10/4/22 1

Nuôi cấy tế bào động vật: kĩ thuật và ứng dụng

TS. Vũ Bích Ngọc

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn

 Câu hỏi
1. Tác nhân nhiễm nào sau đây không thể loại bỏ được nếu được hấp khử trùng ở
1210C, 15-30 phút, 15 psi
a. Nội độc tố
b. Vi khuẩn
c. Vi Nấm
d. Mycoplasma

Tại sao?

4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 2
 Kiểm soát
nhiễm

Phát hiện Ngăn ngừa Loại bỏ

nhiễm nhiễm nhiễm

Virus nội
Vi nấm Vi khuẩn Mycoplasma Nhiễm chéo
sinh

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 3

PHÁT HIỆN • Nhiễm nấm, khuẩn, mốc: dễ phát hiện
• Nhiềm virus, protozoa, mycoplasma,
NHIỄM nhiễm chéo: khó phát hiện
• Nhiễm chéo: nhiễm nhiều hơn 1 dòng
tế bào khác nhau trong cùng 1 dụng cụ
nuô
4
 Nhận dạng
các nguồn
nhiễm
• Mycoplasma
• nấm: men, mốc
• vi khuẩn
• Virus
• nhiễm chéo
• endotoxin

5
10/4/22 6

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn

• Là một loại vi khuẩn không có vách tế bào, không

bị ảnh hưởng bởi nhiều kháng sinh
Nhiễm • Khó phát hiện được sự phát triển của vi khuẩn,
mycoplasma không làm đục môi trường
• Hầu hết phát triển trên bề mặt tế bào, đặc biệt khi
có mặt của huyết thanh
 Nhiễm mycoplasma
• 1% từ nuôi cấy sơ cấp
• 5% từ những lần cấy chuyền đầu
tiên
• 15-30% từ nuôi cấy dòng tế bào
người và động vật
• Người thao tác
• Mycoplasma phát triển nhạnh do
sử dụng dụng cụ, môi trường, hoá
chất đã bị nhiễm trước đó

Electronmicroscopic photographs of mycoplasmas. Scanning electron micrograph of critical

point-dried cell cultures infected with mycoplasma grown on coverslips. (A) M. penetrans on
HELA cells; arrows indicate pear-shaped mycoplasmas penetrating the cell membrane;
dashed arrow indicates microvilli of the eukaryotic cell; magnification 30 000×. (B) MDCK cell
line infected with M. arginini; arrows indicate mycoplasmas, dashed arrow indicates
microvilli; magnification 30 000×. (C) HELA infected with A. laidlawii (arrows); bacteria are
adhered to the surface of the glass slide; magnification 20 000×. Photographs kindly provided
10/4/22 TS.byVũDr.Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn
Manfred Rohde, GBF, Braunschweig, Germany. 7
 • làm thay đổi mức độ tổng hợp RNA,
Ảnh hưởng •
DNA, protein
Thay đổi sự biến dưỡng của tế bào
của • Gây bất thường về cấu trúc và chức
năng của NST
mycoplasm • Thay đổi thành phần cấu trúc màng tế
bào (sự biểu hiện kháng nguyên, thụ
đối với tế thể bề mặt)
• Tác động đến sự dẫn truyên tín hiệu tế
bào nuôi cấy bào
• định hướng cho sự chuyển dạng của tế
bào
• làm thay đổi đặc tính tăng trưởng của
tế bào

10/4/22 8
TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn
Phương pháp Nhuộm mô học

xác định sự
hiện diện của Sử dụng kính hiển vi điện từ: TEM, SEM

mycoplasma Phương pháp sinh hoá

Enzyme assay
Gradient/electroporesis,
reparation of labeled RNA
Protein analysis

Fluorescence/enzymatic
staing with antibody
Phân tích miễn dịch ELISA
autoradiography

Nhuộm huỳnh quang DAPI stain

DNA Hoechst 33258 stain

Filter hybrisization
Lai RNA Liquid hybridization

PCR

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 9

Nhiễm mycoplasma
1
TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 10/4/22 0
 Nhiễm mycoplasma

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 11

Xác định nhiễm mycoplasma
1
TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 10/4/22 2
 dựa trên đặc tính sinh học

• Xử lý nhiệt
• lọc bằng các màng lọc microfilter
• xử lý các tổn thương màng tế bào và
nhiễm sắc thể bằng ánh sáng

Hoá học
Loại trừ
• ngâm trong thuốc tẩy
mycoplasma • rửa với ether-chloroform
• Xử lý với dung dịch đệm methyl glycerin
• Ủ trong sodium polyanethol sulfonate
• nuôi trong 6 methylpurine
deoxyriboside

Dùng kháng sinh

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 10/4/22 13

 Loại trừ mycoplasma

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 14

 vô trùng dụng cụ

Phòng thí nghiệm Sử dụng tủ cấy an

phải được giữ toàn sinh học, kiểm
sạch. tra định kỳ

Động vật không

được giữ trong Xử lý hoá chất bề
phòng nuôi cấy tế mặt thao tác
bào.

Ngăn ngừa nhiễm

Người không được tủ nuôi nên được

phép sẽ không kiểm soát và làm
được vào. sạch hàng tháng

Cần tuân thủ quy

định của PTN để các dụng cụ nhựa,
thuỷ tinh, môi
giảm thiểu sự
trường thải nên
nhiễm (sàn nhà,
được xử lý cẩn
bồn rửa, vòi nước,
thận
bể ổn nhiệt…).
vật liệu nuôi cấy
nên được chuẩn bị
tại khu vực vô
trùng

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 15

 Ngăn ngừa nhiễm
Các phương pháp phát hiện
mycoplasma đáng tin cậy
cần được thiết lập và thực
hiện.
Các thành phần môi trường
(đặc biệt là huyết thanh) Không nên dùng kháng sinh
nên được kiểm tra tính vô nếu có thể.
trùng trước khi sử dụng.

Việc thử nghiệm

tế bào nuôi cấy nên được
lấy từ các nguồn có uy tín.
Tế bào tiếp nhận nên được
Mycoplasma phải được tiến
giữ trong điều kiện đảm bảo
hành vào thời điểm nuôi cấy
cho đến khi được chứng
và thường xuyên (hàng
minh vô trùng.
tháng).

Khi phát hiện tế bào nhiễm

Mycoplasma cần được loại
bỏ ngay lập tức (hoặc bảo
quản lạnh) hoặc xử lý bằng
các biện pháp cho
mycoplasma.
Phải tuân thủ các kỹ thuật
vô trùng nghiêm ngặt và quy
trình thao tác phòng thí
nghiệm tốt.

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 16

 17
10/4/22

Nhiễm vi khuẩn
 Nhiễm nấm

§ Xuất hiện các vật thể lạ trong

dụng cụ nuôi tế bào
§ Làm thay đổi độ trong và pH của
môi trường
§ xuất hiện sau 5-14 ngày, có thể
quan sát bằng mắt thường

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 18

 Xử lý nhiễm
Dùng kháng sinh/nấm:
ampicillin;
Tái thiết lập bằng PP
amphotericin;
pha loãng tới hạn (nấm)
streptomycine,
gentamycin …

Ly tâm percoll (nấm

mốc/men)

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 19

 Nhiễm virus

virus sử dụng tế bào khó xác định và loại bỏ

chủ để nhân đôi trong nuôi cấy

nguy hại cho người xác định bằng kính hiển

thao tác, đặc biệt là vi điện tử, các phương
người hoặc tế bào sơ pháp miễn dịch học,
cấp phân tích ELISA, PCR

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 20

 Loại bỏ nhiễm virus

nhiệt cao
chiếu tia
trong thời
gamma
gian ngắn

chiếu UV-C lọc (filter)

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 21

 Nhiễm chéo

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 22

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 23
 Xảy ra khi
- đồng nuôi cấy
- Nuôi nhiều loại tế bào cùng
không gian và thời gian
- Sử dụng dụng cụ chung
- Sử dụng môi trường chung

Normal human fibroblasts (orbital shaped)

cross-contaminated with HeLa (rounded cell
colonies)

Làm mất hiệu lực của kết quả nghiên cứu

- sử dụng nhầm tế bào chưa biệt hoá gây
tai nạn tạo khối u hoặc đáp ứng miễn
dịch khi cấy ghép in vivo
- hiểu sai về cơ chế và đặc tính của tế bào
10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 24
human keratinocytes with fibroblasts
 Kiểm soát

xác định đặc tính của

thực hành các kỹ thuật
dòng tế bào ngay sau khi
thao tác vô trùng tốt
nhận

Xác định sự hiện diện của

tế bào nhiễm bằng các kỹ
thuật DNA fingerprinting,
karyotype, FCM, PCR….

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 25

 • Nội độc tố
TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn

• những chất độc gắn ở

vách vi khuẩn Gram âm,
bản chất hóa học là
lipopolysaccharid (LPS),
thường có ở các vi khuẩn
Gram âm như Salmonella,
Shigella…
• chịu được nhiệt độ sôi và
không bị phân hủy bởi
protease;
• tính kháng nguyên yếu và
không sản xuất được
thành vacxin.
• Ngoại độc tố
• chất độc do vi khuẩn tiết
ra môi trường, không
chịu được nhiệt độ sôi và
protease;
• tính kháng nguyên tốt và
có thể sản xuất thành
vacxin; có độc lực rất cao

Nhiễm nội độc tố

10/4/22 26
Ảnh hưởng của endotoxin với tế bào

1 2 3 4

ức chế sự phân chia Ảnh hưởng tới sự hoạt hoá khả năng Ảnh hưởng tới khả
tế bào bám dính của tế bào tạo khối u năng tiết và sản xuất
các yếu tố của tế bào

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 27

 Ảnh hưởng của endotoxin với tế bào

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 28

 Phát hiện

1 2 3
Phương pháp tạo Phương pháp đo độ phương pháp đo
gel khi cho thuốc đục của thuốc thử màu dựa trên sự
thử vào dung dịch lysat khi tạo gel thay đổi màu của
có chứa nội độc tố phức hợp màu-
peptid

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 29

 Phương pháp tạo gel

10/4/22 KIỂM NGHIỆM LAL

TS. Vũ Bích VÀ NỘI ĐỘC TỐ
Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 30
 Phương pháp tạo gel

!
10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 31
 Đo độ đục

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 32

 Đo màu

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 33

 Bất hoạt endotoxin

• autoclave
– 20 psi; 5 giờ, pH 8.2; hoặc 2 giờ pH 3.8
– 121oC, 15 pai, pH trung tính, 180 phút • Bất hoạt bằng phương
•
(LAL<0,01ng/ml)
Nhiệt khô
pháp sinh học
– 250oC, >30 phút • ultrafiltration , ion –
Bức xạ ion hoá
•
• sử dụng hoá chất (dung dịch acid,
exchange removal
base mạnh • Sử dụng LPS binding
• gây
10/4/22
protein
oxy hoá (hydrogen peroxide TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 34
 Lau chùi với cồn

Bố trí dụng cụ trong tủ thao tác

Kỹ thuật Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy

thao tác Thao tác với pipette

vô trùng Hơ nóng

Thao tác tủ ấm

Cung cấp khí CO2 cho dụng cụ nuôi cấy

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 10/4/22 35

Lau chùi với cồn

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 36

 Bố trí dụng cụ trong tủ thao tác

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 37

 Bố trí dụng cụ trong tủ thao tác

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 38

 Bố trí dụng cụ trong tủ thao tác

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 39

 Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 40

 Đúng Sai

Thao tác
với chai lọ
và flask
nuôi cấy

Mở nắp
dụng cụ
10/4/22

TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 41

 Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy - Mở nắp dụng cụ

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 42

 Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy – hút thay môi trường

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 43

 Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy – hút thay môi trường

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 44

 Thao tác với chai lọ và flask nuôi cấy – đổ dung dịch

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 45

 thao tác với pipette

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 46

10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 47
10/4/22 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 48