2014-12-10

METODY ANALITYCZNE
METODY ANALITYCZNE Metody miareczkowe
• alkacymetria (alkalimetria,
Metody instrumentalne
• metody fizyczne
STOSOWANE W ANALIZIE acydymetria);
• redoksymetria (r-kcje
• oznaczanie gęstości
• oznaczanie lepkości
utleniania lub redukcji);
ŻYWNOŚCI • miareczkowanie
• chromatografia
• spektrofotometria
strąceniowe;
• fluorymetria
• kompleksometria;
• absorpcyjna spektrometria
KATARZYNA ZABŁOCKA-SŁOWIŃSKA • miareczkowanie
• atomowa
potencjometryczne;
• emisyjna spektrometria
• atomowa
KATEDRA I ZAKŁAD BROMATOLOGII I DIETETYKI • kolorymetria
AKADEMIA MEDYCZNA WE WROCŁAWIU • metody ekstrakcyjne
• metody immunometryczne i
enzymatyczne
• elektroforeza kapilarna

ANALIZA MIARECZKOWA
 Dział analizy ilościowej, której podstawą jest miareczkowanie -
czynność polegająca na dodawaniu TITRANTA do r-ru zawierającego
jeden lub więcej oznaczanych składników.
METODY TITRANT = ROZTWÓR MIANOWANY– roztwór zawierający reagent o
znanym stężeniu.

MIARECZKOWE PUNKT RÓWNOWAŻNOŚCI MIARECZKOWANIA – punkt, który odpowiada

teoretycznie stechiometrycznemu przereagowaniu oznaczanego składnika
z dodawanym titrantem.

PUNKT KOŃCOWY MIARECZKOWANIA – punkt, w którym

wystąpi odpowiednia zmiana, świadcząca o osiągnięciu lub
nieznacznym przekroczeniu punktu równoważności

PUNKT KOŃCOWY = PUNKT RÓWNOWAŻNOŚCI

GRAFICZNY OBRAZ ANALIZA MIARECZKOWA

Idealna sytuacja:
MIARECZKOWANIA PUNKT KOŃCOWY = PUNKT RÓWNOWAŻNOŚCI
Błędy podczas miareczkowania:
-błąd ujemny
-błąd dodatni

Należy dążyć do tego, aby błąd miareczkowania jest jak najmniejszy: 0,05
– 0,1%.
Aby uzyskać jak najmniejszy błąd pomiaru stosuje się różne metody
detekcji, wybierając najlepszą z nich.

METODY DETEKCJI:
-wzrokowa
-instrumentalna (potencjometria, konduktometria, miareczkowanie
amperometryczne, miareczkowanie fotokolorymetryczne)

1
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

PODZIAŁ METOD MIARECZKOWYCH

1. Ze względu na typ reakcji

2. Ze względu na sposób prowadzenia miareczkowania

PODZIAŁ METOD
M.ODWROTNE
ZE WZGLĘDU NA
TYP REAKCJI
Nadmiar TITRANTU odmiareczkowuje
M.BEZPOŚREDNIE się innym, odpowiednio
Używany jest jeden dobranym roztworem mianowanym
roztwór mianowany - TITRANT
M.PODSTAWIENIOWE
Miareczkuje się substancję będącą produktem
reakcji składnika oznaczanego z odczynnikiem
(oznaczenia jodometryczne)

Oznaczanie liczby nadtlenkowej

RO 2 +2KJ + CH 3COOH R-O + J 2 + CH 3COOK + H 2O
J 2 + 2Na2S2O4 2NaJ + Na2S4O6

ALKACYMETRIA – METODA ALKACYMETRIA – METODA

ZOBOJĘTNIANIA
ZOBOJĘTNIANIA
 W celu przeprowadzenia oznaczenia istotny jest pomiar wartości pH, który można
Nazywana również analizą objętościową dokonać następującymi metodami:
Metoda miareczkowa polegająca na oznaczaniu -metoda wizualna – wskaźniki pH
-metoda potencjometryczna – pomiar potencjału elektrody
kwasów zasadami (alkalimetria) bądź zasad –
kwasami (acydymetria).
Metoda powszechnie stosowana do oznaczania
kwasów i zasad, zarówno organicznych jak i
nieorganicznych.

ALKACYMETRIA –
ALKACYMETRIA - PRZYKŁADY C.D.
BIAŁKA: PRZYKŁADY  TŁUSZCZE
- SAPONIFIKACJA - liczba zmydlenia (LZ)- liczba mg KOH, potrzebnych
1. mineralizacja próbki w obecności stęż. H2SO4 i katalizatorów
2. destylacja amoniaku z parą wodną do zmydlenia zestryfikowanych i zobojętnienia wolnych kwasów
tłuszczowych, zawartych w 1 g tłuszczu.
3. miareczkowanie:
2NH4OH + H2SO4 → (NH4 )2SO4+ 2H2O LZ = (a-b) ∙ 28,055 / m
H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 +H2O a – obj. 0,5 M HCl potrzebna do zmiareczkowania ślepej próby [cm3 ]
b– obj. 0,5 M HCl potrzebna do zmiareczkowania badanej próby [cm3
]
28,055 – ilość KOH obecna w 1 cm3 0,5 M r-ru KOH
m- masa tłuszczu

2
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D. ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D.
- liczba kwasowa (LK)- wyraża ilość mg KOH,
potrzebną do zobojętnienia wolnych kwasów
tłuszczowych zawartych w 1g tłuszczu. - na podstawie wartości LZ i LK można wyliczyć liczbę
RCOOH + KOH → RCOOK + H20 estrową (LE), czyli ilość mg KOH, potrzebną do
LK = a ∙ 5,611/m zmydlenia zestryfikowanych kwasów tłuszczowych,
a - obj. 0,1 M KOH potrzebna do zmiareczkowania naważki zawartych w 1 g tłuszczu.
tłuszczu [cm3 ]
Liczba Estrowa = Liczba Zmydlania-Liczba Kwasowa
5,611 - ilość KOH zawarta w 1 cm3 mianowanego r-ru [mg]

m- masa badanego tłuszczu [g]

ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D.
KWASY ORGANICZNE
 Kwasy organiczne odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu jakości i
wartości odżywczej różnych produktów spożywczych.
 Wyróżnia się:
- kwasy naturalnie występujące w surowcach
- kwasy powstające w procesach fermentacyjnych
- kwasy dodawane celowo do żywności jako substancje zakwaszające,
stabilizujące, konserwujące (kwas benzoesowy, sorbowy)
- kwasy powstające w wyniku aktywności enzymów rodzimych lub
drobnoustrojów prowadzących do rozkładu tłuszczów, w wyniku czego uwalniane
są kwasy tłuszczowe
ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D.
 Analizę kwasów organicznych obejmują badania:
- ich ogólnej zawartości poprzez wyznaczanie kwasowości
produktów spożywczych
- oznaczania ilości kwasu lub kwasów charakterystycznych dla
danego produktu.
 W badaniach kwasowości wykonuje się
oznaczenia kwasowości aktywnej (czynnej) i
potencjalnej (biernej). Dodatkowo ważną
pozycję zajmuje wyznaczanie kwasowości lotnej.

ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D. ALKACYMETRIA -
Kwasowość aktywna
PRZYKŁADY C.D.
 dotyczy jedynie jonów hydroniowych H3O+ i wyrażana jest Kwasowość aktywną wyznacza się
jako pH;
 w głównej mierze zależy od mocy kwasu obecnego w
z udziałem metod:
roztworze.
 Odgrywa znaczącą rolę w charakterystyce produktów -potencjometrycznych
spożywczych, gdyż:
-wskazuje na stopień zakwaszenia, -kolorymetrycznych - polegających na określeniu pH
przy użyciu wskaźników kwasowo-zasadowych, tj. papierków
-charakteryzuje jakość i smak lakmusowych lub wskaźników jedno-, dwu- lub wielobarwnych,
-pozwala ocenić możliwość rozwoju niektórych które zmieniają barwę przy różnych stężeniach pH. Metody te są
drobnoustrojów. jednak mało dokładne.

3
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

ALKACYMETRIA – ALKACYMETRIA – PRZYKŁADY C.D.

PRZYKŁADY C.D.
Kwasowość ogólna = potencjalna = bierna
• – całkowite stężenie w r-rze kwasowych atomów wodoru,  Kwasowość ogólną wyznacza się z udziałem metod:
występujących zarówno w postaci zdysocjowanej jak i -miareczkowania alkacymetrycznego wobec
niezdysocjowanej, które w reakcji z zasadami ulegają
wskaźników (najczęściej fenofloftaleiny)
zobojętnieniu. Jest ona jednakowa dla kwasów słabych i
mocnych, przy tym samym stężeniu molowym jonów
wodorowych w r-rze. -miareczkowania potencjometrycznego

ALKACYMETRIA –
PRZYKŁADY C.D.
KWASOWOŚĆ LOTNA - wynika z obecności w produktach spożywczych
niskocząsteczkowych kwasów lotnych, takich jak kwasy: octowy, mrówkowy,
masłowy, propionowy. Poziom tych kwasów jest często wskaźnikiem
prawidłowo prowadzonego procesu technologicznego oraz składowania
produktów i surowców.
 Metoda: lotność kwasów jest cechą powszechnie wykorzystywaną przy ich
oznaczaniu.
 Etapy:
- destylacja kwasów lotnych
- miareczkowanie alkacymetryczne oddestylowanego kwasu
REDOKSYMETRIA
 Redoksymetria – dział analizy, wykorzystujący
metody
reduktometryczne bądź oksydometryczne.
 Reduktometria – miareczkowanie odbywa się czynnikiem
redukującym a substancja oznaczana musi być w postaci
utlenionej.
 Oksydymetria -miareczkowanie odbywa się czynnikiem
utleniającym a substancja oznaczana musi być w postaci
zredukowanej.

REDOKSYMETRIA –
PRZYKŁADY
 WĘGLOWODANY – wśród metod chemicznych dominującą rolę w oznaczaniu REDOKSYMETRIA – PRZYKŁADY C.D.
zawartości węglowodanów w produktach spożywczych odgrywają metody
oparte na redukcji Cu2+ przez cukry redukujące, w środowisku alkalicznym, w
temp. wrzenia. TŁUSZCZE
- metoda Fehlinga - opiera się na redukcji jonów miedzi (II) do miedzi (I) w -liczba nadtlenkowa (liczba cm3 0,002 M tiosiarczanu sodu potrzebna
obecności winianu sodowo-potasowego. Koniec miareczkowania rozpoznaje się do redukcji jodu wydzielonego z KI przez nadtlenki obecne w 1 g tłuszczu.)
po zaniku barwy niebieskiej.
- metoda Lane-Eynona – modyfikacja metody Fehlinga (pod koniec RO2 + RCOOH + KJ RO + RCOOK + J2 +H20
miareczkowania dodawany jest błękit metylenowy, będący wskaźnikiem oksydo- J2 + Na2S204 2NaJ + Na2S406
redukcyjnym).
- metoda Nizowkina - Jemielianowej –dodanie wskaźnika błękitu metylenowego - liczba jodowa (liczba g wolnego jodu przyłączona do wiązań
podwójnych 100 g tłuszczu)
w postaci rozpuszczonej w odczynniku Fehlinga I. R-CH=CH-R + J2 R-CHJ-CHJ-R
-metoda Bertranda – polega na przeprowadzeniu w roztworze alkalicznym J2 + Na2S2O3 2NaJ + Na2S4O6
redukcji soli miedzi cukrem i oznaczeniu miedzi w wydzielonym tlenku miedzi (I).
Oznaczanie Cu polega na utlenieniu Cu2O w wyniku redukcji jonów Fe (III) do Fe
(II) i oznaczeniu Fe (II) manganometrycznie
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + FeSO4 + H20
10 FeSO4 + KMnO4 +8H2SO4 5Fe(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

4
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

KOMPLEKSOMETRIA
 KOMPLEKSOMETRIA –tworzenie się trwałego, trudno dysocjującego,
rozpuszczalnego związku kompleksowego.
miareczkowanie chelatometryczne (miareczkowanie za pomocą
EDTA)
miareczkowanie niechelatometryczne (reakcja jonów rtęciowych
z jonami jodkowymi)
Hg2+ + 4Cl- HgCl2-4
HgCl2-4 + Hg2+ 2HgCl2
 Kompleksometryczne oznaczanie wapnia – polega na miareczkowaniu r-rów
zawierających kationy wapnia mianowanym r-rem EDTA (kwas
etylenodwuaminoczterooctowy). Zaletą tej metody jest możliwość
oznaczania oprócz wapnia również magnezu w tym samym r-rze
zmineralizowanej próbki.
POTENCJOMETRIA
• Metody potencjometryczne – pozwalają na wyznaczenie
pH badanego roztworu poprzez pomiar SEM ogniwa,
którego jednym półogniwem jest elektroda
wskaźnikowa, a drugim – elektroda porównawcza o
stałej wartości.
MIARECZKOWANIE
POTENCJOMETRYCZNE
• Miareczkowanie potencjometryczne –Analizę
przeprowadza się dodając małymi porcjami kwas lub
zasadę do roztworu badanego, umieszczonego na
mieszadle magnetycznym. Jednocześnie przeprowadza
się pomiar pH.
• Jonoselektywne Elektrody Membranowe
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
2014-12-10
MIARECZKOWANIE
STRĄCENIOWE
 MIARECZKOWANIE STRĄCENIOWE – PRECYPITOMETRIA – wydzielanie
oznaczanej substancji w postaci trudno rozpuszczalnego osadu przy
użyciu mianowanego r-ru drugiej substancji.
 Oznaczanie chlorków:
- metoda Mohra -miareczkowanie r-ru zawierającego jony Cl- mianowanym
r-rem AgNO3 wobec CrO42- jako wskaźnika. Podczas miareczkowania
początkowo wytrąca się chlorek srebra, a następnie chromian srebra
(czerwonobrunatne zabarwienie)
- metoda Volharda – wytrącenie jonów Cl- w środowisku kwaśnym za
pomocą nadmiaru dokładnie odmierzonej ilości AgNO3 i
odmiareczkowaniu nadmiaru soli za pomocą SCN- w obecności
Fe(NH4)(SO4)2 aż do różowoczerwonego zabarwienia r-ru.
POTENCJOMETRIA
 Prawo Nernsta: SEM ogniwa złożonego z dwóch elektrod
zanurzonych w badanym roztworze zależy od stężenia
odpowiednich jonów w nim zawartych.
Szerokie zastosowanie potencjometrii:
-miareczkowanie alkacymetryczne
-miareczkowanie redox
-miareczkowanie strąceniowe
-oznaczanie kwasowości produktów żywnościowych
MIARECZKOWANIE
POTENCJOMETRYCZNE
5
 2014-12-10

MIARECZKOWANIE
POTENCJOMETRYCZNE
CECHY METOD POTENCJOMETRYCZNYCH:
 duża szybkość oznaczenia
 brak koniczności stosowania wskaźników PK


prostota wykonania
łatwość automatyzacji
METODY



możliwa daleko idąca miniaturyzacja
prostota aparatury
szerokie zastosowanie w różnych rodzajach
INSTRUMENTALNE
miareczkowania
 możliwość dokonania pomiaru pH
 duża selektywność pomiarów – przy zastosowaniu
membran jonoselektywnych

METODY
CHROMATOGRAFIA
INSTRUMENTALNE
Chromatografia – fizyczny rozdział składników
jednorodnych mieszanin w wyniku ich podziału
• Metody instrumentalne – metody, w których sygnał między dwie fazy: ruchomą i nieruchomą układu
analityczny uzyskuje się za pomocą aparatury pomiarowej. chromatograficznego. Umożliwia analizę
• Wśród wielu dostępnych metod instrumentalnych, do analizy jakościową i ilościową
żywności stosuje się najczęściej:
-chromatografię
-metody spektroskopowe

CHROMATOGRAFIA
• Najbardziej rozpowszechnione metody:
- chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
- chromatografia gazowa (GC)
- wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
• Wybór metody podyktowany jest przede wszystkim:
 rodzajem badanej żywności
 rodzajem składników pożywienia, które są analizowane
względami ekonomicznymi
CHROMATOGRAFIA –
POJĘCIA PODSTAWOWE
 Faza stacjonarna (nieruchoma) – ciało stałe bądź ciecz osadzona na
nośniku, żel.
 Faza ruchoma, mobilna (eluent) – ciecz, gaz lub ciecz, gaz w stanie
nadkrytycznym (fluid), które kontaktując się z fazą stacjonarną
powodują migrację substancji rozdzielanej.
 W układzie chromatograficznym musi być zagwarantowana
odrębność faz (różnica polarności). Zazwyczaj faza silnie polarna jest
fazą stacjonarną a mniej polarna – fazą ruchomą i przepływa przez
fazę stacjonarną.
 Czas przebywania danego składnika w kolumnie to CZAS RETENCJI

6
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

PODZIAŁ METOD
PODZIAŁ METOD CHROMATOGRAFICZNYCH
CHROMATOGRAFICZNYCH • Chromatografię jonowymienną:
- podstawę rozdzielania stanowią reakcje wymiany jonowej między
Ze względu na zjawiska decydujące o procesie rozdziału jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą stacjonarną -
wyróżniamy: jonitami. Jonity to wielkocząsteczkowe substancje
• Chromatografię adsorpcyjną nierozpuszczalne w wodzie zdolne do wymiany jonów.
- rozdział mieszanin jest uwarunkowany różnym • Chromatografię sitową (żelową)
powinowactwem adsorpcyjnym składników mieszaniny do - o rozdziale substancji decydują rozmiary cząstek. Wypełnienie
odpowiednio dobranej powierzchni fazy stacjonarnej kolumn stanowią żele o średnicach porów zbliżonych do
• Chromatografię podziałową rozmiarów cząsteczek analizowanych substancji. Substancje
rozdzielane o rozmiarach cząsteczek większych od średnicy porów
- rozdział mieszanin oparty na różnicach w wartościach
współczynnika podziału między dwie nie mieszające się fazy ( wypełnienia przechodzą do eluatu, cząsteczki o mniejszych
rozmiarach wnikają w pory żelu i wolniej przesuwają się wzdłuż
ciecz na nośniku – ciecz, fluid, gaz)
kolumny.

PODZIAŁ
CHROMATOGRAFICZNYCH SCHEMAT CHROMATOGRAFU GAZOWEGO

METOD ROZDZIELANIA
FAZA CIEKŁA FAZA STAŁA
FAZA STACJONARNA
PODZIAŁ ADSORPCJA
ZASADA ROZDZIAŁU
GAZOWA Chromatografia Chromatografia
FAZA Chromatografia gazowa podziałowa gazowa adsorpcyjna
RUCHOMA gazowa
CIEKŁA Chromatografia Chromatografia
Chromatografia cieczowa cieczowa
cieczowa podziałowa adsorpcyjna

WYNIK ANALIZY -
CHROMATOGRAM
OPRACOWANIE WYNIKÓW

• podstawą analizy jakościowej, czyli identyfikacji

pików odpowiadających poszczególnym składnikom
próbki, są wielkości retencyjne
• porównuje się czas retencji piku identyfikowanej
substancji z czasem retencji piku wzorca,
chromatografowanych w jednakowych warunkach

7
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

OPRACOWANIE WYNIKÓW
– ANALIZA ILOŚCIOWA
 metoda wzorca zewnętrznego – metoda krzywej kalibracyjnej -
przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory
substancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanych
substancji w kilku różnych stężeniach
 na podstawie powierzchni lub wysokości pików wyznacza się
przebieg krzywej kalibracyjnej, bądź oblicza się wartości
współczynników w równaniu kalibracyjnym dla każdej z
oznaczanych substancji
WADY I ZALETY METODY
WZORCA WEWNĘTRZNEGO
 pozwala na skorygowanie strat w przypadku
złożonej, wieloetapowej procedury przygotowania
(izolacja, wzbogacanie, derywatyzacja itp.)
 uniezależnienie otrzymywanych wyników od wahań
ilości dozowanej próbki.
 bogata matryca -trudny dobór odpowiedniej
substancji jako wzorca wewnętrznego.
 metoda nieco bardziej pracochłonna niż metoda
krzywej kalibracyjnej.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
– ANALIZA ILOŚCIOWA
• metoda dodatku wzorca - dodanie do próbki znanych ilości
(najkorzystniej znanej masy) analitów
• na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się
krzywą kalibracyjną, tj. zależność powierzchni piku analitu w
funkcji ilości analitu dodanej do próbki
• umożliwia wykonanie kalibracji w „matrycy rzeczywistej”
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
2014-12-10
OPRACOWANIE WYNIKÓW
– ANALIZA ILOŚCIOWA
• metoda wzorca wewnętrznego -polegająca na dodaniu do
próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca wewnętrznego
(IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i
nie może być obecny w analizowanych próbkach przed
jego dodaniem.
• wykreśla się zależność stężenia analitu w funkcji stosunku
powierzchni piku analitu do piku wzorca wewnętrznego
METODA DODATKU
WZORCA WEWNĘTRZNEGO
• Zastosowanie mają związki, które przypominają badane anality w jak największym stopniu i
dodają je do próbki przed jej obróbką lub przygotowaniem do analizy. Wzorzec wewnętrzny
powinien charakteryzować się właściwościami chemicznymi, chromatograficznymi i
widmami, zbliżonymi do właściwości analitu, a ponadto wzorzec powinien być oddzielony
od badanego analitu.
• Wzorzec wewnętrzny powinien charakteryzować się znaną chemiczną strukturą, być
dostępny o wysokiej czystości.
• Idealny standard wewnętrzny jest np. izotopem analitu, który będzie koeluował z analitem
ale będzie można go rozdzielić metodą MS lub alternatywną metodą taką jak detekcja
radiometryczna. Ponieważ układ detekcji przy zastosowaniu UV, fotodiod, jest najczęściej
stosowany w HPLC, izotopy nie wystarczają. Dlatego też, użytkownik musi wybrać
odpowiedni analit, którego struktura różni się nieznacznie ale jest podobna do właściwości
chromatograficznych i związanych ze zwrotem.
• We metodzie wzorca wewnętrznego kształt i symetria piku powinny być zbliżone do tych
• parametrów, które charakteryzują analit. Stężenie wzorca dodanego do próbki powinno być
zbliżone do stężenia analitu.
CHROMATOGRAFIA
GAZOWA - PRZYKŁADY
• oznaczanie zawartości kwasów tłuszczowych
wyekstrahowany tłuszcz poddaje się hydrolizie
zasadowej, a następnie uwolnione kwasy
przeprowadza się w estry metylowe.
• oznaczanie fitosteroli
8
 2014-12-10

CHROMATOGRAFIA –
CHROMATOGRAFIA PRZYKŁADY C.D.
CIECZOWA - PRZYKŁADY
 Oznaczanie cukrowców metodą chromatografii bibułowej i
• szeroki zakres i uniwersalność tej techniki analitycznej cienkowarstwowej - umożliwia identyfikację większości cukrów
prostych i ich pochodnych
• podstawowy warunek - istnienie rozpuszczalnika dla  Oznaczanie białek metodą chromatografii bibułowej
analizowanej substancji dwukierunkowej, cienkowarstwowej, chromatografii
jonowymiennej.
• Przykłady:  Oznaczanie karotenoidów metodą chromatografii kolumnowej
• rozdzielanie i detekcja chlorofilu metodą HPLC  Oczyszczanie ekstraktów tiaminy –za pomocą chromatografii na
kolumnie kationitowej. Tiamina ulega sorpcji na kolumnie, a
• możliwość rozdzielania peptydów i białek aniony i związki niezdysocjowane usuwane są przez przemywanie
wodą.
• zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej  Oczyszczanie pirydoksyny i oznaczanie poszczególnych jej form.
w analizie witamin Oczyszczanie polega na rozdziale chromatograficznym
hydrolizatów w kolumnie jonowymiennej.

PROMIENIOWANIE
ZJAWISKA OPTYCZNE - ELEKTROMAGNETYCZNE
ABSORPCJOMETRIA Zakres długości fal promieniowania elektromagnetycznego

• Dział analizy chemicznej, w którym jako podstawę ilościowego

oznaczania substancji w roztworze wykorzystywana jest zależność
między wartością absorpcji fali elektromagnetycznej o określonej
długości a stężeniem zawartej w tym roztworze substancji.
Zakres długości fal światła widzialnego
• Absorpcjometria nazywana jest również spektrofotometrią
absorpcyjną.

PRAWA ABSORPCJI PRAWO ABSORPCJI

 Jeżeli na warstwę jednorodnego ciała pada wiązka światła jednobarwnego o
natężeniu (I0), to pewna część tego światła zostanie odbita (Ir), część ulegnie
absorpcji (Ia), a reszta zostanie przepuszczona (It). prawo Lamberta-Beera
I0 = Ir + Ia + It
 W przypadku r-rów wodnych odbicie światła jest bardzo małe i dlatego można A = α∙l∙c
je pominąć. α – współczynnik absorpcji
I0 = Ia + It
 Transmitancja= przepuszczalność – określa jaka część światła, wyrażona w
l – długość drogi optycznej (grubość warstwy
procentach, została przepuszczona przez r-r. roztworu)
T = It∕Io c – stężenie analitu
 Absorbancja = gęstość optyczna = ekstynkcja – wartości określające zdolność
pochłaniania światła przez badany r-r.
A = log 1∕T = log Io∕It

9
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

PODZIAŁ METOD
SPEKTROFOTOMETRIA
ABSORPCJOMETRYCZNYC
ABSORPCYJNA
H
• podział metod absorpcjometrycznych:
 metody spektroskopowe - oddziaływanie promieniowania
-w nadfiolecie (UV) Brak większych
elektromagnetycznego z materią
różnic teoretycznych
-w świetle widzialnym (VIS) i aparaturowych  najstarsza technika instrumentalna
 wraz z metodami chromatogaficznymi – najczęściej
-w podczerwieni (IR) wykorzystywana
 znalazły zastosowanie w oznaczaniu większości składników
-w dalekiej podczerwieni (FIR) żywności, przede wszystkim jako techniki spektrofotometryczne,
-Ramana (LRS) wykorzystujące światło widzialne, nadfioletowe i podczerwone

APARATURA POMIAROWA - SCHEMAT

SPEKTROFOTOMETR PRZEPROWADZANIA
POMIARÓW
• nastawienie aparatu na wymaganą długość fali
• przepuszczenie wiązki światła monochromatycznego przez
kuwetę zawierającą roztwór porównawczy bądź próbę ślepą
• przełączenie na absorbcję równą zero (wyzerowanie aparatu)
Budowa spektrofotometru UV-Vis: • odczyt absorbcji roztworu badanego w identycznej kuwecie
-źródło promieniowania –lampy spektralne, lasery, lampy żarowe
-monochromator – (siatka dyfrakcyjna, pryzmat, kolimator) • odczyt stężenia z krzywej wzorcowej (zależność absorbancji w
-komory pomiarowe – kuwety kwarcowe, szklane, zbudowane z kryształów NaCl, KBr, CsBr,
polietylen (15-300 µm) funkcji stężenia)
-detektory – zamiana energii docierającego do nich promieniowania elektromagnetycznego na
sygnał elektryczny (fotokomórki, fotopowielacze, fotodiody – najczęściej krzemowe)
Spektrofotometry IR:
- włókno Nersta
- sztucznie wyhodowane kryształy jonowe np. NaCl

KRZYWA ZALEŻNOŚCI
SPEKTROFOTOMETRY -
WARTOŚCI ABSORBANCJI
PRZYKŁADY
OD STĘŻENIA
Krzywe kalibracyjne

10
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

BARWA A STRUKTURA
SPEKTROFOTOMETRIA W
CZĄSTECZKI
ZAKRESIE ŚWIATŁA  barwa ciała świadczy o tym, że pochłania ono promieniowanie z zakresu
widzialnego w sposób selektywny
 zabarwienie obserwowane jest dopełnieniem barwy promieniowania
WIDZIALNEGO absorbowanego
 substancje bezbarwne - reakcja chemiczna – BARWNA POCHODNA
 ODCZYNNIK BARWIĄCY:
 reaguje tylko z badaną substancją
• technika pomiarowa, której zadaniem jest ilościowy opis barwy  nie wchodzi w reakcję z żadną inną substancją obecną w roztworze.
poprzez pomiar zespołu parametrów wyznaczających ją  POWSTAŁA BARWA POWINNA BYĆ:
 trwała,
jednoznacznie w przyjętym umownie układzie barw.  niewrażliwa na światło,
 niepodatna na zmiany pH,
 aparaty do pomiaru barwy:  niezależna od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika barwiącego.
-spektrokolorymetr (pryzmat, siatka dyfrakcyjna)
-kolorymetry (filtry świetlne)

STRUKTURA A BARWA
CZĄSTECZKI
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA ABSORPCJĘ PROMIENIOWANIA W
ZAKRESIE WIDZIALNYM I NADFIOLECIE:
 liczba i rozmieszczenie elektronów w cząsteczce lub jonie;
substancje nieorganiczne – absorpcja - nie zapełniona powłoka elektronowa
jest ekranowana inną trwałą powłoką, utworzoną najczęściej przez wiązania
koordynacyjne z innymi atomami;
zabarwienie wykazuje większość związków metali przejściowych.
związki organiczne: niedobór elektronów i deformacja struktury elektronowej
cząsteczki; jedno podwójne wiązanie - absorpcja w dalekim nadfiolecie.
im więcej wiązań podwójnych lub potrójnych wiązań sprzężonych posiada
cząsteczka tym bardziej maximum absorbcji przesunięte jest w kierunku fal
dłuższych.
SPEKTROFOTOMETRIA -
PRZYKŁADY
 OZNACZANIE CUKROWCÓW:
-metoda antronowa –przeprowadzenie pentoz w furfural, a
heksoz w 5 hydroksymetylofurfural, długość fali 620 nm
-metoda rezorcynowa – służy do oznaczania ketocukrów -
produkty reakcji wraz z rezorcyną tworzą barwny kompleksy;
długość fali 520 nm - ketoheksozy, a 620 nm - ketopentozy
-metoda żelazicyjankowa - aldocukry w środowisku zasadowym
redukują heksacyjanożelazian (III) do heksacyjanożelazianu (II),
który z jonami żelaza (III) tworzą błękit pruski; długość fali 690
nm.

SPEKTROFOTOMETRIA -
SPEKTROFOTOMETRIA - PRZYKŁADY
spektrofotometryczne oznaczanie obok siebie witamin A i D z
PRZYKŁADY zastosowaniem odczynnika Carr-Price’a, tworzącego z witaminami barwne
związki. Absorpcję witamin mierzy się przy długości fali, odpowiednio: 618
 OZNACZANIE BIAŁEK : nm i 500 nm
-metoda biuretowa – polega na powstaniu barwnych kompleksów w
wyniku utworzenia się wiązań koordynacyjnych między jonami Cu2+ i
atomami azotu POMIAR ABSORBANCJI – 540 nm oznaczanie zawartości alkoholu etylowego - pozwala na oznaczanie
etanolu w obecności innych związków: aldehydów, ketonów, estrów i
kwasów organicznych. Zawartość alkoholu w roztworach wodnych nie może
przekraczać 0,05%. Reakcja barwna z użyciem roztworu azotanu cerowo-
amonowego , dł. fali 475-487 nm.

oznaczanie kwasów lotnych - reakcja barwna z roztworem azotanu

lantanu, dł. fali 600 nm.
- w zakresie nadfioletu (długość fali: 260-290 nm):
aminokwasy aromatyczne

11
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

ELISA
METODY IMMUNOMETRYCZNE I
ENZYMATYCZNE
 metody immunometryczne – pozwalają na odróżnienie i oznaczenie
ilościowe białek o bardzo podobnej budowie z zastosowaniem przeciwciała
wobec danego białka.
-umożliwiają rozróżnienie białek różniących się tylko 1 resztą aminokwasową
-określenie ilości białka mniejszej niż 1 ng
przykład: ocena immunoreaktywności frakcji gliadyn

ELISA – metoda immunoenzymatyczna oznaczania białek przeciwciało antygen przeciwciała substrat dla enzymu
znakowane enzymem – barwna reakcja
-oznaczanie zawartości kwasu askorbinowego – metoda enzymatyczna z
użyciem
-oznaczanie zawaoksydazy askorbinianowejrtości glukozy i fruktozy – metoda
SPEKTROFOTOMETRYCZNY
enzymatyczna z użyciem oksydazy glukozowej i dehydrogenazy glukozo-6-
POMIAR
fosforanowej
NATĘŻENIA BARWY

FLUORYMETRIA – FLUORYMETRIA – PODSTAWY

PODSTAWY TEORETYCZNE TEORETYCZNE C.D.
• podczas pochłaniania kwantu światła następuje przejście elektronu  widma fluorescencyjne - substancja absorbująca w
ze stanu podstawowego w stan wzbudzony
• elektron w stanie wzbudzonym przebywa krótko, po czym powraca
nadfiolecie lub krótkofalowej części widma
do stanu podstawowego widzialnego.
• emisja bezpromienista, lub emisja promieniowania (fluorescencja  związki organiczne o wiązaniach podwójnych,
lub fosforescencja). potrójnych, sprzężonych itp.
• fluorescencja zanika  czynniki wpływające na natężenie fluorescencji:
natychmiast po - temperatura,
przerwaniu wzbudzenia, - pH,
fosforescencja trwa zaś - rodzaj rozpuszczalnika,
jeszcze przez pewien czas. - dodatek obcego składnika

APARATURA
 aparaty służące do pomiarów fluorymetrycznych:
1. wizualne – absorpcjometr Pulfricha z przystawką do badań
fluorymetrycznych
2. fotoelektryczne – wyposażone w źródło światła nadfioletowego
i dwa filtry:
- korygujący promieniowanie wzbudzające
- korygujący promieniowanie emitowane
3. spektrofluorymetry – odpowiedniki spektrofotometrów, służące
do precyzyjnych pomiarów fluorymetrycznych.
FLUORYMETRIA -
PRZYKŁADY
 oznaczanie uwolnionej, wyekstrahowanej i oczyszczonej tiaminy metodami
fluorescencyjnymi po utlenieniu jej do tiochromu ( w UV niebieska fluorescencja przy
długości fali 365 nm)
 oznaczanie ryboflawiny (żółtozielona fluorescencja przy pH = 7 i długości fali 430-450 nm)
 metoda lumiflawinowa oznaczania ryboflawiny: przeprowadzenie nierozpuszczalnej w
chloroformie ryboflawiny w rozpuszczalną lumiflawinę i pomiar niebieskiej fluorescencji
 oznaczenie kwasu L-askorbinowego: utlenienie do L-dehydroaskorbinowego i
przyprowadzenie reakcji z o-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący
kompleks.
 zastosowanie fluorescencji do analizy olejów roślinnych:
-tokochromanole (tokotrienole, tokoferole)
-barwniki chlorofilowe
-związki fenolowe
 zastosowanie fluorescencji w metodach aktywności przeciwutleniającej (ORAC, TRAP)

12
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

ASA – ATOMOWA
SPEKTROMETRIA ASA – PODSTAWY
ABSORPCYJNA - TEORETYCZNE
PODSTAWY TEORETYCZNE
 w metodzie absorpcji atomowej mierzy się ilość światła  stan podstawowy – stan atomu charakteryzujący się najmniejszą energią dla
podstawowej konfiguracji elektronów
zaabsorbowanego przy danej długości fali w czasie przejścia  stan wzbudzony – dostarczenie do atomu odpowiedniej, charakterystycznej dla
przez chmurę atomów niego energii powoduje przeniesienie elektronu walencyjnego do poziomu o
 na podstawie pomiarów ilości zaabsorbowanego wyższej energii
promieniowania, można prowadzić ilościowe oznaczanie w  spektrometria - oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z
próbce analitu zakresu bliskiego nadfioletu i światła widzialnego (190 – 700 nm) z materią;
 materią tą są atomy (nie cząsteczki i nie jony) – stąd atomowa;
 odpowiednie źródło światła oraz prawidłowa długości fali  a ze względu na to, że sygnałem analitycznym jest osłabienie mierzonego
pozwalają na selektywne oznaczanie zawartości danego natężenia promieniowania na skutek absorpcji – absorpcyjna.
pierwiastka w obecności innych atomów

APARATURA
METODY WPROWADZANIA
Podstawowy spektrometr absorpcji atomowej składa się z trzech
niezbędnych elementów: PRÓBEK
 absorpcja atomowa z atomizacją w płomieniu

* źródło
promieniowania atomizer układ pomiarowy

•źródło promieniowania: lampy z katodą wnękową. Są to lampy

pozwalające na emisję widma atomowego wybranego atomu. Dla niektórych
pierwiastków nie można stworzyć lampy HCL, wtedy stosuje się bezelektrodową lampę
wyładowczą EDL.
•atomizer: element służący do otrzymywania wolnych atomów oznaczanego
pierwiastka: płomień, piec grafitowy, technika generowania wodorków i zimnych par,  oznaczenia na poziomie mg/l można prowadzić dla większości znanych
technika ICP. pierwiastków
układ pomiarowy: monochromator, fotopowielacz.

METODY WPROWADZANIA METODY WPROWADZANIA

PRÓBEK PRÓBEK
• oznaczanie rtęci metodą zimnych par  technika generowania wodorków
atomy Hg mogą występować w stanie podstawowym w przypomina w dużym stopniu technikę generowania zimnych
temperaturze pokojowej par rtęci
reduktorem stosowanym do redukcji próbek jest NaBH4
rtęć obecna w próbce jest redukowana do stanu produktem reakcji reakcji są lotne w temperaturze pokojowej
podstawowego za pomocą silnych reduktorów: SnCl2, NaBH4 wodorki
reakcja zachodzi w naczyniu zamkniętym wolne atomy analitu uzyskuje się w wyniku dysocjacji
lotne atomy rtęci są wymywane strumieniem gazu do wodorków w wysokiej temperaturze
komory pomiarowej  pierwiastki tworzące wodorki:
As, Bi, Ge, Pb, Sb, Se, Sn, Te

13
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

METODY WPROWADZANIA
PRÓBEK METODY WPROWADZANIA
PRÓBEK

• atomizacja w piecu grafitowym:

• atomizacja w piecu grafitowym oznaczanie na poziomie ng/l
duża czułość oznaczeń;
wysoka automatyzacja oznaczeń;
Kuweta grafitowa
szerokie zastosowanie - możliwość oznaczenia większości
pierwiastków w różnego rodzaju próbach;

PŁOMIENIOWA EMISYJNA ELEKTROFOREZA

SPEKTROMETRIA ATOMOWA • KAPILARNA
ELEKTROFOREZA zjawisko migracji cząstek obdarzonych
płomieniu palnika atomy (FAES)
• wykorzystuje się zjawisko emisji linii widmowych przez wzbudzone w ładunkiem w polu elektrycznym w kierunku elektrody o
przeciwnym znaku.
• zalety:
• rozdział analitów - wewnątrz kwarcowej kapilary o
- krótki czas analiz;
średnicy kilku µm, wypełnionej elektrolitem o
- łatwy, bezpośredni pomiar; określonym pH, gdzie pod wpływem przyłożonego
- stosunkowo niski koszt aparatury. napięcia anality poruszają się z różną prędkością.
• wady: • TEMPO WĘDRÓWKI SUBSTANCJI ZALEŻY OD:
- ograniczone zastosowanie – nadaje się tylko do analizy pierwiastków o niskim
potencjale wzbudzenia (gł. litowców, berylowców);
• - ładunku elektrycznego;
- metoda oznaczania pojedynczych pierwiastków; • - masy;
- odchylenie od prostoliniowej zależności. • - kształtu cząsteczki

ELEKTROFOREZA KAPILARNA SCHEMAT PRZYRZĄDU DO

SCHEMAT ELEKTROFOREZY
PRZEPROWADZANIA ANALIZY KAPILARNEJ
• próbkę badaną wprowadza się do końca kapilary po stronie anody
(hydrodynamiczna – grawitacyjna, hydrodynamiczna-ciśnieniowa,
elektrokinetyczna)

• przy katodowym końcu znajduje się detektor (spektrofotometria,

konduktometria, potencjometria)

14
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

MICELARNA
DETEKTORY STOSOWANE CHROMATOGRAFIA
W ELEKTROFOREZIE ELEKTROKINETYCZNA
 micelarna chromatografia elektrokinetyczna (ang. Micellar
Electrokinetic Chromatography, MEKC) - rozdział składników
mieszanin, których cząsteczki są obdarzone ładunkiem, jak również
elektrycznie obojętnych.
 micele tworzą się po osiągnięciu krytycznego stężenia micelarnego
 Fluorymetryczne, (CMC)
 Spektrofotometryczne,  podział analizowanych składników między micele: (środowisko
 Elektrochemiczne, hydrofobowe) i bufor (środowisko hydrofilowe)
 wykorzystując tę technikę można rozdzielić np.: węglowodany,
 Spektrometria masowa witaminy, aminokwasy, peptydy, oligonukleotydy
 Laserowe
 Ultrafioletowe

PRAKTYCZNE
INNE TECHNIKI
WYKORZYSTANIE METOD
ELEKTROFORETYCZNE
ELEKTROFORETYCZNYCH
 oznaczanie zawartości zarówno związków wielkocząsteczkowych, np. białek czy
 żelowa elektroforeza kapilarna: rozdział substancji wielkocząsteczkowych
fragmentów DNA, jak i drobnocząsteczkowych: aminokwasów, węglowodanów,
następuje w wyniku różnicy ich wielkości. Proces ten przebiega w kapilarze
witamin, flawonoidów, jonów nieorganicznych oraz kwasów organicznych.
wypełnionej żelem o odpowiedniej średnicy porów (kwasy nukleinowe,
 oznaczanie frakcji białkowych mleka krowiego, koziego, owczego, a także białek w
oligonukleotydy, peptydy, białka).
jajach kurzych i w zbożach
 oznaczanie aminokwasów w napojach
 kapilarne ogniskowanie izoelektryczne: składniki mieszaniny rozdzielane są
 oznaczanie zawartości cukrów prostych i oligocukrów w owocach, warzywach,
na podstawie różnicy wartości punktów izoelektrycznych (pI). W kapilarze
napojach, sokach owocowych
generowany jest gradient pH (od najniższego do najwyższego). Związki
 oznaczanie zawartości witamin rozpuszczalnych w wodzie i w tłuszczach
poruszają się aż do momentu dotarcia do pH równemu pI. Rozdziałowi tą
 oznaczanie polifenoli
metodą poddaje się głównie substancje o właściwościach amfoterycznych.
 oznaczanie zawartości poszczególnych jonów
 oznaczanie zawartości kwasów organicznych w produktach spożywczych
 oznaczanie kwasów nukleinowych, dzięki czemu istnieje możliwość sprawdzenia czy
produkt był genetycznie modyfikowany

SPEKTROMETRIA MAS SPEKTROMETRIA MAS

• spektrometria mas jest techniką analityczną, która służy

zarówno do badania lub potwierdzenia struktury • PODSTAWĄ POMIARU W SPEKTROMETRII MAS JEST STOSUNEK MASY DO ŁADUNKU
związków organicznych jak i oznaczania jakościowego ELEKTRYCZNEGO ANALIZOWANEGO JONU
oraz ilościowego określonych związków występujących w UMOŻLIWIA:
mieszaninie. • określanie masy atomowej związku chemicznego

• w spektrometrii mas cząsteczki badanej substancji są • analizę jakościową i ilościową

jonizowane a analizie podlegają powstałe jony. • precyzyjne określenie struktury związku
• analizę składu izotopowego

15
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
 2014-12-10

BUDOWA I ZASADA DZIAŁANIA

INNE METODY ANALITYCZNE
SPEKTROMETRU MASOWEGO • NEFELOMETRIA – pomiar natężenia światła
rozproszonego przez cząsteczki w kierunku
prostopadłym do kierunku padania
• TURBIDYMETRIA – pomiar natężenia światła
przechodzącego przez roztwór wykazujący zmętnienie
• REFRAKTOMETRIA – metoda analityczna opierająca
się na pomiarze współczynników załamania światła
• POLARYMETRIA – metoda analityczna opierająca się
na pomiarze kąta skręcania światła
spolaryzowanego

INNE METODY ANALITYCZNE

• enzymatyczno-wagowa metoda oznaczania błonnika

- hydroliza enzymatyczna i wagowe oznaczanie błonnika
nierozpuszczalnego
- błonnik rozpuszczalny jest wytrącany za pomocą 96% etanolu i
także oznaczany wagowo
• mikrobiologiczne metody oznaczania witamin
(witaminy z grupy B)
- metody detekcji: turbidymetria, nefelometria, pomiar produktów
metabolizmu wytworzonych organizmy testowe

16
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)