- Bektorea eta gure genea murrizketa entzima berdinekin moztuko ditugu

- Horrela, beraien artean mutur itsaskorrak izango dituzte

- Mutur horiek genea eta bektorearen arteko lotura ahalbidetuko dute

DNA birkonbinatua
Klonazio-bektoreak
 Klonazio-bektoreak
BEKTOREAK:

- DNA molekula zirkular eta txikiak dira

- Zeluletan autonomoki erreplikatzen dira

- Funtzioa: DNA zati bat edo gene bat garraiatzea

- Naturalak eta espezifikoak badira ere, egun artifizialki eraldatuak erabili

ohi dira eta asko komertzialki eskura daitezke

- Haien sekuentzia osoa ezaguna da

- Ostalari egokian haziko dira  zelulen hautaketa (screening)

 Klonazio-bektoreak
Bektore desberdinak daude:

a) Zelula ostalariak (espeziea)

b) Hartzen duten DNA berriaren tamaina

c) Ezaugarri genetiko/ fenotipikoak

1. Plasmidoak: pBR322

2. Bakteriofagoak:  fagoa.

3. Bakterioen kromosoma artifizialak (BACs)

4. Legamien kromosoma artifizialak (YACs)

 Klonazio-bektoreak:

- Plasmidoak
- Bakteriofagoak
- BAC (bakterioen kromosoma artifizialak)
- YAC (legamien kromosoma artifizialak)
 PLASMIDOAK (KLONAZIOA)
• Harizpi bikoitzeko DNA molekula zirkularrak (5.000-400.000 bp). DNA zati
“txikiak” klonatzeko erabiliak: 15000 bp

• Zelula ostalaria: Bakterioak (Escherichia coli…), legamiak, ugaztun

zelulak, intsektu zelulak…

• Osagaiak:

– Gehienetan antibiotikoekiko erresistentziarako geneak dauzkate:

anpizilina, kanamizina… (hautaketa markatzailea)

– Ori: erreplikazioaren abiapuntua

– Polilokarria: Errestrikzio gune desberdinak dauzkan sekuentzia

 1. Erreplikatzeko gunea
• ORI (Origin replication site): DNA erreplikazioa burutzeko beharrezkoak
diren proteinek ezagutzen duten sekuentzia
 2. Hautespen-markatzailea
(Selective marker)
Antibiotikoekiko erresistentzia genea (Bakterioetan hautespena egiteko)
• Antibiotikoaren presentzian plasmidoa
daukaten bakterioak soilik hazi egingo dira,
zelula bizirik egotea baimentzen baitu

• Beharrezkoa da plasmidoa zelula barruan

mantentzeko -> Presio selektiboa

• Antibiotikoekiko erresistentzia gene desberdin

daude: anpizilina, neomizina, kloranfenikol,
kanamizina….
 3. Polilokarria
(Multiple cloning site (MCS) edo polylinker)

• DNA sekuentzia labur bat da

• Errestrikzio gune desberdinak dauzkan sekuentzia bat da (20 bat izan

ditzake)

• Sekuentzia horiek ez daude beste inon plasmidoan

• Klonazioetan oso erabilgarriak

dira DNA sekuentzia bat edo

gehiago sartzeko
 Polilokarria

Endonukleasen 4-6 bp-ko

sekuentzia palindromikoak

Polilokarria: zenbait murrizketa-

endonukleasarako itu-sekuentzia
bana dituen DNA zatia
 Klonazioa plasmidoetan

Mutur
itsaskorrak
oso egokiak
dira DNA Mutur
zatiak lotzeko kamutsak
 Klonazio-bektoreak:

- Plasmidoak
- Bakteriofagoak
- BAC (bakterioen kromosoma artifizialak)
- YAC (legamien kromosoma artifizialak)
Bakteriofagoak:
E.coli-ren λ fagoak (birusak)
• DNA zati handiagoak klonatzeko
(23.000 bp)

• Guztira 40.000-50.000 bp izan

dezakete:

– 30.000bp derrigorrezkoa

– 23.000 bp ordezkagarria
interesezko DNArekin
ordezkatu

• Euren kabuz ugaldu eta

paketatzeko gai dira

• Zeluletan “infekzioz” sartzen dira

15
λ fagoak (birus-bektoreak)
 Klonazio-bektoreak:

- Plasmidoak
- Bakteriofagoak
- BAC (bakterioen kromosoma artifizialak)
- YAC (legamien kromosoma artifizialak)
BAC (bakterioen kromosoma artifizialak)

• DNA molekula handien klonaziorako

(100.000- 300.000 bp)

• Elektroporazioz sartzen dira zelula

ostalarian
 Klonazio-bektoreak:

- Plasmidoak
- Bakteriofagoak
- BAC (bakterioen kromosoma artifizialak)
- YAC (legamien kromosoma artifizialak)
 YAC
(legamien kromosoma artifizialak)

•Legamietan ( Saccharomyces
cerevisiae) eukariotoen geneak
klonatzeko eta geneen funtzioak
aztertzeko aproposak

• 2 *10^6 bp inguru klona daitezke

•Legamien kromosometan bezala

zentromeroa (CEN) eta telomeroak
(TEL) ditu bere baitan

20
 Adierazpen-bektoreak

Helburua: klonatutako DNA adieraztea  Proteina

• Plasmido edo birus bereziak izaten dira proteina baten ekoizpenerako
prestatutakoak. Gene jakin bati dagokion proteina zelula batean
sintetizatzeko erabiltzen dira

• Plasmidoak transkripzio eta itzulpenerako behar diren sekuentzia

erregulatzaile guztiak behar ditu eraman, proteinaren ekoizpen
optimorako (sekuentzia erregulatzaileak: sustatzaileak, bacterial
ribosome binding site, hasiera eta amaiera...)

• Helburua mRNA egonkorra ematea izango da geroxeago itzultzeko

• Adierazpen-bektoreak oinarrizko tresna dira bioteknologian proteinak

“industrialki” ekoizteko erabil ohi dira, besteak beste
• Plasmidoak transkripzio eta itzulpenerako behar diren sekuentzia
erregulatzaile guztiak eramango ditu
• Zelula ostalaria (sistema biologikoa) aukeratzeko, kontuan hartu
beharko da genea/proteina prokariotiko ala eukariotiko den,
transkripzio eta itzulpenaren ondoko aldaketak jasan behar dituen,
etab.

• Proteina eukariotikoak adierazteko: legamiak, intsektuak edota animalia

zelulak erabili ahal dira (Itzulpen ondoko aldaketak)

• Kasu askotan proteinaren pilaketak ondorio toxikoak izan ditzake zelula

ostalariengan

• Baldintza ezberdinak betetzen dituzten bektoreak garatu (eraldatu) dira

ekoizpena hobetzeko. Adibidez, fusio-proteinen purifikazioa errazteko
 Transkripzioaren erregulazioa
lac operoia (Faktore eragileak)
lac operoia
DNA

lacI lac-
mRNA mRNA

Errepresorea β-galaktosidasa Galaktosido Transazetilasa

permeasa

Legenda:
PI: I genearen promotorea
P: lac geneen promotorea
O1: lac operoiaren operatzaile nagusia
O2 eta O3: operatzaile sekundarioak. Lac

Laktosaren metabolismoa E.colin

errepresorearekiko afinitate txikiagoa daukate
lac operoia
lac I
 lac operoiak erregulazio negatiboa du
operoia
Laktosaren ausentzian
RNA
Egitura
Gene Operatzailea
erregulatzailea polimerasa geneak
(lacI)

Transkripzioa
Transkripziorik EZ
etaitzulpena
1 Laktosaren ausentzian errepresorea
Errepresore operatzaileari batzen da eta
aktiboa transkripzioa inhibitzen du

RNA Operatzailea
Laktosaren presentzian polimerasa

Transkripzioa Transkripzioa
5 Ondorioz gene
eta itzulpena eta itzulpena
estrukturalak transkribatu
Errepresore aktiboa 4 Errepresorea ezin eta itzuli egiten dira
da DNAra lotu

Errepresore
3 Alolaktosaerrepresoreari
inaktiboa
batzen da berau inaktibatuz
β-galaktosidasa permeasa transazetilasa
Alolaktosa
Glukosa
2 Laktosa dagoenean, parte
bat alolaktosa bilakatzen da Laktosa Galaktosa

http://highered.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter16/the_lac_operon.html
 pET adierazpen-sistema
T7 RNA polimerasa birikoa erabiliko dugu gure genea adierazteko,
transkripzio eraginkortasun handia eta azkarra baitu.

E. coli genoma

- T7 RNA polimerasaren genea lac promotoreak - Gure plasmidoan T7 RNA polimerasak

kontrolatzen du. ezagutzen duen sustatzailea edukiko dugu.
Hortaz, T7 RNA polimerasak gure
-lac promotorea E.coli-ren genoman dago.
genearen transkripzioa burutuko du.
Orduan, RNA polimerasa bakterianoak T7 RNA
polimerasa genearen transkripzioa burutuko du.
lacI genea, T7 sustatzailea…
pET sisteman oinarritzen diren
bi adierazpen bektoreen
adibideak
Fusio proteina bat adierazteko erabili ahal den
adierazpen bektore baten adibidea