Ćwiczenie 4.

Oznaczanie aktywności Gamma-glutamylotransferazy

(g-GT; g-GTP; GGTP) (zestawem firmy BioSystem)

Enzym γ-Glutamylotranspeptydaza; gamma-glutamylotranspeptydaza;

γ-glutamylotransferaza; gamma-glutamylotransferaza – enzym
katalizujący przemiany związane z transferem reszty glutaminianowej.

Znaczenie diagnostyczne:
 Najwyższe stężenie GGTP występuje w wątrobie, kanalikach
nerkowych i jelitach.
 Podwyższone GGTP najczęściej związane jest z chorobami
wątroby, a oznaczanie jego stężenia wchodzi w skład tzw. prób
wątrobowych. Stężenie GGTP powyżej normy może wskazywać na
cholestazę – zespół objawów związany z mechanicznym
zatrzymaniem odpływania żółci. Wysokie stężenie GGTP wiąże się
także z alkoholowym uszkodzeniem wątroby, niealkoholowym
stłuszczeniem wątroby czy uszkodzeniem komórek wątroby
o nieznanej przyczynie. Przekroczenie normy GGTP pojawia się
również w chorobach nowotworowych wątroby, a także
w wirusowym zapaleniu wątroby.
 Wysokie stężenie GGTP może wystąpić ponadto w 3–4 dobie
po zawale serca, w ostrym i przewlekłym zapaleniu trzustki, oraz
niektórych nowotworach złośliwych trzustki.
 Na wzrost stężenia gamma-glutamylotransferazy może mieć wpływ
zażywanie niektórych leków, czy palenie papierosów.
Reakcja ( zasada metody):
Gamma-glutamylotransferaza katalizuje przeniesienie grupy
glutamylowej z g-glutamylo-3-karboksy-4-nitroanilidu na glicyloglicynę.
Uwalnia się przy tym 3-karboksy-4-nitroanilina. Stężenie katalityczne
GGTP oznacza się na podstawie szybkości wzrostu stężenia 3-karboksy-
4-nitroaniliny.

g-GTP

g-glutamylo-3-karboksy-4-nitroanilidu + glicyloglicyna
g-glutamylo- glicyloglicyna + 3-karboksy-4-nitroanilina

Materiał do badań:
Surowica lub osocze pobrane standardowymi procedurami
na antykoagulant (EDTA lub heparyna).
GGTP w pobranym materiale biologicznym jest stabilna przez 5 dni
w temp. 2-8 st.C.

WYKONANIE OZNACZENIA:
Do odpowiednich probówek odpipetować:
objętość
Mieszanina reakcyjna 1000μl
MATERIAŁ BADANY 100μl

1. Wymieszać i włożyć kuwetę do spektrofotometru.

2. Zapisać absorbancję początkową i wykonać 3 kolejne pomiary
w odstępach jednominutowych.
3. Obliczyć różnicę między pomiarami absorbancji oraz średnią
absorbancję na minutę (DA/min).
 OBLICZENIA:
t0. t 60 t120 t180 Δ(t180-t120) Δ(t120-t60) Δ(t60-t0)
Abs.

Średnia Abs./min.= (DA1+DA2+DA3)/3

Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę ΔA/min.

Aktywność GGTP [U/l] = ΔA/min. x F

F (λ= 405nm) = 1111
F (λ= 410nm) = 1391

Wyniki:
Ćwiczenie 5. Oznaczanie kreatyniny w surowicy krwi i moczu
(zestawem firmy BioSystem)

Kreatynina jest produktem nieenzymatycznej dehydratacji kreatyny

zachodzącej w mięśniach. Jej stężenie wzrasta w stanach rozległego
uszkodzenia mięśni. Stężenie kreatyniny we krwi i w moczu zależy
od wydajności filtracji kłębuszkowej w nerkach, jest więc wskaźnikiem
funkcji nerek.

Kreatynina jest bezwodnikiem kreatyny.

Powstaje w mięśniach szkieletowych na drodze nieodwracalnej
defosforylacji fosfokreatyny lub dehydratacji kreatyny. Nie ulega resorpcji
zwrotnej w kanalikach nerkowych.

Zasada metody
Reakcja Jaffego – metoda kolorymetrycznego oznaczania kreatyniny
w płynach ustrojowych, wykorzystywana w laboratoriach klinicznych.
W wyniku reakcji pikrynianów z kreatyniną w środowisku alkalicznym
powstaje pochodna 2,4,6-trinitrofenolem o zabarwieniu żółtoczerwonym.
Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do stężenia
kreatyniny.
Materiał do badań:
Surowica, osocze lub mocz pobrane standardowymi procedurami
na antykoagulant (EDTA lub heparyna).
Kreatynina w pobranym materiale biologicznym jest stabilna przez 24h
w temp. 2-8 st.C.

Wykonanie oznaczenia:
Surowicę dokładnie wymieszać i odpipetować do odpowiednio
oznakowanych probówek.
Moczu dokładnie wymieszać. Następnie mocz należy rozcieńczyć
50-krotnie dodając odpowiednią objętość H2O destylowanej.

Próba badana (PB) Próba wzorcowa (PW)

1-CREATININE (miesz. 1000 μl 1000 μl
reakcyjna)
Standard - 100 μl
Materiał badany-surowica 100 μl -
Materiał badany-mocz rozc. 100 μl -

Wymieszać i dokładnie po 30 sekundach od dodania próbki (surowicę,

mocz lub standard) odczytać absorbancję (A1) próby badanej
i wzorcowej wobec powietrza przy długości fali λ= 500nm. Odczyt
powtórzyć dokładnie po 90 sekundach (czyli 60 sekund po dokonaniu
pierwszego odczytu) (A2) i obliczyć ΔA (A2-A1) dla wszystkich prób.
Obliczyć stężenie kreatyniny ze wzoru:

stężenie kreatyniny = ΔA (PB) / ΔA (PW) x stężenie wzorca

OBLICZENIA:
t30. t 90 Δ(t90-t30)
Abs.

Uwaga! Odczynnik 1-CREATININE zawiera wodorotlenek sodu - produkt

drażniący!

Wyniki:
a) klirens kreatyniny endogennej

U mg/dl x V ml/min
C kreatyniny ml/min = --------------------------
P mg/dl
C kreatyniny – współczynnik oczyszczania
U – stężenie kreatyniny w moczu
P – stężenie kreatyniny w surowicy
V – diureza minutowa

Klirens (współczynnik oczyszczania; z ang. clearence) danej substancji

jest miarą objętości osocza (ml) oczyszczonego z tej substancji w ciągu
1 minuty takich, jak:
 łatwo ulega przefiltrowaniu w kłębuszkach nerkowych
 nie podlega wchłanianiu zwrotnemu w cewkach nerkowych
 nie jest czynna farmakologicznie

Wyniki:
Ćwiczenie 5. Oznaczanie kinazy kreatynowej w surowicy krwi
(zestawem firmy BioSystem)

Kinaza keratynowa (CK) odgrywa ważną rolę w komórkach mięśniowych

dostarczając im energii w postaci ATP.
CK obecne w surowicy krwi pochodzi głównie z mięśni, a jej stężenie
zależy m.in. od kilku czynników fizjologicznych: płci, wieku, masy
mięśniowej czy aktywności fizycznej.
Podwyższone stężenie CK występuje u pacjentów z niektórymi
chorobami mięśni szkieletowych tj. dystrofia mięśniowa, zapalenie
mięśni, hipertermia złośliwa; chorobami centralnego układu nerwowego
i chorobami tarczycy.
Po zawale mięśnia sercowego stężenie CK zaczyna wzrastać po 3-6
godzinach aby osiągnąć wartość kulminacyjną po 24-36 godzinach.
Stężenie wraca do normy po 3-4 dniach od zdarzenia.

ZASADA METODY (reakcja):

Kinaza keratynowa (CK) katalizuje fosforyację ADP w obecności
fosforanu kreatyny do ATP. Stężenie katalityczne oznacza się na
podstawie szybkości wytwarzania NADPH+
CK
fosforan kreatyny + ADP kreatyna + ATP
HK
ATP+ glukoza kreatyna + ATP

G6P-DH
glukozo-6-fosforan + NADP+ 6-fosfoglukonian+ NADPH+ + H+

G6P-DH - dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

HK – heksokinaza
CK – kinaza keratynowa

Materiał do badań:
Surowica lub osocze pobrane standardowymi procedurami
na antykoagulant (EDTA lub heparyna).
CK w pobranym materiale biologicznym jest stabilna przez 7 dni
w temp. 2-8 st.C.

WYKONANIE OZNACZENIA:
Do odpowiednich probówek odpipetować:
objętość
Mieszanina reakcyjna 1000μl
MATERIAŁ BADANY 50μl

4. Wymieszać i włożyć kuwetę do spektrofotometru.

5. Po 3 minutach zapisać absorbancję początkową i wykonać 3
kolejne pomiary w odstępach jednominutowych.
6. Obliczyć różnicę między pomiarami absorbancji oraz średnią
absorbancję na minutę (DA/min).

OBLICZENIA:
t0. t 60 t120 t180 Δ(t180-t120) Δ(t120-t60) Δ(t60-t0)
Abs.

Średnia Abs./min.= (DA1+DA2+DA3)/3

Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę ΔA/min.

Aktywność CK [U/l] = ΔA/min. x F

F (λ= 340nm) = 3333
Ćwiczenie 5. Oznaczanie mocznika w surowicy krwi i moczu
(zestawem firmy BioSystem)

Mocznik powstaje w wątrobie jako produkt deaminacji kwasów

nukleinowych (RNA i DNA).
Wzrost stężenia mocznika pochodzenia:
 przednerkowego spowodowany jest zawałem czy niewydolnością
serca,
 nerkowego - dieta wysokobiałkowa i odwodnienie,
 zanerkowego - może być spowodowana rakiem bądź przerostem
prostaty

ZASADA METODY (reakcja):

Stężenie katalityczne mocznika oznacza się na podstawie zmian
stężenia NADH+
ureaza
mocznik + H2O NH4+ + CO2

DH glutaminianowa

NH4+ + NADH+ + H++ 2-oxyglutaran glutaminian+ NAD + + H+

DH - dehydrogenaza

Materiał do badań:
Surowica, osocze lub mocz pobrane standardowymi procedurami
na antykoagulant (heparyna jest rekomendowana).
Mocznik w surowicy i osoczu jest stabilny przez 7 dni w temp. 2-8 st.C.
W moczu jest stabilny przez 2 dni w temp. pokojowej.
WYKONANIE OZNACZENIA:
Surowicę dokładnie wymieszać i odpipetować do odpowiednio
oznakowanych probówek.
Moczu dokładnie wymieszać. Następnie mocz należy rozcieńczyć
50-krotnie dodając odpowiednią objętość H2O destylowanej.

Próba badana (PB) Próba wzorcowa (PW)

Mieszanina reakcyjna 1500 μl 1500 μl
Standard - 10 μl
Materiał badany-surowica 10 μl -
Materiał badany-mocz rozc. 10 μl -

Wymieszać i dokładnie po 30 sekundach od dodania próbki (surowica,

mocz lub standard) odczytać absorbancję (A1) próby badanej
i wzorcowej wobec powietrza przy długości fali λ= 340nm. Odczyt
powtórzyć dokładnie po 90 sekundach (czyli 60 sekund po dokonaniu
pierwszego odczytu) (A2) i obliczyć ΔA (A2-A1) dla wszystkich prób.
Obliczyć stężenie mocznika ze wzoru:

stężenie mocznika = ΔA (PB) / ΔA (PW) x stężenie wzorca

OBLICZENIA:
t30. t 90 Δ(t90-t30)
Abs.
1. Jednostka aktywności enzymatycznej

Stężenie enzymu przedstawia się jako stężenie aktywności enzymu w

płynie biologicznym, bądź jako liczbę jednostek przypadającą na litr
homogennego roztworu enzymu (U/l, mol/l).
Wyróżniamy następujące rodzaje aktywności enzymatycznej:
 Absolutna – ilość enzymu potrzebna do przekształcenia 1mola
substratu w ciągu 1 minuty w temperaturze 30 ˚C w optymalnych
warunkach reakcji (U).
 Właściwa –ilość jednostek aktywności enzymatycznej absolutnej
na mg białka w badanej próbce - U/mg.
 Molekularna – liczba cząsteczek substratu przekształcona przez
1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty.

2. Oznaczanie aktywności enzymatycznej

Aktywność enzymatyczną można oznaczać w płynach ustrojowych -

wówczas jest ona przeliczana na objętość (ml, l), w homogenatach
tkankowych (homogenat wątroby), czy skrawkach tkanek - podajemy
wówczas jej wartość w przeliczeniu na jednostkę masy (mg, g, kg).
Przykłady:
 w surowicy lub osoczu krwi – U/ml
 w tkankach :
- skrawki
- homogenat: U/mg białka lub U/mg DNA
a) całkowity
b) frakcje
 w moczu – U/mg kreatyniny
3. Inhibicja enzymów
Inhibitory zmniejszają szybkość reakcji enzymatycznych. Jest to jeden ze
sposobów regulacji procesów w żywej komórce. Inhibitorami enzymów
są między innnymi antybiotyki, narkotyki, toksyny i trucizny.

Rodzaje inhibicji:odwracalna
a) kompetycyjna - współzawodnictwo inhibitora o wiązanie z
miejscem aktywnym enzymu,
b) niekompetycyjna - wiązanie z miejscem innym niż centrum
aktywne enzymu powodujące zmniejszenie szybkości reakcji,
poprzez zmianę konformacji enzymu (zmiana struktury
przestrzennej),
 nieodwracalna - trwałe wiązanie inhibitora w centrum aktywnym
enzymu.
4. Regulacja aktywności enzymatycznej

Regulacja reakcji enzymatycznych może przebiegać poprzez:sprzężenie

zwrotne
a) aktywację proteolityczną proenzymów
Ad. a) A B C X Ad. b) trypsynogen
peptydaza

E1 E2 E3 trypsyna
chymotrypsynogen proelastaza

Hamowanie przez produkt X

chymotrypsyna elastaza
5. Kinetyka reakcji enzymatycznych

k1 k3
E+S ES E+P
k2
E – enzym, S – substrat, ES - kompleks enzym-substrat, P - produkt
k – stałe szybkości reakcji
Km = k2+ k3/k1, czyli Km=[E][S]/[ES]

Ćwiczenie 3. Oznaczanie aktywności aminotransferazy alaninowej

zestawem firmy BioSystem

Aminotransferaza alaninowa (ALT – z jęz. ang. Allanin Transferase)

uczestniczy w metabolizmie aminokwasów. Enzym ten występuje we
wszystkich tkankach, ale najwyższe jego stężenie stwierdza się
w komórkach wątroby i nerek. Uszkodzenie hepatocytów lub komórek
nerek prowadzi do uwolnienia do krwioobiegu znacznych jego ilości.
Oznaczanie aktywności ALT w surowicy stosuje się w diagnostyce
chorób wątroby.

ZASADA METODY:
ALT
L-alanina + 2-oksoglutaran pirogronian + L-glutaminian

LDH
Pirogronian + NADH + H+ mleczan + NAD +

LDH - dehydrogenaza mleczanowa

Szybkość zmian absorbancji mierzonej przy λ= 340nm jest wprost

proporcjonalna do aktywności aminotransferazy alaninowej.
Do probówki odpipetować:
1-ALAT 1000 μl
materiał badany 100 μl

Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. pok. lub 37 °C,

a następnie przeprowadzić pomiary:
Odczytać absorbancję próby badanej wobec wody w czasie t 0.
Powtórzyć pomiar po upływie 60 (t 60) i 120 sekund (t120)

t0. t 60 t120 Δ(t120 - t 60) Δ(t 60- t0)

Abs.

Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę ΔA/min.

Aktywność ALT [U/l] = ΔA/min. x F
F (λ= 340nm) = 1746
Wyniki:

Ćwiczenie 4. Oznaczanie aktywności aminotransferazy

asparaginianowej zestawem firmy BioSystem
Aminotransferaza asparaginianowa (AST- z jęz. ang. Asparaginian
Transferase) uczestniczy w metabolizmie aminokwasów. AST występuje
we wszystkich tkankach, ale szczególnie wysokie stężenie tego enzymu
stwierdza się w komórkach mięśnia sercowego, mięśni szkieletowych,
wątroby i nerek. Podwyższona aktywność AST jest markerem zawału
serca oraz uszkodzeń wątroby. Występuje także w chorobach
związanych z martwicą tj. mononukleoza zakaźna, cholestaza, marskość
metastatyczna, czy zażywanie niektórych leków np. przeciwwirusowych.

Zasada metody:
 AST

L-asparaginian + 2-oksoglutaran szczawiooctan + L-

glutaminian
MDH

Szczawiooctan + NADH + H+ jabłczan + NAD+

MDH – dehydrogenaza jabłczanowa

Szybkość zmian absorbancji mierzonej przy λ= 340nm jest wprost

proporcjonalna do aktywności aminotransferazy asparaginianowej.

Wykonanie oznaczenia:
Do probówki odpipetować:

1-ASAT 1000 μl
materiał badany 100 μl

Dokładnie wymieszać, inkubować 5 min. w temp. pok. lub 37 °.C, a

następnie przeprowadzić pomiary:
DOdczytać absorbancję próby badanej wobec wody w czasie t0.
Powtórzyć pomiar po upływie 60 (t 60) i 120 sekund (t120)

t0. t 60 t120 Δ(t120 - t 60) Δ(t 60- t0)

Abs.

Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę ΔA/min.

Aktywność AST [U/l] = ΔA/min. x F

F (λ= 340nm) = 1746

Wynik: