11.

Zasada:
Reakcja 1 Reakcja 2

REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASW

1. Deaminacja aminokwasw kwasem azotowym (III)

Aminokwasy pod wpywem kwasu azotowego (III), tworzcego si wg reakcji pierwszej, ulegaj reakcji deaminacji, ktrej produktami s: azot czsteczkowy (wydzielajcy si w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja -aminokwasu przebiega zgodnie z drug reakcj przedstawion poniej:

NaNO2 + CH3COOH H H C COOH + HNO2 NH2

HNO2 + CH3COONa H H C OH COOH + N2 + H2O

Reakcja ta jest podstaw w gazometrycznej metodzie ilociowego oznaczania -aminokwasw metod van Slykea. Wykonanie: W probwce zmiesza: 1 ml 10% roztworu NaNO2 (azotanu (III) sodowego), 1 ml 2 M roztworu CH3COOH odczeka, a zmniejszy si wydzielanie gazu o tej barwie i ostrej woni (tlenki azotu), po czym dopiero doda do probwki: 2 ml 1% roztworu glicyny lub innego -aminokwasu i obserwowa wydzielanie si produktu gazowego reakcji deaminacji.

2. Wykrywanie aminokwasw aromatycznych, reakcja ksantoproteinowa

Zasada: Aminokwasy aromatyczne zarwno wolne, jak i zwizane w biaku ulegaj nitrowaniu, tworzc nitrowe pochodne o barwie tej. Tylko sporadycznie mona nitrowa zwizki aromatyczne samym stonym kwasem azotowym (V). Udaje si to w przypadku zwizkw o skondensowanych piercieniach, np. antracenu, oraz w przypadku dwch aminokwasw, tyrozyny i tryptofanu. Reakcja z tyrozyn przebiega wedug nastpujcego schematu:

COOH H C H C NH3+ H + 2 HNO3 2 H2O OH O 2N

COOH
+ H C NH3

H C

NO2 OH

W reakcjach nitrowania innych zwizkw aromatycznych, w tym rwnie fenyloalaniny, najczciej wykorzystywanym azotowym elektrofilem jest kation nitroniowy, NO2+. Jon nitroniowy powstaje z kwasu azotowego (V) pod wpywem katalizujcego protonu, dostarczanego przez kwas siarkowy, zgodnie z reakcj:

H O N O O
-

H++ HSO4-

H +O +N O H O uprotonowany kwas azotowy (V)

-

+ O N O

H2O

kwas azotowy

jon nitroniowy

Uprotonowany kwas azotowy po odczeniu czsteczki wody przechodzi w jon nitroniowy. W praktyce podczas reakcji nitrowania stosuje si tzw. mieszanin nitrujc, ktra skada si ze stonego kwasu azotowego (V) oraz ze stonego kwasu siarkowego (w stosunku 1:3 v/v). W rodowisku zasadowym barwa nitrowych pochodnych aminokwasw pogbia si do topomaraczowej, skutkiem utworzenia soli.

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 1 ml: 1% roztworu tyrozyny do pierwszej, 1% roztworu glicyny do drugiej probwki, 1% roztworu biaka (albuminy, owoalbuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Do wszystkich probwek doda po 1 ml stonego kwasu azotowego (V) i ogrzewa 5 minut we wrzcej ani wodnej. Zaobserwowa, w ktrych probwkach roztwr zabarwi si na to. Nastpnie wszystkie probwki naley ozibi pod biec wod i doda po 4 ml 20% roztworu NaOH (reakcja silnie egzotermiczna!). Zaobserwowa, w ktrych probwkach roztwr zabarwi si na kolor topomaraczowy. Zinterpretowa uzyskane wyniki.

3. Wykrywanie piercienia indolowego w tryptofanie

Zasada: W rodowisku kwanym tryptofan reaguje z aldehydami, midzy innymi z kwasem glioksalowym (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa) lub aldehydem mrwkowym (reakcja Voisseneta), dajc barwne produkty kondensacji. W kwanych hydrolizatach peptydw lub biaek wynik tej reakcji jest ujemny, poniewa tryptofan podczas kwanej hydrolizy ulega zniszczeniu.
COOH H C NH3+ O 2 N H + HO C C O N H HO H C C O N H H + H2O H C H COOH H C
+ NH3

COOH
+ H C NH3

H C H

H C H

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 1 ml: 1% roztworu tryptofanu do pierwszej,
3

 1% roztworu glicyny do drugiej, 2% roztworu biaka (jaja kurzego, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Do wszystkich probwek doda 0,5 ml kwasu glioksalowego (lub formaliny) i wymiesza. W kadej prbie podwarstwi 1 ml stonego kwasu siarkowego dodajc kwas powoli, po ciance lekko przechylonej probwki, ktrej nie naley wstrzsa. Ogrzewa we wrzcej ani do 2 minut. Pojawienie si czerwonofioletowego piercienia na granicy faz oznacza dodatni wynik na obecno tryptofanu. Zinterpretowa uzyskane wyniki.

4. Wykrywanie ukadu guanidynowego w argininie, reakcja Sakaguchiego

Zasada:
Grupa guanidynowa argininy w obecnoci utleniacza bromianu (I) w rodowisku zasadowym tworzy z -naftolem barwny, pomaraczowoczerwony produkt i uwalnia si amoniak. W razie duszego dziaania NaBrO nastpuje odbarwienie roztworu, poniewa barwny produkt utlenia si dalej. Dodanie roztworu mocznika (40%) stabilizuje utworzony barwnik. Reakcja ta wykorzystywana jest do ilociowego oznaczenia argininy w biakach, szczeglnie bogatych w ten aminokwas.
OH NH H2N C NH (C H 2 )3 O H C COO +
-

+ N aBrO

N H2

H H2N C NH (C H 2 )3 C C O O - + N aBr + N H 3 N H2 2 N H 3 + 3 N aBrO N2 + 3H 2 O + 3N aBr

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 1 ml: 0,1% roztworu argininy do pierwszej, 1% roztworu glicyny do drugiej, 1% roztworu biaka (jaja kurzego, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Do wszystkich probwek doda po: 1 ml 10% roztworu NaOH, a nastpnie po 23 krople 0,2% alkoholowego roztworu -naftolu (odczynnik Molischa), kad prb dokadnie wymiesza. Do wszystkich prb doda po 0,25 ml bromianu (I) sodowego, dokadnie wymiesza i doda po: 0,5 ml 40% roztworu mocznika w celu stabilizacji pojawiajcego si pomaraczowoczerwonego barwnika. Zinterpretowa uzyskane wyniki.

5. Wykrywanie piercienia imidazolowego w histydynie, reakcja Paulyego

Zasada: Piercie imidazolowy histydyny w rodowisku zasadowym ulega reakcji sprzgania z jonem p-sulfobenzenodiazoniowym, ktrej produktem jest pomaraczowy barwnik azowy, powstajcy zgodnie z przedstawionym schematem:
COO H H C C
-

N H2 H N + 2 N H COOH H C C N H2 H N N N SO 3 N a
-

CO2 O 3S N+ N + N aC O 3 - H2O

N aO 3 S

N H

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 0,5 ml: 0,5% roztworu histydyny do pierwszej, 1% roztworu glicyny do drugiej, 1% roztworu biaka (jaja kurzego, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Otrzymywanie roztworu soli diazoniowej: 5 ml 0,5% roztworu kwasu sulfanilowego odmierzy do probwki, umieci j w zlewce z zimn wod, nastpnie do prby doda: 0,5 ml 0,5% roztworu NaNO2 i wymiesza. Otrzymany roztwr zalkalizowa za pomoc Na2CO3 in subst., sprawdzajc pH roztworu papierkiem wskanikowym. Do trzech probwek z wczeniej przygotowanymi roztworami aminokwasw lub biaka doda zalkalizowany roztwr soli diazoniowej i wymiesza. Pojawienie si pomaraczowego zabarwienia oznacza dodatni wynik na obecno histydyny. Zinterpretowa uzyskane wyniki.

6. Reakcja ninhydrynowa
Zasada: Aminokwasy pod wpywem ninhydryny ulegaj utlenieniu, dekarboksylacji, a pniej deaminacji. Przejciowo powstaje iminokwas i zredukowana ninhydryna. Nastpnie iminokwas przeksztaca si w aldehyd uboszy o jeden atom wgla, uwalnia si CO2 oraz amoniak. W obecnoci powstaego amoniaku zredukowana czsteczka ninhydryny ulega reakcji kondensacji z utlenion czsteczk ninhydryny i powstaje fioletowoniebieski produkt kondensacji zwany purpur Ruhemanna. Zalenie od rodzaju aminokwasu rna jest intensywno i odcie powstajcego zabarwienia. Reakcja ninhydrynowa jest czua i dokadna. Dodatni jej wynik daj wszystkie wolne aminokwasy w rodowisku o pH>4, dlatego reakcja ta jest powszechnie stosowana do wykazania rozdzielanych aminokwasw metod chromatograficzn (patrz wiczenie: chromatografia cienkowarstwowa). Natenie zabarwienia jest proporcjonalne do stenia -aminokwasw, dlatego reakcja ninhydrynowa stanowi podstaw metody kolorymetrycznej, ilociowego oznaczania wolnych -aminokwasw. Dodatni odczyn ninhydrynowy daj rwnie inne zwizki, ktre zawieraj grup -aminow, czyli sole amonowe, aminocukry, amoniak. Peptydy i biaka rwnie mog dawa dodatni odczyn ninhydrynowy, jednak tylko w nieznacznym stopniu;
6

zastanw si dlaczego? Reakcja aminokwasw z ninhydryn stanowi podstaw metod gazometrycznych ilociowego oznaczania aminokwasw na podstawie iloci wydzielonego CO2 lub NH3.

COOH H C R O C C O NH3 C OH OH
+

NH2

COOH H2O C NH R O C C O O C C NH4 C

+

CO 2

O C R H

H OH O C C O

+ NH3

N C

3 H2O

purpura Ruhemanna
Iminokwasy, prolina i hydroksyprolina, ktre nie zawieraj grupy -aminowej, daj w reakcji z ninhydryn produkt o barwie tej.
O C C O C OH OH +H N COOH CO2 O C C OC
+

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 1 ml: 0,1% roztworu -aminokwasu (leucyny) do pierwszej, 1% roztworu proliny do drugiej, 1% roztworu peptydu lub biaka (glutationu, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Zakwaszone roztwory aminokwasw zobojtni roztworem NaOH.

 Do wszystkich probwek doda po: 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Prby ogrza do wrzenia we wrzcej ani wodnej. Zaobserwowa pojawienie si charakterystycznego zabarwienia. Porwna i zinterpretowa uzyskane wyniki w poszczeglnych prbach.

7. Wykrywanie siarki cysteiny i cystyny

Zasada: Aminokwasy siarkowe z grupami SH lub S-S- (zarwno w stanie wolnym lub zwizanym w biakach), podczas ogrzewania w rodowisku silnie alkalicznym, przeksztacajc si w kwas pirogronowy, uwalniaj siark w postaci jonw siarczkowych. Jony siarczkowe reaguj z jonami oowiu (II), dajc czarny osad PbS. Dodatkowym produktem jest amoniak. Metionina nie daje dodatniego wyniku tej reakcji.

H HS CH2 C COO + 2 OH
-

NH2 CH3 C O
2+

COO

+ NH3 + H2O + S

2-

Pb
Wykonanie:

+ S

2-

PbS

Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 0,5 ml: 1% roztworu cysteiny lub cystyny do pierwszej, 1% roztworu metioniny do drugiej, 1% roztworu biaka: (jaja kurzego, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Do wszystkich probwek doda po: 1 kropli 0,25 M roztworu octanu oowiu (II), wymiesza i doda 2 ml 20% roztworu NaOH. Wstawi do wrzcej ani wodnej na 23 minuty. Porwna i zinterpretowa wyniki w poszczeglnych prbach.

8. Wykrywanie grup tiolowych

Zasada: Grupy tiolowe SH tworz z nitroprusydkiem sodu zwizek kompleksowy o zabarwieniu czerwonofiokowym, wedug przedstawionej reakcji:
H

[Fe

+3

(CN)5NO ]

-2

+ NH3 + HS

CH 2

COOH

NH 2 H

[Fe

+2

(CN)5 N

CH 2

+ -3 COOH] + NH 4

NH2

Wykonanie: Przygotowa trzy probwki, do ktrych naley odmierzy po 1 ml: 0,1% wieego roztworu cysteiny do pierwszej, 0,1% wieego roztworu cystyny do drugiej, 1% roztworu biaka (jaja kurzego, albuminy, elatyny lub rozcieczonej surowicy) do trzeciej. Do wszystkich probwek doda po: 1 ml 1% wodnego roztworu nitroprusydku sodu, nastpnie siarczanu amonu in subst. do nasycenia roztworu, po czym prby zalkalizowa amoniakiem pod dygestorium. Pojawienie si czerwonofiokowego zabarwienia prb oznacza dodatni wynik na obecno grup tiolowych. Porwna i zinterpretowa wyniki w poszczeglnych prbach. ODCZYNNIKI 10% roztwr NaNO2; 2 M roztwr CH3COOH; 1% wodny roztwr glicyny; 1% wodny roztwr lizyny; 0,1% wodny roztwr argininy; 0,5% wodny roztwr histydyny; 1% wodny roztwr proliny; 1% roztwr tyrozyny w 0,1 M HCl; 1% roztwr fenyloalaniny w 0,1 M HCl; 1% roztwr tryptofanu w 0,1 M HCl; 0,1% roztwr leucyny w 0,05 M HCl; 1% roztwr cysteiny w 0,1M HCl; 1% roztwr cystyny w 0,1 M HCl; 1% roztwr metioniny; 1% wodny roztwr biaka; 20-krotnie rozcieczone biako jaja kurzego (biako jaja roztrzepywa bagietk szklan, doda dwudziestokrotn objto wody, po maksymalnym roztrzepa-

niu, przesczy); 2% roztwr albuminy w 0,9% NaCl; 2% roztwr elatyny w 0,9% NaCl; surowica bydlca 10-krotnie rozcieczona 0,9% NaCl; 1% roztwr glutationu; stony HNO3; stony H2SO4; 20% NaOH; 10% NaOH; stony NH3aq.; aldehyd mrwkowy (formalina) lub kwas glioksalowy (sporzdzony w nastpujcy sposb: a) przygotowa zawiesin magnezow: 10 g pyu magnezowego doda do 200 ml H2O w 2-litrowej zlewce; b) osobno przygotowa nasycony roztwr kwasu szczawiowego 25 g kwasu szczawiowego do 250 ml H2O; roztwr b wla do zawiesiny a mieszanin szybko schodzi, przesczy przez sczek z bibuy i odrzuci osad szczawianu magnezu); 0,2% etanolowy roztwr -naftolu; roztwr NaOBr (sporzdzony nastpujco: do 100 ml 5% NaOH doda 0,62 ml bromu przed uyciem roztwr ten rozciecza 10-krotnie 5% NaOH); 40% roztwr mocznika; 0,5% roztwr kwasu sulfanilowego w 2 M HCl; 0,5% roztwr NaNO2; Na2CO3 in subst.; papierki wskanikowe; 0,1% roztwr ninhydryny w 50% etanolu; 0,25 M roztwr octanu oowiu (II); 1% wodny roztwr nitroprusydku sodu; (NH4)2SO4 in subst.

NOTATKI

10