‫ב יוכ י מ י ה א ׳ ‪ -‬ת ש פ ״ ד‬

‫מ ע ב ד ה ב נ ו ש א ה ג ור מ י ם ה מ ש פ י ע י ם ע ל ר י א ק צ י ה א נ זי מ ט י ת ‪ -‬פ ע י ל ו ת פ ו ס פ ט א ז‬

‫רקע תיאורטי‪:‬‬
‫פעילות אנזימים מושפעת מגורמים שונים‪ ,‬כגון‪ :‬ריכוזי סובסטרטים‪ ,‬תוצרים וקו‪-‬פקטורים‪ ,‬טמפ'‪ ,pH ,‬נוכחות‬
‫מעכבים‪ ,‬דטרגנטים שונים ועוד‪ .‬כדי להכיר את תכונות קטליטיות של אנזים‪ ,‬יש למדוד במדויק את קצב‬
‫הריאקציה האנזימטית‪.‬‬

‫במעבדה זו נבדוק את השפעתם של גורמים שונים על התקדמות הריאקציה האנזימטית של אנזימים ממשפחת‬
‫הפוספטאזות‪ .‬פוספטאז הינו שם כולל לקבוצת אנזימים המזרזים הידרוליזה של מונו‪-‬אסטרים של חומצה‬
‫זרחתית‪ .‬האנזימים בהם נשתמש במעבדה זו הם פוספטאז חומצי )‪ (Acid phosphatase‬ופוספטאז בסיסי‬
‫)‪.(Alkaline phosphatase‬‬
‫הסובסטרט בו נשתמש הינו פארא‪-‬ניטרופניל‪-‬פוספט )‪ .(p-nitrophenyl, pNPP‬ה‪ pNPP -‬הינו חסר צבע‪,‬‬
‫והוא מתפרק ע"י האנזים לתוצר פארא‪-‬ניטרופנול )‪ .(p-nitrophenol, pNP‬ב‪ pH -‬נמוך גם ה‪ pNP -‬חסר‬
‫צבע‪ ,‬אולם ב‪ pH -‬גבוה הוא מתיינן ונותן יון פארא‪-‬ניטרופנולאט שצבעו צהוב )איור ‪ ,(1‬כך שניתן לעקוב אחר‬
‫היווצרותו בספקטרופוטומטר‪ ,‬באורך גל של ‪.405nm‬‬

‫איור ‪ :1‬משוואת התגובה אותה מזרז האנזים פוספטאז‪.‬‬

‫הסרת קבוצת פוספט מפארא ניטרופניל פוספט לקבל פארא ניטרופנול‬

‫על מנת לעצור את הריאקציה של הפוספטאז החומצי נוסיף ‪ NaOH‬שמעלה את ה‪ pH -‬לתחום בו מעוכב‬
‫האנזים‪.‬‬
‫על מנת לעצור את הריאקציה של הפוספטאז הבסיסי נעלה את ה‪ pH -‬מעל תחום פעילות האנזים‪ ,‬נקרר ונוסיף‬
‫‪) EDTA‬חומר קושר יוני ‪ Mg‬ו‪ Zn -‬החיוניים לפעילות הפוספטאז הבסיסי(‪.‬‬

‫‪1‬‬
 ‫הבדיקות שיבוצעו במעבדה זו‪:‬‬
‫השפעת נוכחות מעכבים על הפעילות האנזימטית של ‪) Alkaline phosphatase‬פוספטאז בסיסי(‪.‬‬ ‫✔‬
‫השפעת ה‪ pH -‬על מהירות הריאקציה האנזימטית של האנזים ‪) Acid phosphatase‬פוספטאז‬ ‫✔‬
‫חומצי(‪.‬‬

‫הערות כלליות‪:‬‬
‫יש להחזיק את המבחנות המכילות את האנזים והסובסטרט בקרח עד תחילת ההדגרה ב‪.37oc -‬‬ ‫▪‬
‫יש לרשום את זמן תחילת ההדגרה‪.‬‬ ‫▪‬
‫סיימו כל הדגרה בהעברה מיידית של הדוגמאות לקרח ולאחריה הוספת תמיסת הפסקת הריאקציה‬ ‫▪‬
‫וערבוב‪ .‬יש לשמור את הדוגמאות בקרח עד למדידת הבליעה האופטית‪.‬‬
‫למדידת הבליעה האופטית נכניס ‪ 200µl‬של כל דוגמא לתוך בארית בפלטת ‪ .96wells‬במידה‬ ‫▪‬
‫והבליעה האופטית גבוהה מ‪ 1-‬יש למהול את הדוגמאות פי ‪ 20‬בתמיסת ‪ NaOH 0.1M‬ולקרוא בשנית‪.‬‬
‫המדידות הספקטרופוטומטריות יבוצעו במכשיר ה‪ ELISA -‬באורך גל של ‪ .405nm‬מקדם הבליעה‬ ‫▪‬
‫‪-1‬‬ ‫‪-1‬‬
‫של התוצר באורך גל זה הינו ‪ 18000M *cm ,‬הדרך האופטית הינה ‪ ,0.67cm‬מכאן יש לחשב את ריכוז‬
‫התוצר דרך משוואת ‪.Beer-Lambert.‬‬

‫חומרים‪:‬‬
‫‪Acid Phosphatase 1 un/ml‬‬
‫‪Alkaline Phosphatase 1 un/ml‬‬
‫)‪p-nitrophenyl phosphate 50mM (pNPP‬‬
‫‪Na Acetate 0.4M pH 5.0‬‬
‫‪NaOH 5M‬‬
‫)‪0.4M Na Acetate (pH 3.8, pH 5.0, pH 5.6‬‬
‫)‪0.4M Tris Maleate (pH 5.6, pH 6.4, pH 7.3, pH 8.0‬‬
‫)‪0.4M Glycine-NaOH (pH 8.0, pH 10.0, pH 12.5‬‬
‫‪ZnCl2 0.1M‬‬
‫‪MgCl2 0.1M‬‬
‫‪EDTA 0.5M‬‬
‫‪Na Vanadate 10mM‬‬
‫)‪1M Glycine-NaOH (pH 10.0‬‬

‫‪2‬‬
 ‫ש אלות הכנה‬
‫צייר‪/‬י את מבנה פארא‪-‬ניטרופנול בסביבה חומצית ובסיסית‪ .‬מדוע קביעתו הקולורימטרית מחייבת‬ ‫‪.1‬‬
‫סביבה בסיסית? כיצד קובעים באיזה אורך גל יש למדוד את הופעת התוצר?‬
‫מה הריאקציה אותה מזרז האנזים פוספטאז?‬ ‫‪.2‬‬
‫בהדגרת אנזים במערכת הדגרה בסיסית נתקבלה קריאה של ‪ .0.48 O.D400‬בהתחשב בריכוז‬ ‫‪.3‬‬
‫האנזים‪ ,‬זמן ההדגרה ובערכים הנתונים להלן‪ ,‬חשב‪/‬י את קצב הקטליזה ביחידות של‪:‬‬
‫א( מיקרומול תוצר לדקה למ"ג חלבון‪.‬‬
‫ב( מול תוצר לשנייה למול אנזים )‪(Turn over number‬‬

‫נתונים‪:‬‬
‫‪ε400 = 18000 , Mw(Enzyme) = 100000‬‬
‫מערכת הדגרה בסיסית‪ :‬נפח של ‪ 1‬מ"ל הכיל )ריכוזים סופיים(‪ :‬בופר ‪ 0.04M‬ב‪ pH -‬מתאים‪ ,‬פארא‪-‬‬
‫ניטרופניל פוספט ‪ 0.005M‬ואנזים ‪ 20μg‬חלבון למ"ל‪ .‬לאחר הדגרה בטמפ' החדר ל‪ 10 -‬דקות הוספו ‪ 4‬מ"ל‬
‫‪ NaOH‬בריכוז ‪ 0.1M‬אשר הפסיקו את הריאקציה‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬נקבעה עוצמת הצבע בספקטרופוטומטר ב‪-‬‬
‫‪.400nm‬‬
‫הגדר‪/‬י את המושגים ‪ Km, Vmax‬ומהירות התחלתית )‪ .(V0‬כיצד ניתן לגזור ערכים אלו בצורה‬ ‫‪.4‬‬
‫ניסיונית?‬
‫כיצד ניתן לעקוב אחרי ריאקציה אנזימטית? כיצד עושים זאת במעבדה הנוכחית?‬ ‫‪.5‬‬
‫כיצד מושגת במעבדה הפסקת הריאקציה? האם ניתן להפסיקה עם חומצה? הסבר‪.‬‬ ‫‪.6‬‬
‫ציירו את מבנה המעכב ‪ ,Na-Vanadate‬מה ניתן ללמוד מהמבנה שלו על פעילותו?‬ ‫‪.7‬‬
‫בניסוי בו נמדדה הצטברות תוצר ריאקציה אנזימטית כפונקציה של הזמן‪ ,‬התקבלו התוצאות הבאות‪:‬‬ ‫‪.8‬‬

‫‪Product‬‬
‫]‪[mM‬‬ ‫תארו את השלבים‬
‫השונים הנראים בגרף‬
‫ותנו שלוש סיבות‬
‫אפשריות המסבירות‬
‫התנהגות זו‪.‬‬
‫)‪Time (min‬‬

‫‪3‬‬
‫קראו בעיון רב את ההוראות עבור כל חלק‪ .‬ודאו שהנכם מבינים את סדר הדברים‬
‫לפני תחילת הביצוע!!‬

‫‪ .1‬השפעת נוכחות מעכבים על הפעילות האנזימטית‬

‫רקע תיאורטי‪:‬‬
‫בניסוי זה נמדוד את מהירותה של הריאקציה האנזימטית של הפוספטאז הבסיסי עם וללא נוכחות מעכב‪ .‬המעכב‬
‫בו נשתמש בניסוי נקרא סודיום וונדאט )‪ .(Na Vanadate 10mM‬ריאקציה ללא מעכב וללא אנזים תשמש‬
‫כבלנק לניסוי זה‪.‬‬
‫על מנת לעצור את הריאקציה‪ ,‬נוסיף ‪) EDTA‬חומר קושר יוני ‪ Mg‬ו‪ Zn -‬המהווים קבוצות פרוסטטיות‬
‫החיוניות לפעילות הפוספטאז הבסיסי(‪.‬‬

‫מהלך הניסוי‪:‬‬
‫הכינו ‪ 3‬סדרות‪ ,‬כך שכל סדרה תורכב מ‪ 5-‬מבחנות אפנדורף‪ .‬סה"כ ‪ 15‬מבחנות‪ .‬לכל מבחנה יש‬ ‫‪.1‬‬
‫להוסיף ‪) premix‬אותו תקבלו מוכן‪ ,‬להלן(‪ ,‬סובסטרט‪ ,‬מים ומעכב לפי הטבלה המצורפת‪.‬‬
‫סדרה א'‪ :‬אנזים ללא מעכב‬
‫‪20mM‬‬ ‫‪10mM‬‬ ‫‪5mM‬‬ ‫‪1mM‬‬ ‫‪0.5mM‬‬ ‫ריכוז סובסטרט‬
‫‪400‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10‬‬ ‫נפח סובסטרט מהסטוק )‪(µl‬‬
‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪(µl) Premix‬‬
‫‪455‬‬ ‫‪655‬‬ ‫‪755‬‬ ‫‪835‬‬ ‫‪845‬‬ ‫נפח מים מזוקקים )‪(µl‬‬
‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫נפח סופי )**‪(µl‬‬
‫סדרה ב'‪ :‬אנזים עם מעכב‬
‫‪20mM‬‬ ‫‪10mM‬‬ ‫‪5mM‬‬ ‫‪1mM‬‬ ‫‪0.5mM‬‬ ‫ריכוז סובסטרט‬
‫‪400‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10‬‬ ‫נפח סובסטרט מהסטוק )‪(µl‬‬
‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫*)‪Premix (µl‬‬
‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫נפח מעכב מהסטוק )‪(µl‬‬
‫)ריכוז סופי ‪(µM100‬‬
‫‪445‬‬ ‫‪645‬‬ ‫‪745‬‬ ‫‪825‬‬ ‫‪835‬‬ ‫נפח מים מזוקקים )‪(µl‬‬
‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫נפח סופי )**‪(µl‬‬

‫‪4‬‬
 ‫סדרה ג'‪ :‬ללא אנזים וללא מעכב‬
‫‪20mM‬‬ ‫‪10mM‬‬ ‫‪5mM‬‬ ‫‪1mM‬‬ ‫‪0.5mM‬‬ ‫ריכוז סובסטרט‬
‫‪400‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10‬‬ ‫נפח סובסטרט מהסטוק )‪(µl‬‬
‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪120‬‬ ‫*)‪Premix (µl‬‬
‫‪455‬‬ ‫‪655‬‬ ‫‪755‬‬ ‫‪835‬‬ ‫‪845‬‬ ‫נפח מים מזוקקים )‪(µl‬‬
‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫‪975‬‬ ‫נפח סופי )‪(µl‬‬

‫‪ * Premix‬מכיל‪:‬‬
‫בופר ‪ 10.0 Glycine-NaOH pH‬בריכוז סופי של ‪100mM‬‬
‫‪ ZnCl2‬בריכוז סופי ‪1mM‬‬
‫‪ MgCl2‬בריכוז סופי ‪1mM‬‬
‫** שימו לב שלסדרות א' וב' יוספו בשלב הבא ‪ 25µl‬אנזים ולכן הנפח הסופי של התמיסה יהיה ‪.1000µl‬‬
‫התחילו את הריאקציה האנזימטית על ידי הוספת ‪ 25µl‬מתוך סטוק האנזים ‪Alkaline phosphatase‬‬ ‫‪.2‬‬
‫לסדרות א' ו‪-‬ב'‪ .‬לסדרה ג' יש להוסיף ‪) 25µl DDW‬הממס של האנזים(‪ .‬יש לשמור בקרח עד לשלב הבא‪.‬‬
‫הדגירו במשך ‪ 5‬דקות ב‪.37oC -‬‬ ‫‪.3‬‬
‫עצרו את הריאקציה על ידי העברת המבחנה לקרח והוסיפו בעזרת פיפטור ‪ 100µl‬של תמיסת עצירת‬ ‫‪.4‬‬
‫הריאקציה )אותה תקבלו מוכנה(‪.‬‬
‫*תמיסת עצירת ריאקציה מכילה‪4ml 5M NaOH + 1ml 0.5M EDTA :‬‬
‫מכיוון שהסיגנל המתקבל הוא גבוה‪ ,‬את הדוגמאות לאחר הריאקציה יש למהול פי ‪ 20‬עם ‪0.1M‬‬ ‫‪.5‬‬
‫‪ .NaOH‬יש להתחשב במיהול שבוצע כשקובעים את ריכוז התוצר ואת מהירות הריאקציה‪.‬‬
‫העבירו ‪ 200μl‬לפלטת הקריאה ושמרו בקרח עד למדידת הבליעה האופטית‪ .‬סמנו בטבלה שבעמוד‬ ‫‪.6‬‬
‫הבא היכן הוטענה כל דוגמה ואת המיהול‪.‬‬
‫*כל דוגמא יש להטעין בטריפליקטים )‪ 3‬חזרות(‪.‬‬
‫קראו את הבליעה האופטית בעזרת מכשיר ה‪ ELISA -‬באורך גל של ‪.405nm‬‬ ‫‪.7‬‬

‫‪5‬‬
 ‫דוגמא לפלטת ‪:96wells‬‬

‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪12‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫‪D‬‬
‫‪E‬‬
‫‪F‬‬
‫‪G‬‬
‫‪H‬‬

‫חישוב והצגת תוצאות‪:‬‬

‫הכינו עקומת תלות מהירות הריאקציה האנזימטית כנגד ריכוז הסובסטרט‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫הכינו עקומת ‪ V0‬נגד ]‪ 1/[S‬כאשר ‪ S‬מבוטא ביחידות‪ mM -‬ו‪ V0 -‬מבוטא ביחידות‪.µM/min -‬‬ ‫‪.2‬‬
‫מתוך העקומה חשבו את ערכי ‪ Km‬ו‪ ,Vmax-‬מכך הסיקו מהו סוג המעכב ‪.Na Vanadate‬‬

‫‪6‬‬
 ‫‪ .2‬השפעת ה‪ pH -‬על מהירות הריאקציה האנזימטית‬
‫בניסוי זה נבדוק את תחום ה‪ pH -‬האופטימלי לפעילות האנזים פוספטאז חומצי )‪ (Acid phosphatase‬בתחום‬
‫‪ pH‬רחב )‪ .(3.8-12.5‬לתחומי ה‪ pH -‬השונים נשתמש בתמיסות הבופר הבאות‪:‬‬
‫‪1. Na Acetate, pH 3.8‬‬ ‫‪6. Tris Maleate, pH 7.3‬‬
‫‪2. Na Acetate, pH 5.0‬‬ ‫‪7. Tris Maleate, pH 8.0‬‬
‫‪3. Na Acetate, pH 5.6‬‬ ‫‪8. Glycine-NaOH, pH 8.0‬‬
‫‪4. Tris Maleate, pH 5.6‬‬ ‫‪9. Glycine-NaOH, pH 10.0‬‬
‫‪5. Tris Maleate, pH 6.4‬‬ ‫‪10. Glycine-NaOH, pH 12.5‬‬

‫מהלך הניסוי‪:‬‬
‫קראו היטב את ההוראות!!‬
‫בסעיף זה חשוב להוסיף את האנזים בשלב האחרון – שימו לב לסדר הפעולות הנדרשות‪.‬‬ ‫‪.1‬‬
‫הכינו מבחנת ‪ 15ml‬עבור כל אחד מהבופרים ‪ -‬סה"כ ‪ 10‬מבחנות‪.‬‬
‫ערבבו תחילה את כמויות הסובסטרט והמים עבור ‪ 11‬מבחנות )כפי שנתון בטבלה( בכלי נפרד‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬יש‬
‫להעביר ‪ 1.45‬מ"ל מתערובת זו לכל מבחנה ממבחנות הניסוי )‪.(1-10‬‬
‫נפח בכל מבחנה )‪(µl‬‬ ‫נפח ל‪ 11 -‬מבחנות )‪(ml‬‬
‫‪pNPP 50mM‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪0.88‬‬
‫‪Water‬‬ ‫‪1,370‬‬ ‫‪15.07‬‬
‫‪Buffer 1-10‬‬ ‫‪500‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪Acid phosphatase 1 u/ml‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪-‬‬
‫‪Total‬‬ ‫‪2,000‬‬ ‫‪15.95‬‬

‫* לידיעתכם ‪ -‬התערובת בנפח של ‪ 2‬מ"ל מכילה‪:‬‬

‫‪2mM pNPP‬‬
‫‪ 10‬המבחנות‬
‫)מס' הבופר צריך להיות זהה למס' המבחנה( ‪100mM Buffer No. 1-10‬‬
‫‪2.5mM Acid phosphatase‬‬

‫הוסיפו את הבופר המתאים לפי מס' המבחנה‪.‬‬ ‫‪.2‬‬

‫הוסיפו את האנזים והדגירו למשך ‪ 10‬דק' ב‪.37oC-‬‬ ‫‪.3‬‬
‫עצרו את הריאקציה ע"י העברת המבחנות לקרח והוספה מיידית של ‪ 0.1ml 5M NaOH‬וערבבו‪.‬‬ ‫‪.4‬‬

‫‪7‬‬
‫*את הדוגמאות יש למהול לאחר התייעצות עם המדריך‪ .‬יש להתחשב במיהול שבוצע כשקובעים את ריכוז‬
‫התוצר ואת מהירות הריאקציה‪.‬‬
‫מהתמיסה המהולה העבירו ‪ 200μl‬לפלטת הקריאה ושמרו בקרח עד למדידת הבליעה האופטית‪.‬‬ ‫‪.5‬‬
‫*כל דוגמא יש להטעין בטריפליקטים )‪ 3‬חזרות(‪.‬‬
‫מדדו את הבליעה האופטית‪.‬‬ ‫‪.6‬‬

‫חישוב והצגת תוצאות‬

‫ציירו על אותו גרף את העקומה המתארת את מהירות הריאקציה האנזימטית של האנזים כתלות ב‪-‬‬ ‫‪.1‬‬
‫‪ pH‬וקבעו את ה‪ pH -‬האופטימלי עבור האנזים‪.‬‬
‫מה המנגנונים השונים בהם משפיע ה‪ pH -‬על פעילות אנזימטית?‬ ‫‪.2‬‬

‫דרישות כלליות לדו"ח לגבי כל הניסויים‪:‬‬

‫יש להגיש דו"ח מודפס בפונט ‪ David 12‬ברווח של שורה וחצי‪.‬‬ ‫●‬
‫יש להציג את הנתונים בטבלאות מסודרות ובגרפים בתוכנת אקסל ‪ +‬כותרות מתאימות לגרף וטבלה‪.‬‬ ‫●‬
‫הראו דוגמת חישוב מפורטת אחת )כולל יחידות( לכל חלק מהניסוי‪ .‬במידה ונעשה מיהול דוגמאות‬ ‫●‬
‫במדידת הבליעה האופטית‪ ,‬יש לכתוב בנוסף דוגמת חישוב מלאה ומפורטת הכוללת את המיהול‪.‬‬
‫פירוט הדרישות לדו"ח יפורסם בנפרד‬ ‫●‬

‫רקע ספרותי לניסוי‬

‫)‪1‬‬ ‫‪Strayer, 5th ed. Chapter 8, pages 189-226‬‬
‫)‪2‬‬ ‫‪Lehninger, 3rd ed. Chapter 8, pages 243-272‬‬

‫‪8‬‬