, kuwety n= 8
оЧ = 1 см х = 169 mU/V
Spectrofotometr Acta C III s% = 31
Beckman, czas zapisu 3 min. |
LAP Jóscha i wsp. (12) metoda kolorymetryczna, n=8
250C, kuwety o d=1 cm X = 875 mU/V
Spectrofotometr Acta C IIl s*ad = 28
Beckman, czas zapisu 3 min.

Na podstawie pomiarów: aktywności enzymu w surowicy, aktywności

enzymu w dobowej zbiórce moczu, stężenia kreatyniny w surowicy oraz
stężenia kreatyniny w moczu, wyliczono ze wzoru:

aktywność enzymu w moczu X stężenie kreatyniny w surowicy ., 1000/

aktywność enzymu w surowicy X stężenie kreatyniny w moczu .
wartości klirensów dla poszczególnych enzymów, wyrażonych
w procen-
tach klirensu kreatyninowego.
Oznaczeń aktywności enzymów w surowicy dokonywano metodam
i za-
mieszczonymi w tabeli I; wartość absorpcji w metodach kolorymetrycz-
nych odczytywano w 1 cm kuwetach. |
284 T. Leszczyńska Nr 5

WYNIKI

W oparciu o badania przeprowadzone na grupie 11—27 osób zdrowych

ustalono zakresy zmienności fizjologicznej dla pięciu analizowanych en-
zymów w moczach po zagęszczeniu i odsoleniu na Sephadexie G-25. Ze-
brane wyniki przedstawiono w tabeli II.

Tabela II. Zmienność fizjologiczna aktywności enzymów w moczu po zagęszczeniu

i odsoleniu na Sephadexie G-25

_ | Zakres zmienności Wartość średnia i odchylenie

Enzym п | KmU/24 godz.) standardowe (mU/24 godz.)

AP 21 382, —2350 1078 + 455

Ald 22, 0—34,6 11,5 £ 8.5
LDH 1h N270—3920 2165 - 751
ТОРН 18) 169—833 362 + 255
ПАР (12) 405—3830 1598 = 972

Rozkład wartości klirensów enzymatycznych, wyrażonych jako odsetek

klirensu kreatyninowego wykazał charakter skośny. Rozkład ten scha-
rakteryzowano za pomocą mediany (Me) i odchylenia przeciętnego (d).
Wartości te zostały przedstawione w tabeli III.
Próby oznaczenia aktywności enzymów w moczu po dializie oraz po
sączeniu na Sephadexie G-50 Medium ne dały zadowalających wyników.
Uzyskano wartości absorpcji na granicy czułości aparatu.

Tabela III. Średnie aktywności enzymów w surowicy i w moczu, średnie stężenie

kreatyniny w surowicy i w moczu oraz wartości klirensów enzymatycznych wyra-
żonych w 9/6 klirensu kreatyninowego z uwzględnieniem mediany (Me) i odchylenia
przeciętnego ** (dla m = 10) |

| Aiktywność enzymu | Stężenie kreatyniny Klirens

Enzym w surowicy| w moczu |w Surowicy| w moczu
| (mm U/ml) (1m U/ml) (mg/o) (mg/o) Me d
х 1$ xis х 1$ xis

AP 26,9 + 17,2 0,860 = 0 03645 0,01756

0,6411
Ald 1,34 = 0,56 0,0143 = 9.01445 0.00817
0.00749
LDH 68,3 t 24,1 1990,82 1120,22 904+12,3 0,02:885 0,02312
ICDH 40 1,4 0,344 + 0.006525 0,08470
0,241
LAP 16,6 + 5,6 1,482 + 0,10015 0,04233
1,052

** odchylenie przeciętne (d) wyliczone ze wzoru:

d = 23 х; — Ме
М
gdzie:
N oznacza liczbę obserwacji
Xi s» poszczególne pomiary
Me s medianę grupy
Nr 5 Próba oznaczania aktywności niektórych enzymów w moczu 285

OMÓWIENIE WYNIKÓW

_ Dzięki zastosowaniu Sephadexu G+25 do zagęszczania i odsalania moczu

udało się określić aktywność dwu enzymów, dotychczas nieoznaczalnych
w moczu ludzi zdrowych, a mianowicie dehydrogenazy (NADP) izocytry-
nianowej i aldolazy fruktozo-dwufosforanowej oraz wyznaczyć zakresy
ich zmienności fizjologicznej.
W oparciu o wstępne badania przeprowadzone na grupie ludzi zdro-
wych ustalono, że zakresy zmienności fizjologicznej pięciu analizowa-
nych enzymów są znaczne. |

Е Лещиньска

ПОПЫТКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ POCOVATASBI,

ФРУКТОЗО-ДИФОСФАТНОЙ АЛЬДОНАЗЫ, ЛАКТАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ,
ИЗОЦИТРАТ (МАОР) ДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЛЕЙЦИНОВЫХ АМИНОПЕПТИ-
ДАЗЫ В МОЧЕ ПОСЛЕ СГУЩЕНИЯ И ОСТАЛИВАНИЯ НА СЕФАДЕКСЕ С-25
Резюме

Провели попытку определения активности следующих энзимов после сту-

щения и отсаливания на Сефадексе @-25: щелочной фосфатазы, фруктозо-
-дифосфатной альдолязы лактат-дегидрогеназы, изоцитрат (NADP) дегидро-
аминопептидазы. Попытка определения активности вы-
теназьы и лейциновой
й филь-
шеуказанных энзимов после диализа мочи а также после молекулярно
ua Cedpagexce G-50 Medium не дала удовлетворительных результатов.
rpanuu
от литературных данных можно обнаружить изме-
Показали, что в отличие
фруктозо-дифосфатной альдолязы и изоцитрат (NADP) ne-
ряемую активност
в моче здоровых лиц. Для группы 11—27 здоровых лиц
тидрогеназы также
предел физиологической изменчивости, а для 10 лиц подечитаны
установлен
клиренса определяемы х ферментов, как процент от
значения энзиматическ ого
креатининово го клиренса.

T. Leszczyńska

A TRIAL OF DETERMINATION OF ALKALINE PHOSPHATASE, FRUCTOSE-

-DIPHOSPHATE ALDOLAS E, LACTIC DEHYDRO GENASE, ISOCITRATE
(NADP) AND LEUCINE AMINOPEPTIDASE IN URINE
DEHYDROGENASE
AFTER CONCENTRATION AND DESALTING ON SEPHADEX G-25

Summary

following urinary enzymes was determined tentatively after

The activity of the
concentration and desalting on Sephadex G-25: alkaline phosphatase, fructose-di-
dehydroge nase, isocitrate (NADP) dehydrogenase and
phosphate aldolase, lactic
activity of these enzymes
leucine aminopeptidase. Trials of detenmination of the
G-25 gave unsatisfac-
after urine dialysis or after molecular filtration on Sephadex
to reports in the literature,
tory results. It has been demonstrated that, contrary
aldolase and isocitrate (NADP) de-
a measurable activity of fructose-diphospate
ase was present in the urine of healthy subjects. The range of physiolo-
hydrogen
for 10
gical variability was determined in a group of 11—27 healthy subjects and
proportions
subjects the values of clearance of these 5 enzymes were calculated as
of creatinine clearance.

PISMIENNICTWO

1. Adamkowski K., Cichocka I.: Prosta i szybka metoda zagęszczania płynów bio-
logicznych. Diagn. Lab., 2, 95—102, 1976.
2. Bessey O. A., Lowry O.H., Brock M.J.: А Method for the Rapid Determination
4 — Diagn. Lab.
 T. Leszczyńska — Мг 5

of Alkaline Phosphotase with Five Cubic Mililiters of Serum. J. Biol. Chem.,

164, 381—329, 1946.
Bruns E.: Bestimmung und Eigenschaften der Serumaldolase. Biochem. Z., 325,
156—162, 1954.
Ceriotti G.: A New Look at the Measurement and Interpretation of Enzyme
Assays. Ann. clin. Biochem., 13, 345—353, 1976.
Chakravorti B. P.: Enzymuria. Indian Journal of Medical SŚciences., 28, 171—180,
1974.
Determan H.: Gel Chromatography. wyd. Springer-Verlag, New York, 1968,
56-—60.
. Dubach U.C.: Enzyme Activity in Renal Disease. Pol. Arch. Med. Wewn., 34,
577—585, 1966.
Dubach U.C., Padlina G.: Aktivitét der alkalischen Phosphatase im Urin. Klin.
Wschr., 44, 180—186, 1966.
Gielniewska-Kabzowa J.: Praca doktorska p.t.: „Ocena aktywności wybranych
enzymów w moczu w różnicowaniu zapalenia kłębków nerwowych”. Wrocław,
1973.
10. Homolka J.: Biochemia kliniczna, PZWL, Warszawa, 1971, 407—408.
. Homolka J.: Biochemia kliniczna, PZWL, Warszawa, 1971, 608—609.
12. Jósch W., Dubach U. C:: Urin-Arylamidase. Z. klin. Chem. u. klin. Bochem., 5,
59—63, 1967.
13. Mattenheimer H.: Enzyme im Urin w ,,Methoden der enzymatischen Analyse”
wyd. U. Bergmeyer, Akademie-Verlag-Berlin „1970, 64—74.
14. Mattenheimer H.: Enzymes in the Urine. Medical Clinies of North America, 55,
1493—1508, 1971.
15. Raab W.: "Renal Enzyme Excretion Following Anaphylactic Shock. Nature, 26,
953, 1966.
16. Raab W.: Harnenzyme bei aller#ischen Reaktionen. wyd. Urban und Schwarzen-
berg, Munchen—Berlin—Wien, 1974, 1—32.
17. Raab W.: Diagnostic Value of Urinary Enzyme Determinations. Clin. Chem., 18,
5—25, 1972.
18. Rycer M., Kijewska E.: Aktywność aminotransferaz w zakażeniach dróg moczo-
wych. Pol. Arch. Med. Wewn., 39, 645—651, 1967.
19. Skiba W., Melcer H., Rabczyńska J., Gielniewska-Kabzowa J.: Aktywność gam-
ma-glutamylotranspeptydazy (GGTP) i arylomidazy leucynowej w surowicy
i moczu w różnych postaciach morfologicznych przewlekłego zapalena kłębków
nerkowych. Pol. Tyg. Lek., 3, 89—92, 1976.
20. Warburg O.: w „Methoden der enzymatischen Analyse” H. Bergmeyer, Akade-
mie-Verlag-Berlin, 1970, 533—538.
21. Werner M., Maruhn D., Atoba M.: Use of Gel Filtration in the Assay of Urinary
Enzymes. J . Chromatog., 40, 254—263, 1969.
22. Wolfson K., Williams-Ashman H.G.: w ,,Methoden der enzymatischen Analyse”,
Н. Bergmeyer, Akademie-Verlag-Berlin, 1970, 587—590.

Adres autora: Teresa Leszczyńska, Instytut Medycyny Pracy, ul. Teresy 8,

90-9 50 Łódź.