Лабораторна робота №4

«Взаємодія ДНК з лігандами»

Завдання 1
1. Запишіть вираз для константи асоціації та поясніть його.
[𝑅𝑅𝑅𝑅]
𝐾𝐾𝑎𝑎 = ,
[𝑅𝑅][𝐿𝐿]
де [𝑅𝑅𝑅𝑅] – концентрація комплексу рецептор-ліганд, [𝑅𝑅] – концентрація вільного
рецептора, [𝐿𝐿] – концентрація вільного ліганду.
Константа асоціації характеризує міцність зв’язку макромолекула-ліганд.
2. Що таке n?
n – кількість центрів зв’язування макромолекули з барвником.
3. Що означає запис P/n для ДНК?
𝑃𝑃
– загальне число центрів зв’язування ліганду з ДНК.
𝑛𝑛
4. Як, згідно літературних даних, змінюються спектри поглинання АО при
зростанні концентрації ДНК? З чим це пов’язано?
При збільшенні концентрації ДНК, тобто [𝑃𝑃]/[𝐷𝐷] > 1 (рис. 1 В) спектри
змінюються наступним чином:
1. Збільшується загальне поглинання;
2. Пік мономерів зростає та зсувається з 490 нм до 502 нм;
3. Пік димерів значно слабший за пік мономерів.

Рис. 1
5. Як, згідно літературних даних, змінюються відношення інтенсивності
поглинання піку мономерів до піку димерів? Як пояснюється така
поведінка?
 Рис. 2
На рис. 2 (А) позначено відношення піку димерів до піку мономерів при
[𝑃𝑃]/[𝐷𝐷] < 1, а при [𝑃𝑃]/[𝐷𝐷] > 1 на рис. 2 (В) наведено відношення, навпаки, піку
мономерів до піку димерів. Зростання співвідношення A468/A491 при [𝑃𝑃]/[𝐷𝐷] < 1
явно вказує на те, що ДНК сприяє димеризації барвника. Димери АО зв’язуються
на поверхні ДНК вздовж негативно заряджених фосфатних груп, що
стабілізують комплекс димер АО – ДНК за рахунок електростатичної взаємодії.
При більш високих співвідношеннях 𝑃𝑃/𝐷𝐷 (> 1), через більш високу доступність
ДНК, мономерні молекули барвника переважно інтеркалюють між парами основ
ДНК (𝜋𝜋 − 𝜋𝜋 взаємодія), що призводить до зростання значення A502/A468. Слід
зазначити, що мономери АО в цьому випадку теж можуть зв’язуватися з
поверхнею ДНК.
6. Скільки форм рівноваги Акридинового оранжевого є в присутності ДНК?
Як спрощено розглядають таку систему?
В присутності ДНК присутні щонайменше чотири форми рівноваги: вільні
мономери АО (1) та їх агрегати(2), а також мономери (3) та агрегати(4) зв’язані
з ДНК. Розглядаючи тільки дві форми АО в розчині: вільну та зв’язану з ДНК,
що характеризуються різними коефіцієнтами екстинкції (𝜀𝜀𝑓𝑓 та 𝜀𝜀𝑏𝑏 ), при будь-якій
фіксованій довжині хвилі можна спостерігати спад або зростання початкового
поглинання А0 при зростанні концентрації ДНК.
7. Стисло розкажіть як знаходять константу асоціації та стехіометрію
зв’язування, якщо є дані прямого та зворотного титрування?
𝐵𝐵 𝐵𝐵
𝐾𝐾𝑎𝑎 = = ,
𝑃𝑃 𝑃𝑃
𝐹𝐹 � − 𝐵𝐵� (𝑍𝑍0 − 𝐵𝐵) � − 𝐵𝐵�
𝑛𝑛 𝑛𝑛
де 𝐵𝐵 – концентрація зв’язаного з макромолекулою барвника, 𝐹𝐹 – концентрація
вільного барвника, 𝑃𝑃 – загальна концентрація ДНК (концентрація пар основ), 𝑛𝑛
– кількість центрів зв’язування, 𝑍𝑍0 – концентрація барвника.

𝐵𝐵
Графік залежності від 𝐵𝐵 називають графіком Скетчарда. Із попереднього
𝐹𝐹
рівняння маємо, що:
 𝐵𝐵 𝑃𝑃
= 𝐾𝐾𝑎𝑎 � − 𝐵𝐵�
𝐹𝐹 𝑛𝑛
Із цього рівняння слідує, що точка перетину цього графіка з віссю Х
𝑃𝑃 𝐾𝐾𝑎𝑎 𝑃𝑃
дорівнює , а точка перетину з віссю 𝑌𝑌 – . За допомогою графіків Скетчарда
𝑛𝑛 𝑛𝑛
можна визначити параметри 𝑛𝑛 і 𝐾𝐾𝑎𝑎 для найпростішого випадку, коли на одному
центрі зв’язування сорбується одна молекула ліганда.

Рис. 3
𝐵𝐵
На рис. 3 𝜈𝜈 = – відношення концентрацій зв’язаного барвника до
𝑃𝑃
1
концентрації ДНК, [𝐿𝐿] = 𝐹𝐹 – концентрація вільного барвника, 𝑘𝑘 = – константа
𝐾𝐾𝑎𝑎
1
дисоціації, для ДНК 𝑛𝑛 = .
𝑛𝑛
Завдання 2
1. Побудувати графіки (титрування). Скоригувати спектри на розведення.
Порахувати концентрації ДНК (для прямого титрування) та АО (для
зворотного) в кожній точці, а також концентрацію компонента із сталою
концентрацією (АО для прямого та ДНК для зворотного). Концентрацію
стокових розчинів АО та ДНК взяти із ЛР №3.
Рис. 4

Рис. 5
 Рис. 6
2. Побудувати графіки 𝛥𝛥𝐴𝐴([𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷]) для прямого титрування та 𝛥𝛥𝛥𝛥([𝐴𝐴𝐴𝐴])
для оберненого титрування, а також графіки 1/𝛥𝛥𝛥𝛥(1/[𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷]) та
1/𝛥𝛥𝛥𝛥(1/[𝐴𝐴𝐴𝐴]). За методом подвійних обернених координат (модель
Легмюра, подробиці див. в файлі Direct_titration_.docx) в Origin підібрати
параметри константи асоціації, числа центрів адсорбції та 𝛼𝛼.
Скоригувати спектри в присутності ДНК на мутність (в Origin відняти
BaseLine).
Рис. 7

Рис. 7
Рис. 8

Рис. 9
 Рис. 10

Рис. 11
Розрахуємо параметр 𝛼𝛼 із даних апроксимації прямого титрування:
1 1 4
1
𝛼𝛼 = = = 2.46 ⋅ 10
Δ𝑦𝑦0 𝑍𝑍0 16.761 ⋅ 2.43 ⋅ 10−6 М
Знайдемо число центрів абсорбції 𝑛𝑛 за допомогою даних апроксимації
оберненого титрування:
 𝛼𝛼𝛼𝛼 2.46 ⋅ 104 ⋅ 87.26 ⋅ 10−6
𝑛𝑛 = = = 4.28
Δ𝑦𝑦1 0.503
Обчислимо константу асоціації 𝐾𝐾𝑎𝑎 з використанням даних апроксимації
оберненого титрування:
Δ𝑦𝑦1 0.503
𝐾𝐾𝑎𝑎 = = = 0.005276 мкМ−1
𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠 95.337
𝐴𝐴490
3. Побудувати відношення від концентрації ДНК (пункт 2.1) та від
𝐴𝐴468
концентрації АО (пункт 2.3) порівняти з результатами ЛР №3.

Рис. 12
Рис. 13

Рис. 14
 𝐴𝐴490
Рис. 14 Графік залежності відношення від концентрації АО з лабораторної
𝐴𝐴468
роботи №3
4. Опанувати особливості аналізу спектрів поглинання в Origin:
• Побудувати нормалізовані графіки в першій, останній та середній точці
для кожного титрування

Рис. 15
 Рис. 16

Рис. 17
• Розкласти спектри на компоненти в першій, останній та середній точці
для кожного титрування. Знайти півширину, максимуми піків та площу
під спектром для компонент.
Рис. 18

Рис. 19
Рис. 20

Рис. 21
Рис. 22

Рис. 23
 Рис. 24
• Побудувати першу похідну від графіка в першій, останній та середній
точці для кожного титрування

Рис. 25
Рис. 26

Рис. 27
Рис. 28

Рис. 29
Рис. 30

Рис. 31
Рис. 32

Рис. 33