Composição Das Vesículas Extracelulares de Caenorhabditis Elegans Sugere Papéis No Metabolismo, Imunidade e Envelhecimento - PMC

10/01/2023 19:19 Composição das vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans sugere papéis no metabolismo, imunidade e envelheci…
GeroCiência. agosto de 2020; 42(4): 1133–1145. PMCID: PMC7394990

Published online 2020 Jun 24. doi: 10.1007/s11357-020-00204-1 PMID: 32578074
Composition of Caenorhabditis elegans extracellular vesicles suggests roles in

metabolism, immunity, and aging
1
Joshua C. Russell, Taek-Kyun Kim,2 Ayush Noori,3 Gennifer E. Merrihew,4 Julia E. Robbins,4
Alexandra Golubeva,1 Kai Wang,2 Michael J. MacCoss,4 and Matt Kaeberlein 1
Abstract
The nematode Caenorhabditis elegans has been instrumental in the identification of evolution‐
arily conserved mechanisms of aging. C. elegans also has recently been found to have evolu‐
tionarily conserved extracellular vesicle (EV) signaling pathways. We have been developing
tools that allow for the detailed study of EV biology in C. elegans. Here we apply our recently
published method for high specificity purification of EVs from C. elegans to carry out target-in‐
dependent proteomic and RNA analysis of nematode EVs. We identify diverse coding and non-
coding RNA and protein cargo types commonly found in human EVs. The EV cargo spectrum is
distinct from whole worms, suggesting that protein and RNA cargos are actively recruited to
EVs. Gene ontology analysis revealed C. elegans EVs are enriched for extracellular-associated
and signaling proteins, and network analysis indicates enrichment for metabolic, immune, and
basement membrane associated proteins. Tissue enrichment and gene expression analysis
suggests the secreted EV proteins are likely to be derived from intestine, muscle, and excretory
tissue. An unbiased comparison of the EV proteins with a large database of C. elegans genome-
wide microarray data showed significant overlap with gene sets that are associated with aging
and immunity. Taken together our data suggest C. elegans could be a promising in vivo model
for studying the genetics and physiology of EVs in a variety of contexts including aging, metab‐
olism, and immune response.
Electronic supplementary material
The online version of this article (10.1007/s11357-020-00204-1) contains supplementary ma‐

terial, which is available to authorized users.
Keywords: Aging, LC-MS-MS analysis, Small RNAseq, Gene enrichment analysis, Metabolism,
Immune response, Basement membrane glycoproteins, Membrane raft proteins
Introduction
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7394990/ 1/22
The release of extracellular vesicles (EVs) into the external environment appears to be a uni‐
versal feature of all living cells. In eukaryotes, this can occur directly from the plasma mem‐
brane (microvesicles) or through the endosomal pathway (exosomes) (Jeppesen et al. 2019;
Kowal et al. 2016). Common EV cargos include small non-coding RNAs and proteins such as
translation elongation factors, heat shock proteins, metabolic enzymes, membrane raft pro‐
teins, and miRNAs (Brown and London 2000; Kim et al. 2015; Mathivanan et al. 2012).
EV biology has gained significant attention in recent years due to growing evidence that EVs
play important roles in, and may also serve as useful predictive biomarkers for, many human
diseases (Shah et al. 2018). This is particularly true for age-related diseases, such as cancers
(Kinoshita et al. 2017; Xu et al. 2018), and Alzheimer’s disease and related dementias (D'Anca
et al. 2019; DeLeo and Ikezu 2018; Li et al. 2019). There is also growing evidence that EVs may
be directly involved in the biological aging process itself by mediating inflammatory processes
and other cell non-autonomous signaling and thereby contributing to a degradation in intercel‐
lular communication (Go et al. 2020; Robbins 2017; Takasugi 2018), one of the hallmarks of
aging (Lopez-Otin et al. 2013).
Recently, C. elegans has emerged as a potentially useful genetic model for identifying EV signa‐
ling pathways in vivo (Wang and Barr 2018). For instance, a flippase was shown to induce EV
biogenesis in C. elegans embryos, which led to its subsequent discovery as a mechanism that
influences EV release in human cells (Naik et al. 2019; Wehman et al. 2011). Likewise, EV-de‐
pendent Hedgehog signaling was first identified in C. elegans and subsequently shown to also
impact development in zebrafish, mice, and humans (Liegeois et al. 2006; Qi et al. 2017; Sigg et
al. 2017; Simon et al. 2016). These studies demonstrate that C. elegans shares key EV signaling
mechanisms with humans. However, outside of a small number of reports, the composition and
function of C. elegans EVs remain almost completely uncharacterized.
Dado o longo histó rico de C. elegans como um organismo modelo principal para o estudo da
biologia do envelhecimento (Kenyon 1996 ; Tissenbaum 2015 ; Yanos et al. 2012 ), acredita‐
mos que C. elegans pode se tornar um sistema poderoso para entender o papel de EVs na lon‐
gevidade e saú de dos animais. Para atingir esse objetivo, desenvolvemos um mé todo escaloná ‐
vel para purificar EVs secretados de alta qualidade de nemató ides usando filtraçã o e cromato‐
grafia de exclusã o de tamanho (Russell et al. 2020a). Este procedimento é considerado o meio
mais eficaz para isolamento de EV em massa, fornecendo preparaçõ es mais puras e menos
propensas a artefatos do que outras abordagens comumente usadas, como ultracentrifugaçã o
e precipitaçã o assistida por PEG (Lee et al. 2019 ). Aqui nó s fornecemos o primeiro relató rio
em grande escala de cargas de RNA e proteínas contidas em EVs adultos jovens de C. elegans .
Identificamos muitos tipos diferentes de carga de RNA e proteína també m observados em EVs
humanos e mostramos que essas cargas sã o enriquecidas por proteínas envolvidas no enve‐
lhecimento, metabolismo e imunidade.
Métodos
Cepas e preparação EV
Para este estudo utilizamos C. elegans de tipo selvagem (N2) . Os vermes foram cultivados e
mantidos usando mé todos padrã o (Brenner 1974 ). EVs foram isolados de animais N2 adultos
jovens usando nosso mé todo recentemente desenvolvido para purificaçã o de EV em larga es‐
cala de C. elegans (Russell et al. 2020b ). Trê s ré plicas bioló gicas independentes foram analisa‐
das quanto à composiçã o de RNA e proteína. Para cada ré plica, 500.000 vermes foram incuba‐
dos a 20 °C em placas de alto crescimento semeadas com NA22 Escherichia coli vivaaté atingi‐
rem a idade adulta. Os animais foram entã o lavados para eliminar as bacté rias e incubados em
500 mL de meio S basal esté ril. O meio foi colocado em frascos defletores de fundo cruzado de
2 L, girados a 100 rpm em uma incubadora a 20 °C. Apó s 24 horas, os vermes foram separa‐
dos e o meio condicionado foi concentrado 1000 vezes em um filtro de 10 kDa. O concentrado
foi entã o passado por uma coluna de 10 mL de Sepharose CL-2B. O volume de eluiçã o entre 2
e 6 mL, que conté m a maioria dos EVs (Russell et al. 2020a ), foi entã o concentrado 10 vezes
em filtros de 10 kDa. A aná lise de rastreamento de nanopartículas, microscopia eletrô nica de
transmissã o e aná lise de citometria de fluxo demonstraram que este protocolo separa EVs de
proteínas livremente solú veis e agregados de lipoproteínas (Russell et al. 2020b). Para prepa‐
rar para LC-MS-MS, as amostras EV foram processadas em um gel SDS-PAGE, digeridas com
tripsina e analisadas em um espectrô metro Velos Pro.
Proteô mica
A proteína total nas amostras EV foi quantificada pela aná lise QuBit e as amostras foram nor‐
malizadas para concentraçã o de proteína. Estes foram entã o extraídos em tampã o RIPA com
vó rtex por 30 min antes de adicionar o tampã o de amostra NuPage 4X e aquecer a 70 °C por
10 min. As amostras foram entã o centrifugadas a 18 kG por 15 min para sedimentar quaisquer
precipitados. Cerca de 50 μg de proteína foram carregados em um gel SDS-PAGE de grande ca‐
pacidade e executados a 80 mV por 10 min e depois 100 mV até que a frente do corante esti‐
vesse ~ 1 cm abaixo do início do gel de resoluçã o. Os gé is foram entã o lavados duas vezes com
250 mL dH 2 O por 60 min para remover qualquer detergente. As amostras foram entã o corta‐
das do gel com uma nova lâ mina de barbear e mantidas em um tubo Eppi de ligaçã o de baixa
proteína (ThermoFisher, San Jose, CA EUA, Cat no. 90410).
Digestão em gel
As bandas de gel foram lavadas em bicarbonato de amô nio 100 mM, reduzidas com DTT e al‐
quiladas com IAA. As bandas de gel foram entã o encolhidas com acetonitrila e rapidamente as‐
piradas para secar as bandas de gel. As bandas de gel foram entã o digeridas com 1 μg de trip‐
sina durante a noite a 37 ° C com agitaçã o. No dia seguinte, as proteínas foram extraídas das
bandas de gel com 60% de acetonitrila, 0,1% de á cido trifluoroacé tico e, em seguida, reconsti‐
tuídas em 0,1% de á cido fó rmico.
Cromatografia líquida e espectrometria de massa
Colunas microcapilares de sílica fundida com diâ metro interno de 75 μm (Polymicro Technolo‐
gies, Phoenix, AZ) foram embaladas internamente por carga de pressã o de 30 cm de material
Repro sil-pur C18 (Dr. Maisch, Gmbh, Alemanha). Armadilhas de coluna microcapilares Kasil
(PQ Corporation, Malvern, PA) de 150 μm de diâ metro interno com uma frita Kasil de 2 mm fo‐
ram embaladas com 4 cm de material Repro sil-pur C18. Uma mistura de calibraçã o de tempo
de retençã o (Pierce, Rockford, IL) foi usada para avaliar a qualidade da coluna antes e durante
a aná lise. Trê s dessas execuçõ es de controle de qualidade sã o analisadas antes de qualquer
aná lise de amostra e, depois de cada seis execuçõ es de amostra, outra execuçã o de controle de
qualidade é analisada. As amostras foram carregadas no coletor e na coluna pelo sistema
NanoACQUITY UPLC (Waters Corporation, Milford, MA). As soluçõ es tampã o utilizadas foram
á cido fó rmico a 0,1% em á gua (tampã o A) e 0. 1% de á cido fó rmico em acetonitrila (tampã o
B). O gradiente de 60 minutos do controle de qualidade consistiu em 30 minutos de 98% de
tampã o A e 2% de tampã o B, 5 minutos de 65% de tampã o A e 35% de tampã o B, 6 minutos
de 40% de tampã o A e 60% de tampã o B, 5 min de 95% de tampã o A e 5% de tampã o B, e 18
min de 98% de tampã o A e 2% de tampã o B a uma taxa de fluxo de 0,3 μL/min. O gradiente de
180 minutos para o resumo da amostra consistiu em 130 minutos de 98% de tampã o A e 2%
de tampã o B, 10 minutos de 60% de tampã o A e 40% de tampã o B, 1 minuto de 40% de tam‐
pã o A e 60% de tampã o B, 6 min de 5% de tampã o A e 95% de tampã o B, e 33 min de 98% de
tampã o A e 2% de tampã o B a uma taxa de fluxo de 0,3 μL/min. Os peptídeos sã o eluídos da
coluna e eletropulverizados diretamente em um espectrô metro de massa Velos Pro (Thermo‐
Fisher, San Jose, CA) com a aplicaçã o de uma voltagem de spray distal de 3 kV. Para a aná lise
de controle de qualidade, um espectro de massa de varredura completa (400–1600 m/z) é
medido seguido por um espectro de 17 SRM, todos com 35% de energia de colisã o normali‐
zada e uma janela de isolamento de 2 m/z. Para os resumos da amostra, um espectro de massa
de varredura completa (400–1600 m/z) seguido por 17 espectros MS/MS dependentes de da‐
dos nos 16 íons precursores mais intensos com 35% de energia de colisã o normalizada com
um isolamento de 2 m/z janela. A aplicaçã o do espectrô metro de massa e dos gradientes de
solvente UPLC foi controlada pelo sistema de dados ThermoFisher XCalibur.
Análise de dados
Os dados de controle de qualidade foram analisados usando Skyline (MacLean et al. 2010 ). Os
dados DDA MS/MS foram pesquisados usando COMET com pesquisas de modificaçã o dinâ mica
de 15,994915 metionina e uma modificaçã o está tica de 57,021464 cisteína contra um banco
de dados FASTA contendo todas as sequê ncias de proteínas do congelamento WS250 de C. ele‐
gans de WormBase mais proteínas contaminantes (Eng et al . 2013 ). As taxas de falsa desco‐
berta de correspondê ncia de espectro de peptídeos foram determinadas usando Percolator
(Kall et al. 2007 ) em um limite de 0,01, e os peptídeos foram montados em identificaçõ es de
proteínas usando uma implementaçã o interna de IDPicker (Zhang et al. 2007 ). Os resultados
dessas execuçõ es de espectrometria de massa estã o disponíveis em chorusproject
(https:/chorusproject.org/anonymous/download/experiment/d41c70cbecfe42a0a00050488
903a163).
A comparaçã o de proteínas entre EV e verme inteiro foi realizada filtrando as 224 proteínas
identificadas em todas as ré plicas contra um conjunto de dados de proteína de lisado de
verme inteiro adulto jovem obtido do mesmo espectrô metro Velos Pro que a proteô mica EV
foi conduzida (dados em planilha suplementar ) . O conjunto de dados continha valores de
abundâ ncia para 118 das 224 proteínas EV. Um grá fico de dispersã o dos valores de EV e abun‐
dâ ncia de vermes inteiros dessas 118 proteínas foi gerado e a linha de tendê ncia linear e R 2
foram calculados. Os dados proteô micos de EV e verme inteiro e uma tabela das proteínas
analisadas com seus valores de abundâ ncia sã o fornecidos na planilha suplementar .
Para avaliar as associaçõ es de ontologia de cargas de proteína EV e caracterizar sua estrutura

de rede de interaçã o de proteína, usamos aná lise de enriquecimento WormBase, STRING V11
e WormExp WS235 (Angeles-Albores et al. 2016 ; Croft et al. 2011 ; Mi et al. 2013 ; Szklarczyk
et al. 2019 ; Yang et al. 2016 ). Homó logos humanos de proteínas de C. elegans foram identifi‐
cados atravé s de WORMHOLE ( wormhole.jax.org ) (Sutphin et al. 2016 ).
sequenciamento de RNA
Para quantificar amostras de RNA associadas a EV foram processadas com proteína exossomal
total e kit de isolamento de RNA (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA, Cat no. 4478545). Em seguida,
caracterizamos a abundâ ncia e o tamanho do elu atestes em um Agilent 2200 TapeStation (Agi‐
lent, Santa Clara CA, EUA; Cat no. G2991AA) usando fita de tela de alta sensibilidade (Agilent,
Santa Clara USA Cat no. 5067-5579) juntamente com uma pequena escada de calibraçã o de
RNA (Agilent, Santa Clara CA, EUA; Cat no. 5067-1550). As amostras de vesículas apresentaram
pequenos RNAs substanciais, bem como espé cies de rRNA 16 s e 28 s nos tamanhos espera‐
dos. Para determinar quais espé cies de RNA sã o empacotadas em EVs, realizamos RNAseq.
Usamos um pequeno kit de preparaçã o de amostra de RNA Qiagen para preparar uma biblio‐
teca de cDNA de nosso RNA associado a EV (Qiagen Germantown MD, USA Cat no. 331502),
enquanto um kit Illumina MiSeq v2 (300 ciclos) foi usado para preparar a biblioteca de se‐
quenciamento com Sequê ncias adaptadoras 5' (San Diego, EUA; Cat no. MS-102-2002). A
amostra foi entã o submetida ao sequenciamento single-end em um sequenciador de desktop
Illumina MiSeq.
Análise de dados de RNAseq pequeno
O ajuste do adaptador e o alinhamento da sequê ncia foram conduzidos no sRNAnalyzer (Wu

et al. 2017 ), que fornece perfis abrangentes de pequenos RNAs. O ajuste do adaptador resul‐
tou em RNA com um comprimento de sequê ncia de pico de 19 nucleotídeos (nt) caindo para
leituras zero em torno de 55 nt. Para o perfil de miRNA, as sequê ncias foram mapeadas contra
miRBase versã o 21 (Kozomara e Griffiths-Jones 2014 ; Zerbino et al. 2018 ). Para outros perfis
de RNA, os arquivos FASTA para o transcriptoma de C. elegans e as sequê ncias do genoma fo‐
ram recuperados do banco de dados do genoma do NCBI (montagem WBcel235) (Kozomara e
Griffiths-Jones 2014 ; Zerbino et al. 2018). Os arquivos FASTA foram transformados com arqui‐
vos bowtie-index. Todos os alinhamentos para microRNAs, RNAs e DNAs foram realizados sob
tolerâ ncia de 0 a 2 incompatibilidades. Cerca de 8 milhõ es de leituras foram mapeadas para o
genoma de C. elegans . A lista completa de cargas de RNA está disponível publicamente em
Gene Expression Ominibus (ID de acesso: GSE146973 ). Uma planilha com todas as leituras é
fornecida em arquivo suplementar .
Para comparar as abundâ ncias de miRNA entre EV e vermes inteiros, escolhemos trê s conjun‐
tos de dados miRBase obtidos em vermes adultos jovens que nã o foram submetidos a um tra‐
tamento experimental (nºs de acesso dER0000000402, ER0000000403, ER0000000408) (Sto‐
eckius et al. 2009). Os miRNAs contidos nesses trê s conjuntos foram entã o filtrados aqueles
que estavam em todas as trê s ré plicas e tinham uma marca de verificaçã o de confiança. Essa
lista foi entã o filtrada pelos miRNAs que estavam presentes nos EVs, resultando em 87 miRNAs
com EV e trê s ré plicas de leituras de vermes inteiros. A mé dia de leituras/milhõ es foi calculada
para as trê s leituras inteiras do worm. As abundâ ncias de miRNA EV foram expressas como
leituras por milhã o, multiplicando o nú mero de leituras brutas por um fator de 1 milhã o divi‐
dido pelo nú mero total. (22.042) de leituras de miRNA. Um grá fico de dispersã o das abundâ n‐
cias de EV e vermes inteiros desses 87 miRNAs foi entã o gerado, e a linha de tendê ncia linear e
o valor de R 2 foram determinados. Uma lista das abundâ ncias usadas para fazer o cá lculo está
na planilha complementar .
Resultados
Análise proteô mica de EVs de C. elegans
Conduzimos aná lise proteô mica de ré plicas bioló gicas triplicadas para EVs purificadas de C.
elegans adulto jovem selvagem . Os EVs secretados foram purificados a partir de culturas sin‐
cronizadas de ~ 500.000 vermes no dia 1 da idade adulta (Fig. 1a). Mais de 80% dos espectros
de peptídeos correspondiam a proteínas de C. elegans com o restante mapeado para proteínas
de E. coli , presumivelmente da fonte alimentar residual (Fig.1b).
Classificamos as proteínas de C.
elegans identificadas de acordo com sua mé dia do Fator de Abundâ ncia Espectral Normalizada
(NSAF) (McIlwain et al. 2012 ) e descobrimos que as 20 proteínas mais abundantes exibiram
níveis de abundâ ncia relativamente consistentes em ré plicas bioló gicas (Fig.1c).
Cada replica‐
çã o bioló gica identificou centenas de cargas de proteína EV por meio de acessos de peptídeos
ú nicos (Arquivo Suplementar 1 ).
Figura 1
Análise proteô mica de EVs de C. elegans . a Caenorhabditis elegans secreta EVs fora de seus corpos, permitindo
seu isolamento sem interromper os tecidos. b Comparação de peptídeos EV detectados associados a C. ele‐
gans e E. coli . c Escores NSAF absolutos das 20 proteínas mais abundantes detectadas em todas as três répli‐
cas de EV. As barras de erro são o erro padrão da média. d Diagrama de Venn da intersecção de proteínas iden‐
tificadas em réplicas bioló gicas. Cerca de 43% de ocorrências de proteínas foram encontradas em todas as ré‐
plicas bioló gicas ( n = 3). e Rede de interação de proteínas de 224 C. elegansProteínas EV identificadas em
cada réplica bioló gica. f Rede de interação de proteínas para as 44 proteínas EV com homó logos humanos cla‐
ros, conforme determinado pelo Ortholist 2. As 223 proteínas EV que foram identificadas em todas as répli‐
cas bioló gicas foram filtradas para aquelas que aparecem em todos os seis bancos de dados de ortologia de C.
elegans consultados pelo Ortholist 2. Para ambas as análises, o rigor da associação STRING foi definido como
0,7 (Forte) e a espessura da barra indica a força da interação. Proteínas desconexas foram removidas. Os cír‐
culos coloridos correspondem às proteínas metabó licas (vermelho), imunes (azul) e associadas à membrana
basal (verde)
Para avaliar as associaçõ es de ontologia de cargas de proteína EV e caracterizar sua estrutura

de rede de interaçã o de proteína, usamos aná lise de enriquecimento WormBase, STRING V11
e WormExp WS235 (Angeles-Albores et al. 2016 ; Croft et al. 2011 ; Mi et al. 2013 ; Szklarczyk
et al. 2019 ; Yang et al. 2016 ). Limitamos nossas aná lises ao conjunto de 224 proteínas (43%)
que foram identificadas em cada uma das trê s ré plicas bioló gicas (Fig.1 dia). Os termos ontoló ‐
gicos mais enriquecidos em WormBase e STRING foram “regiã o extracelular” (FDR 2.23E-12) e
“sinal” (FDR 7.35E-51), respectivamente. A aná lise de enriquecimento tecidual mostrou que “
intestino” (valor q 2,4E -14) e “sistema muscular” (valor q 2,9E-8) foram os tecidos mais asso‐
ciados. As principais associaçõ es ontoló gicas sã o apresentadas na Tabela Suplementar 1 . A
aná lise da rede de interaçã o de proteínas identificou trê s grupos que consistem em proteínas
metabó licas, imunes e associadas à membrana basal (Fig.1e). Oitenta e oito dessas proteínas
sã o consideradas ortó logas fortes porque baseadas em melhores resultados recíprocos com
genes humanos usando WORMHOLE (Sutphin et al. 2016 ). Os conjuntos de 224 proteínas EV,
bem como os 88 com ortó logos humanos claros, consistem principalmente em redes metabó li‐
cas, de resposta imune e de interaçã o de proteínas da membrana basal (Fig.1f;
Tabela Suple‐
mentar 2 ).
C. elegans EVs são enriquecidos para cargas EV humanas típicas
Para determinar se os EVs de C. elegans contê m cargas semelhantes aos EVs humanos, compa‐
ramos nossos resultados proteô micos com uma lista das 100 proteínas EV humanas identifica‐
das com mais frequê ncia em Exocarta.org (Mathivanan et al. 2012 ). Uma abordagem de best
hit BLAST recíproca foi usada para identificar ortó logos de vermes correspondentes à s 100
proteínas EV humanas, que renderam 46 proteínas C. elegans . Embora a abordagem recíproca
do melhor hit do BLAST seja um meio rigoroso para determinar a ortologia, essa abordagem
pode ignorar famílias de proteínas com sequê ncias fortemente conservadas, porque nenhuma
delas emerge como o melhor hit ú nico (por exemplo, actina). Portanto, conduzimos a aná lise
BLAST nas 54 proteínas EV humanas e filtramos para E-valores menores que E < − 30. Os me‐
lhores resultados do BLAST recíproco e E < − 30 resultados foram combinados em um con‐
junto final no qual 93 proteínas EV humanas foram associadas a 70 proteínas de C. elegans
(Tabela Suplementar 3 ). Essas 70 proteínas de C. elegans foram entã o comparadas com as
proteínas EV identificadas em qualquer uma das ré plicas e també m com as proteínas identifi‐
cadas nas trê s ré plicas. Isso combinou 9 proteínas que foram identificadas em cada ré plica
(12%) e 21 proteínas identificadas em qualquer ré plica (42%). Em ambos os casos, a sobrepo‐
siçã o entre cargas EV humanas conhecidas e cargas EV C. elegans observadas neste estudo foi
significativamente maior do que o esperado por acaso ( p < 1 E-9, testes exatos de Fisher)
(Fig. 1 complementar ).
Análise de sequência de pequenos RNAs em EVs de C. elegans
Embora se saiba que os EVs de outras espé cies contê m pequenas cargas de RNA, ainda nã o foi
determinado se os EVs de C. elegans contê m espé cies de RNA semelhantes. Portanto, conduzi‐
mos um protocolo de isolamento de RNA em EVs de C. elegans purificados e, em seguida, anali‐
samos o produto por TapeStation. Observamos picos de rRNA de 16 s e 28 s, bem como um
pico largo abaixo de 30 pb (Fig. 2a). Dada a presença de RNA abundante em EVs de nemató i‐
des, procedemos à geraçã o de uma biblioteca de cDNA e conduzimos o sequenciamento de
pró xima geraçã o de extremidade ú nica. Isso resultou em ~ 14 milhõ es de leituras totais mape‐
adas para ~ 8,5 milhõ es de C. elegans e ~ 2,5 milhõ es de sequê ncias de E. coli (Fig.2b).
A maio‐
ria dos 8,5 milhõ es de leituras cortadas de C. elegans foram < 35 pb (Fig.2c)
com espé cies de
rRNA compreendendo cerca de dois terços das leituras (Fig.2d). Filtramos nossos resultados
para excluir rRNA e quaisquer sequê ncias com incompatibilidades. As 440.392 leituras restan‐
tes corresponderam a uma ampla variedade de tipos de RNA, incluindo mRNA, miRNA, piRNA,
snRNA e snoRNA, entre outros (Fig.2e).
Figura 2
A análise de RNAseq de EVs de C. elegans revela diferentes classes de RNA: uma leitura do Bioanalyzer de
RNA extraído de EVs de C. elegans . O perfil RFU está à esquerda, enquanto a ilustração do gel de agarose ge‐
rado está à direita. b Distribuição de três categorias principais de leituras não redundantes totais com até 2
incompatibilidades de nucleotídeos. c Distribuição de tamanho de leitura aparada de leituras de RNA de alta
qualidade. d Distribuição do total de leituras não redundantes de C. elegans sem incompatibilidades. e Distri‐
buição da distribuição de espécies de RNA excluindo rRNA
A composição de EV difere da composição de todo o animal
Em seguida, comparamos a composiçã o das cargas de EV com os níveis globais dentro do

worm para obter informaçõ es sobre se as cargas sã o selecionadas ativamente ou resultam da
absorçã o passiva do meio celular. Para comparar a abundâ ncia de proteínas entre EVs e ver‐
mes inteiros, filtramos os dados proteô micos de animais inteiros para as 224 proteínas EV que
foram identificadas em cada ré plica (Fig.1 dia). Destes, 106 nã o foram identificados no extrato
de vermes inteiros, indicando que eles provavelmente sã o de baixa abundâ ncia em vermes in‐
teiros. As 118 proteínas restantes que foram identificadas em EVs e extrato de verme inteiro
foram comparadas para NSAF relativo (Tabela Suplementar 4 A). Em mé dia, os valores de
NSAF foram 27 vezes maiores em EVs do que em vermes inteiros (Fig. 3a), e nã o houve corre‐
r2
laçã o significativa entre a abundâ ncia de proteínas em EVs versus vermes inteiros (Fig.3b;
= 0,01). Consistente com esta aná lise, os EVs nã o continham nenhuma das numerosas proteí‐
nas associadas ao ribossomo que estã o entre as proteínas mais abundantes identificadas em
vermes inteiros (Wang et al. 2015 ).
Fig. 3
Comparação dos níveis relativos de proteína EV e cargas de RNA com níveis relatados em lisado de vermes
inteiros. um espectro de abundância normalizada (NSAF) de 118 proteínas EV em comparação com os valo‐
res de NSAF obtidos a partir do conjunto de dados LC-MS-MS de vermes inteiros pareados por idade. b Grá‐
fico de dispersão das proteínas EV identificadas em todas as três réplicas em relação aos seus níveis globais
em vermes inteiros da mesma idade. c Gráfico de dispersão comparando os níveis de expressão de miRNA de
EV (eixo X ) versus verme inteiro ( eixo Y )
Para avaliar a abundâ ncia relativa de espé cies específicas de miRNA em EV em comparaçã o
com animais inteiros, comparamos os níveis de miRNA de EV com trê s conjuntos de dados de
miRNA de miRBase (Kozomara e Griffiths-Jones 2014 ) correspondentes ao primeiro dia de C.
elegans adulto (nú meros de acesso ER0000000402, ER0000000403, ER0000000408) (Stoec‐
kius et al. 2009 ). Todos os conjuntos de dados de miRNA do verme foram filtrados para miR‐
NAs que estavam em todas as ré plicas, tinham leituras de alta confiança e estavam entre os
miRNAs EV detectados em nossa aná lise. Isso resultou em 87 miRNAs que puderam ser com‐
parados entre EVs e vermes inteiros (Tabela Suplementar 4 B). Nenhuma correlaçã o significa‐
r2
tiva foi encontrada entre o miRNA de EV e a abundâ ncia de miRNA de verme inteiro (Fig.3c;
= 0,01).
Discussã o
Até onde sabemos, esta é a primeira caracterizaçã o em larga escala de proteínas EV e cargas
de RNA em um organismo modelo invertebrado. A capacidade de obter EVs de C. elegans de
qualidade e quantidade suficientes para aná lises ô micas a jusante permitirá estudos detalha‐
dos da biologia de EV em uma variedade de diferentes contextos gené ticos e ambientais. Fo‐
mos intencionalmente conservadores nesta aná lise, considerando apenas as sequê ncias de
RNA sem incompatibilidades e proteínas que tiveram acertos de peptídeos ú nicos em cada re‐
plicaçã o bioló gica ( n = 3). Mesmo essa abordagem conservadora rendeu 224 proteínas e
mais de 2.000 diferentes transcritos de RNA nã o codificantes, incluindo piRNA, miRNA, ncRNA
(RNA nã o codificante), snoRNA e outros (consulte o Arquivo de dados suplementares 1 ).
Embora estudos adicionais sejam necessá rios para determinar a relevâ ncia fisioló gica das car‐
gas EV identificadas aqui, vá rias categorias de proteínas parecem estar presentes em EVs que
especulamos podem ser funcionalmente importantes. Por exemplo, o proteoma EV continha
uma abundâ ncia de enzimas envolvidas em vias metabó licas, incluindo gliconeogê nese, glicó ‐
lise e metabolismo de aminoá cidos. Cerca de metade (108 de 224) das proteínas EV de C. ele‐
gans identificadas em cada ré plica foram associadas ao metabolismo do carbono. Isso está de
acordo com relatos anteriores de que as proteínas metabó licas constituem ~ 15% das proteí‐
nas EV de Escherichia coli e cerca de metade de Saccharomyces cerevisiae ou cargas de proteí‐
nas EV humanas (Lee et al. 2007 ; Oliveira et al. 2010; Thompson e outros. 2018 ). Foi demons‐
trado que C. elegans secreta metabó litos no ambiente externo, referidos como exometaboloma
(Butler et al. 2010 ), e esses exometabó litos foram implicados na determinaçã o da longevidade
(Mishur et al. 2016 ). Com base em nossos dados, parece plausível que uma porçã o significa‐
tiva do exo-metaboloma do nemató ide seja derivada de EVs, sugerindo um mecanismo pelo
qual os EVs podem afetar a vida ú til. No futuro, será interessante comparar os metabó litos nas
fraçõ es secretadas EV e nã o-EV entre mutantes de tipo selvagem e de vida longa.
Outra categoria que se destacou em nossa aná lise de cargas EV sã o as proteínas envolvidas na
imunidade. O principal Reactome e muitas das principais vias de "funçã o bioló gica" do GO fo‐
ram associadas à resposta imune (Tabela Suplementar 1 C). Nossa aná lise indica que EVs de C.
elegans sã o especialmente enriquecidos para cargas de proteína lectina tipo C, uma família de
proteínas conhecida por reconhecer diversos ligantes infecciosos e, assim, contribuir para uma
resposta imune antimicrobiana (Mallo et al. 2002 ). També m descobrimos que as proteínas EV
sã o enriquecidas para genes que mudam de expressã o apó s a exposiçã o a bacté rias patogê ni‐
cas (Tabela Suplementar 1 K) (Sinha et al. 2012 ; Yang et al. 2015 ). Essas conexõ es sugerem
queC. elegans , como humanos, també m pode desencadear respostas imunes inatas por meio
de EVs (Chen et al. 2019 ).
A aná lise de interaçã o de proteínas identificou um pequeno nó de quatro lamininas (LAM-1

LAM-2 UNC-52 e EPI-1) e duas proteínas de cadeia de colá geno alfa-1(IV) (LET-2 e EMB-9) que
se localizam no membrana basal (Fig.1f). Cinco deles tê m melhores resultados recíprocos com
proteínas humanas, conforme determinado por WORMHOLE (Sutphin et al. 2016 ). Cada uma
dessas proteínas també m foi identificada na saliva humana e nos EVs uriná rios, bem como em
vá rios tipos de câ ncer (Demory Beckler et al. 2013 ; Gonzales et al. 2009 ; Gonzalez-Begne et
al. 2009 ). As lamininas sã o conhecidas por conduzir o trá fego de EV humano atravé s da inte‐
raçã o com polissacarídeos de proteína fibrosa como a fibronectina e funcionando com a rede
de sinalizaçã o de integrina (French et al. 2017 ). Essas observaçõ es sugerem que, como em ou‐
tros animais (Antonyak et al. 2011 ; Desrochers et al. 2016 ; Hoshino et al. 2015; Sabatier et ai.
2002 ), as interaçõ es matriz extracelular-integrina provavelmente influenciam a ligaçã o de EV
e a absorçã o por cé lulas em C. elegans .
Nossa aná lise revelou que as proteínas da balsa de membrana sã o enriquecidas em EVs de C.
elegans . As balsas de membrana se formam quando os esfingolipídios e o colesterol se agre‐
gam em nanodomínios puntiformes discretos dentro da membrana da bicamada lipídica. Em
EVs de vertebrados, esses nanodomínios facilitam a colocalizaçã o de proteínas que funcionam
juntas e sã o críticas tanto para a biogê nese de EV quanto para o direcionamento de cé lulas re‐
ceptoras (Head et al. 2014 ). Vinte e cinco das quarenta e trê s proteínas de balsa de membrana
de nemató ides previamente identificadas (Rao et al. 2011 ) foram identificadas em EVs (Tabela
Suplementar 5 ) . O enriquecimento de proteínas da balsa de membrana sugere que, assim
como os humanos, C. elegansOs EVs també m contê m esses nanodomínios lipídicos e, mais uma
vez, apontam para semelhanças substanciais na estrutura e funçã o de EV entre vermes e
pessoas.
Embora nã o seja inesperado, a presença de abundantes espé cies de RNA em EVs de C. elegans
indica que esta principal modalidade de sinalizaçã o de EV é provavelmente conservada em C.
elegans . Uma das vantagens da aná lise de RNAseq é que diferentes pequenas famílias de RNA
podem ser estudadas simultaneamente de maneira abrangente. Alé m do rRNA abundante, as
cargas EV de mamíferos podem incluir mRNAs, ncRNAs incluindo miRNAs, RNA longo nã o co‐
dificador (lncRNA), DNA de fita simples, DNA de fita dupla, DNA mitocondrial e amplificaçõ es
de oncogenes (ou seja, c-myc) ( Guescini et al. 2010 ; Janas et al. 2015 ; Thakur et al. 2014 ;
Yá ñ ez-Mó et al. 2015). Nossa aná lise de RNAseq rendeu mais de 440.000 leituras sem incom‐
patibilidade identificando outras espé cies de RNA, incluindo ncRNA, mRNA, miRNA, piRNA e
snRNA, entre outros, em porcentagens aproximadamente semelhantes de subtipos de RNA,
conforme relatado anteriormente em EVs humanos. Quase um terço das leituras de ncRNA fo‐
ram para trê s espé cies nã o caracterizadas, M02F4.12, C44B7.15 e B0244.13. O snRNA seguido
pelo miRNA foram as pró ximas famílias de RNA mais abundantes, compreendendo 25% e ~
10% das leituras de nã o-rRNA, respectivamente (Fig.2d).
Foi demonstrado que pequenos
ncRNA e rRNA també m sã o enriquecidos em exossomos humanos (Elsemü ller et al. 2019 ). Os
piRNAs identificados foram notáveis devido à sua grande variedade, com mais de 1200 trans‐
criçõ es diferentes de 6776 leituras sem correspondê ncia. Em contraste, identificamos apenas
139 espé cies de miRNA de 42.444 leituras de miRNA sem correspondê ncia. As leituras de
miRNA mapeadas para 139 espé cies de miRNA, todas codificadas a partir da fita positiva. As
famílias de miRNA mais super-representadas em EVs foram miR-51 e miR-58 (Tabela Suple‐
mentar 4 B). Estudos mostraram que o miR-51funçõ es familiares no tempo de desenvolvi‐
mento e adesã o tecidual, sugerindo a possibilidade de que o transporte EV desses miRNAs
pode contribuir para suas funçõ es celulares nã o autô nomas (Brenner et al. 2012 ; Shaw et al.
2010 ). Demonstrou -se que a família miR-58 interage com a via TGF-beta e sugeriu desempe‐
nhar funçõ es de manutençã o para influenciar a expressã o gê nica específica do tecido (de Lu‐
cas et al. 2015 ; Pagano et al. 2015 ). Curiosamente, um dos miRNAs mais abundantes foi let-7 ,
que foi recentemente identificado em cé lulas cancerígenas humanas e EVs de leite materno
(Ohshima et al. 2010 ; van Herwijnen et al. 2018). Cada um dos ortó logos humanos dos miR‐
NAs contidos em EVs de C. elegans (tabela suplementar 4 B) foi previamente identificado em
EVs com base em conjuntos de dados carregados em microvesicles.org e EVmiRNA (Kalra et al.
2012 ; Liu et al. 2019 ). Nossos resultados de sequenciamento de RNA EV també m continham
mais de 5.000 mRNA sem ocorrê ncias de incompatibilidade. Em geral, os mRNAs mais abun‐
dantes correspondem à s proteínas mais abundantes identificadas no lisado completo do
verme C. elegans no banco de dados pax.db (Wang et al. 2015 ), incluindo numerosas subuni‐
dades ribossomais, bem como colá genos, histonas e actina/ genes da tubulina (Arquivo de Da‐
dos Suplementares 1). Embora pouco se saiba sobre as funçõ es do ncRNA, esse enriqueci‐
mento em EVs sugere que eles podem desempenhar um papel na sinalizaçã o cé lula a cé lula e a
comparaçã o com conjuntos de dados de RNA de EV humanos anteriores sugere que C. elegans
provavelmente compartilha muitos aspectos da sinalizaçã o de EV mediada por RNA canô nico
com humanos (Kim et al. 2017 ).
Até o momento, os ú nicos neurô nios ciliados de C. elegans demonstraram secretar EVs fora do
corpo (Wang et al. 2014 ), mas nossos dados sugerem que vá rios outros tecidos provavel‐
mente també m contribuem para esse subconjunto de EV. O miRNA com a maior expressã o de
EV do nosso conjunto de dados é o mir-82 (90.651 leituras/milhã o), que é conhecido por ser
expresso especificamente nos neurô nios anfídeos, cé lula da glâ ndula excretora e um subcon‐
junto de neurô nios na cauda, enquanto um miR- 81expressã o é específica do neurô nio (Isik et
al. 2010 ; Martinez et al. 2008). A proteína com maior pontuaçã o de abundâ ncia ASP-6 está lo‐
calizada no espaço pseudocelô mico extracelular e no intestino. A aná lise de enriquecimento te‐
cidual da carga proteica EV identificou o intestino como o tecido mais representado, seguido
pelo mú sculo e faringe (Tabela Suplementar 1 A). Juntos, isso sugere que o intestino e o ducto
excretor sã o provavelmente os principais produtores de EVs secretados, embora neurô nios,
mú sculos e outros tecidos també m contribuam.
Uma característica particularmente intrigante da aná lise proteô mica é uma associaçã o com ge‐
nes regulados no contexto do envelhecimento. Usamos o WormExp para determinar a correla‐
çã o do conjunto de proteínas EV com conjuntos de dados de expressã o gê nica de todo o ge‐
noma publicados em C. elegans . Embora os experimentos de microarranjos relacionados ao
envelhecimento compreendessem apenas 4% dos conjuntos de dados (97 de 2.297), quatro
dos dez estudos mais correlacionados eram relacionados à idade (Tabela Suplementar 6 ).
Dois desses estudos identificaram genes cujos níveis de mRNA diminuem significativamente
com a idade (Budovskaya et al. 2008 ; Pu et al. 2015 ) e dois estudos identificaram genes que
sã o alvos a jusante de fatores de transcriçã o que demonstraram influenciar o envelhecimento
em C. elegans(Habacher et al. 2016 ; Mann et al. 2016 ; Thyagarajan et al. 2010 ). As cargas de
miRNA mais abundantes també m foram enriquecidas para famílias de miRNA que demonstra‐
ram funcionar em vias de longevidade. Por exemplo, foi demonstrado que o miR-58 aumenta a
longevidade em mutantes daf-2 por meio da sinalização daf-16 ((FOXO6)) (Zhang et al. 2018 ).
Trê s membros da família de miRNA miR-58 (miR-58, miR-80, miR-82) estavam todos entre os
dez miRNAs mais abundantes em EVs, e miR-71 , o quarto miRNA EV mais abundante, é conhe‐
cido influenciar a longevidade celular de forma nã o autô noma via via insulina/IGF (Boulias e
Horvitz 2012 ).
Prevemos pelo menos duas maneiras gerais pelas quais os EVs podem ser importantes para o
envelhecimento em C. elegans e outros animais. Primeiro, há evidê ncias abundantes de que
muitas vias de longevidade agem por meio de sinais celulares nã o autô nomos para regular o
tempo de vida. Em vermes, por exemplo, mutantes de vida longa envolvidos na funçã o mito‐
condrial (Durieux et al. 2011 ), sinalizaçã o de insulina (Apfeld e Kenyon 1998 ), sinalizaçã o
mTOR (Zhang et al. 2019 ) e sinalizaçã o hipó xica (Leiser et al. 2015) todos envolvem sinais que
surgem nos neurô nios e mediam alteraçõ es moleculares a jusante no intestino. Os EVs sã o can‐
didatos prováveis para a transduçã o desses sinais. Por exemplo, nossos estudos mostraram
que o miR-83 foi enriquecido 30 vezes em EVs em comparaçã o com o lisado de vermes intei‐
ros (Tabela Suplementar 4 B) e recentemente foi demonstrado que o miR-83 intestinal con‐
trola a diminuiçã o relacionada à idade na macroautofagia em outros tecidos, potencialmente
atravé s da sinalizaçã o EV (Zhou et al. 2019). Em segundo lugar, os EVs podem servir como um
mecanismo para remover proteínas tó xicas mal dobradas ou agregadas que se acumulam com
a idade. Tal mecanismo de autodefesa celular permitiria que as cé lulas reduzissem a carga pro‐
teotó xica intracelular, mas també m poderia inadvertidamente contribuir para a disseminaçã o
de espé cies proteicas patogê nicas se absorvidas por outras cé lulas. Há evidê ncias de que essa
disseminaçã o mediada por EV pode ser importante durante a doença de Alzheimer (Pluta et al.
2018 ; Sardar Sinha et al. 2018 ), e grandes “exô fagos” de EV sã o produzidos por nemató ides
envelhecidos (Melentijevic et al. 2017 ). Explorar esses e outros papé is potenciais para os EVs
de C. elegans pode lançar luz sobre os mecanismos fundamentais do envelhecimento em nema‐
tó ides, bem como nos distú rbios humanos relacionados à idade.
Os mé todos que desenvolvemos e implementamos aqui resultam em EVs abundantes e relati‐

vamente puros, suficientes para conduzir vá rios tipos de aná lises. Observamos que, para sepa‐
rar os vermes dos contaminantes bacterianos, os animais foram incubados em tampã o livre de
bacté rias por 24 h antes da coleta dos EVs. Determinamos que mais de 99% dos animais esta‐
vam saudáveis e ativos apó s o período de incubaçã o, sugerindo que pouca ou nenhuma morte
ocorreu e EVs isolados vieram de animais vivos. De fato, mostramos anteriormente que a re‐
moçã o completa do alimento bacteriano durante a idade adulta aumenta a expectativa de vida
em C. elegans e espé cies relacionadas (Smith et al. 2008 ; Sutphin e Kaeberlein 2008). No en‐
tanto, reconhecemos que a ausê ncia de alimentos també m pode afetar a composiçã o dos EVs e
diferentes composiçõ es de carga sã o prováveis em vermes adultos totalmente alimentados. Es‐
forços futuros serã o direcionados para a purificaçã o de EVs secretados de C. elegans alimenta‐
dos , seja por meio de abordagens baseadas em afinidade ou utilizando meios axê nicos.
Conclusã o
Cargas EV humanas estã o sendo cada vez mais investigadas como biomarcadores e fatores
contribuintes para saú de e doença. Até agora, no entanto, o campo EV carecia de um modelo
gené tico de invertebrados tratável. Neste estudo, realizamos a primeira identificaçã o em larga
escala de proteínas EV e carga de RNA de C. elegans . Nossos experimentos descobriram um
espectro diversificado de pequenos RNAs e proteínas nã o codificantes, cuja composiçã o indica
uma conservaçã o evolutiva significativa em humanos. A rastreabilidade gené tica de C. elegans ,
juntamente com a capacidade de isolar EVs para aná lise proteô mica, metabolô mica e de RNA‐
seq, sugere que C. eleganspode ser um sistema modelo ú til para dissecar vias gené ticas e pro‐
cessos fisioló gicos que afetam a sinalizaçã o EV in vivo. Em particular, o uso de C. elegans para
entender o papel dos EVs no envelhecimento e nas doenças relacionadas à idade parece ser
uma linha de investigaçã o frutífera.
Material eletrô nico complementar
ESM 1 (1,3M, pdf)
(PDF 1344 KB)
ESM2 (2,3M, xlsx)
(XLSX 2372 KB)
Agradecimentos
Agradecemos a Nick Terzopoulos pelas placas de vermes e reagentes, ao Caenorhabditis Gene‐

tics Center (CGC) pela linha de nematoides N2, Safyie Celik pela ajuda com a aná lise estatística,
e Albert Tai e Matthew Fierman da instalaçã o Tufts University Bioseq para sequenciamento de
RNA. O sequenciamento foi patrocinado pelo National Institutes of Health Science Education
Partnership Award e pela Cummings Foundation.
Contribuiçõ es do autor
JCR concebeu o estudo, realizou os experimentos no estudo, salvo indicaçã o em contrá rio, e
escreveu o manuscrito. AG realizou a purificaçã o de EVs. GEM, JER e MJM conduziram os expe‐
rimentos de espectrometria de massa e analisaram os dados proteô micos brutos para deter‐
minar os hits de proteína estatisticamente significativos, TK, KW, AN e JCR analisaram os dados
de RNAseq. MK supervisionou o estudo e escreveu o manuscrito.
Informaçõ es de financiamento
Este trabalho foi apoiado por NIH concede P30AG013280 e P50AG005136 para MK e NIH
concede F32AG054098 para JCR.
Conformidade com os padrõ es éticos

Interesses competitivos
Os autores declaram que nã o tê m interesses concorrentes.
notas de rodapé
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações
institucionais.
Informaçõ es do colaborador
Joshua C. Russell, E-mail: jcr32@uw.edu .
Matt Kaeberlein, E-mail: kaeber@uw.edu .
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Matt Kaeberlein, E-mail: kaeber@uw.edu .

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