THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

CHỨA FLAVONOID
TS. Vũ Huỳnh Kim Long
 Flavo: màu vàng

FLAVONOID là 1 hợp chất lớn, làm thực vật có màu sắc (màu vàng nhạt -> vàng đậm -> tím, xanh)

có nhiều liên kết đôi liên hợp

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn

thường có màu sắc và gặp phổ biến
trong thực vật.
=> chống oxy hóa mạnh (vì

Đặc điểm: nhiều OH phenolics

OH có thể bị oxy hóa thành
những hợp chất cao hơn.
VD: andehit, acid)

• Tạo phức với kim loại (Fe3+, Al3+) ,Pb2+

• Tăng màu với NaOH xanh vàng
khi những
hợp chất bị
oxh đó đi
CẤU TRÚC: 3 vòng A,B,C - C6-C3-C6 vào cơ thể

gốc tự do sẽ tác dụng với gốc tự

làm biến tính do (khói, bụi, thức
protein, làm hệ ăn dùng dầu cũ, thịt
DNA đột biến nướng,...)
Vỏ của cây thuộc họ cam, chanh có 3 phần: VỎ QUẢ NGOÀI, VỎ QUẢ GIỮA, VỎ QUẢ TRONG
=> Vỏ quả giữa nhiều flavonoid nhất
=> dùng vỏ quả giữa làm thí nghiệm
tươi: đắng
Nguyên liệu nhiều túi tiết
tinh dầu
(do flavonoid -Naringin)
pectin - vỏ dai

dùng nụ hoa xay thành bột hoa chưa nở có rutin cao (>20%)
− Hòe (Flos Styphnolobii japonici imaturi, là nụ hoa đã phơi hay sấy nhẹ đến khô của cây Hoè,
Styphnolobium japonicum, Fabaceae); chỉ cho phép có hoa đã nở
− Đậu đen (Semen Vignae unguiculatae) là hạt của cây Đậu đen (Vigna unguiculata,
dùng đậu đen nguyên hạt
Fabaceae);
− Vỏ Bưởi (Pericarpium Citri grandi) là vỏ quả giữa của cây Bưởi (Citrus grandis, Rutaceae);
− Vỏ quả Me (Pericarpium Tamarindi) là vỏ quả của cây Me (Tamarindus indica L., Fabaceae).
− Rễ Tranh (Rhizoma Imperatae) là thân ngầm của cây Cỏ tranh (Imperata cylindrica,
họ lúa Poeaceae); là thân rễ
− Chất chuẩn rutin. nâu - do flavonoid
SOI BỘT
 Hoa => đặc trưng: hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm, lỗ khí, mảnh đài hoa, lông che chở đa - đơn bào, calci
oxalat hình khối/lăng trụ

SOI BỘT
Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển
vi, tìm các cấu tử sau:
chỉ có 1 tb xuyên
suốt lỗ bên trong
trốnghoàn toàn

Hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm Mảnh đài hoa mang

Lông che chở đơn bào lông che chở và lỗ khí

Mảnh mạch vòng

Lông che chở đa bào Mảnh đài hoa mang lông che chở Mạch vạch, mạch xoắn
xương cá, vạch song song
SOI BỘT
Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột hoa Hòe dưới kính hiển
vi, tìm các cấu tử sau:
mảnh biểu bì
vách dày cánh hoa
lỗ nảy mầm
hình đa giác
mảnh biểu bì mang lỗ khí

lông che chở đơn bào tinh thể calci õalat

mô mềm
lông che chở đa bào

mảnh mạch vạch hạt phấn tinh thể trong mảnh mô mềm

mảnh mạch xoắn

phân biệt với tinh bột nha - TỄ

 bột rễ nhàu dành cho bài anthaglycosid có những đặc điểm đặc trưng cho rễ ngoài cùng là lớp bần (những tb hình chữ nhật)
chứa hạt tinh bột (vì rễ là nơi dự trữ chất dinh

SOI BỘT dưỡng của cây)

có mảnh mô mềm

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột rễ Nhàu dưới kính hiển
vi, tìm các cấu tử sau:
cấu tử đặc
trưng cho
Nhàu

tb hình chữ nhật vách dày xếp thành 1 dãy với nhau sợi dọc dính lại với nhau thanh rải rác - trong suốt
Mảnh bần Bó sợi Tinh thể calci oxalat hình kim

cấu trử đặc

trưng cho rễ

mảnh lỗ hình tròn xếp thành dãy

Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Mạch điểm
tb đa giác xếp xen kẽ hình bầu dục
 SOI BỘT
cửu chưng, cửu sái (9 lần nấu, 9 lần phơi) -> thục địa (rễ cây đại
hoàng)

Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính
hiển vi, tìm các cấu tử sau:
cấu tử đặc
trưng cho rễ

tb hình chữ nhật vách dày xếp thành 1 dãy với nhau mảnh dài dính nhau, có lõi bên trong TỄ
Mảnh bần Bó sợi Hạt tinh bột

cấu tử đặc
trưng cho
đại hoàng

chứa nhiều hạt tinh bột

Mảnh mô mềm Tinh thể calci oxalate hình cầu gai Mạch vạch, mạch
SOI BỘT
Quan sát về mặt cảm quan và khảo sát bột Đại hoàng dưới kính
hiển vi, tìm các cấu tử sau:

tinh bột
mảnh trong
suốt chứa
nhiều hạt tinh
bột

hình cầu gai

hình chữ nhật
ĐỊNH TÍNH
 flavonoid hơi kém phân cực => dùng dung môi: cồn 96%

ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

5 erlen

1. Chiết xuất flavonoid:

Lấy 1 g mỗi bột dược liệu cho vào
một erlen 100 ml riêng biệt. Thêm 25 vì đậu đen chứa anthocyanidin
rất phân cực
ml ethanol 96% vào mỗi bình (Riêng
Đậu đen dùng cồn 25%). Đun trên
bếp cách thủy trong 5 phút. Dịch
chiết được để nguội, lọc vào các ống
nghiệm riêng biệt dùng làm các phản
ứng hóa học và dịch chấm sắc ký
lớp mỏng.
ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
tủa xanh đen
2. Định tính trên giấy lọc
phản ứng tăng màu
• Trên 1 tờ giấy lọc 15 ´ 18 cm dùng bút chì kẻ
thành bảng gồm 5 hàng ´ 5 cột, ghi chú như bên.
• Mỗi hàng, dùng pipette Pasteur nhỏ thật gọn vào
các ô 1 giọt dịch chiết của mỗi loại dược liệu, để khô
tự nhiên, lặp lại thêm 3 lần nữa. Vẽ vòng đánh dấu
các vết dịch chiết bằng bút chì. Nhỏ riêng biệt vào
các cột tương ứng dung dịch NaOH 1%, AlCl3 1%
trong MeOH và dung dịch FeCl3 1%. Chú ý nhỏ
dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn trong
vết dịch chiết.
• Để khô tự nhiên, quan sát và ghi nhận màu sắc
của các vết không có và có thuốc thử dưới ánh sáng
thường và UV 365 nm.
 ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
3.1. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm
3.1.1. Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% và tạo phức với ion kim loại
Với mỗi dược liệu, lấy 5 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết để làm các phản
ứng sau: 3
Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch NaOH 1%, quan sát màu;
Ống nghiệm 3: Thêm 2 giọt dung dịch AlCl3 1%, quan sát màu; soi dưới đèn UV,
quan sát hiện tượng, so sánh với ống chứng;
Ống nghiệm 4: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 1%, quan sát màu, có thể pha loãng
với 2 ml nước để quan sát rõ hơn.
Cách thực hiện: Riêng mẫu Bưởi, phản ứng với NaOH 1%: quan sát màu của ống
nghiệm trước và sau khi nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút.
 ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
3.1. Phản ứng của nhóm OH phenol và
nhân thơm 5 ống nghiệm
3.1.2. Phản ứng với thuốc thử diazonium
Thực hiện: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch
chiết, kiềm hóa bằng vài giọt dung dịch
NaOH 10%, thêm 1-2 giọt thuốc thử
diazonium lạnh. Lắc đều và quan sát màu
của dung dịch.
Ghi chú: Chỉ dùng 1-2 giọt thuốc thử
diazonium.
 ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
1 mũi mác là đủ
3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
3.2. Phản ứng Cyanidin trên vòng γ-pyrone
(phản ứng Shinoda) là phản ứng đặc trưng cho khung flavonoid
Cho 1 ml dịch chiết Đậu đen vào 3 ống nghiệm có
sẵn một ít bột Mg kim loại (nửa hạt bắp). Đặt 3 ống
nghiệm lên giá, đưa vào tủ hood. Thêm từ từ theo
thành ống nghiệm 0.5-1 ml HCl đậm đặc, quan sát
sự chuyển màu của dung dịch.
VÀNG -> ĐỎ ĐẬM cho HCl đến
khi đỏbền
ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
3.3. Định tính các hợp chất anthocyanidin chất này sẽ chuyển màu theo pH (đậu đen,...)
Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết, sau đó:
tìm cơ chế anthocyannidin và
leucoanthocyanidin
=> đem vào báo cáo
ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
3.4. Định tính các hợp chất Leucoanthocyanidin
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 2 ml dịch chiết vỏ quả me trong cồn. Quan sát màu
của dung dịch và so với ống chứng. Sau đó:
 ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
4. Định tính bằng SKLM:
Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), kích thước 7 cm × 2 cm
Hệ dung môi khai triển: ethyl acetat- methanol - nước (100: 17: 13).
Mẫu thử: Dịch chiết Hoa hoè. chấm 2 vết: mẫu thử và mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn: Hoà tan rutin trong ethanol 96% để được dung dịch có chứa 1 mg/ml.
Cách tiến hành: Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký và dung dịch rutin chuẩn lên
bản mỏng silica gel.
Phát hiện:
• Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm,
• Hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc : lấy bình amoniac vào tủ hood, cầm bảng mỏng hơ trên bình amoniac
-> nếu là flavonoid sẽ là màu vàng
• Nhúng thuốc thử FeCl3/EtOH -> vết màu xanh đen (butyl phenol)
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng có cùng giá trị Rf với vết rutin
chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
ĐỊNH LƯỢNG
Nguyên tắc
vàng nhạt -> cam
-OH bị oxy hóa thành 2 cetone

chuyển thêm nhóm N=O

N=O thành dạng
ion bắt cặp tạo phức nhôm
hồng -> đỏ
 ĐỊNH LƯỢNG
• Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân không) tới khối lượng
không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml. Hoà tan trong 70 ml methanol (TT) bằng cách làm ấm trên cách
thuỷ. Để nguội, thêm methanol (TT) đủ 100 ml, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào một bình định
mức 100 ml khác. Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2 mg rutin khan).
• Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; và 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình
định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn
kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch
natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500
nm. Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành.
• Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu thô cho vào bình Soxhlet. Thêm 120 ml ether (TT),
chiết tới khi dịch chiết không màu. Để nguội và gạn bỏ ether. Thêm 90 ml methanol (TT) và chiết tới khi dịch
chiết không còn màu. Chuyển dịch chiết vào một bình định mức 100 ml, rửa bình chiết bằng một lượng nhỏ
methanol rồi cho tiếp vào bình định mức. Thêm methanol cho tới vạch và lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch
trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch và trộn kỹ. Lấy chính xác 3 ml cho vào bình định mức
25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch
nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới
vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm (Phụ lục 4.1). Tính khối lượng rutin
(mg) của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường cong chuẩn và tính hàm lượng phần trăm rutin trong
dược liệu. Hàm lượng rutin trong nụ hoa Hoè không ít hơn 20%.
ĐỊNH LƯỢNG
• Dung dịch chuẩn: Cân chính xác
khoảng 0,2 g rutin chuẩn đã sấy
khô (trong chân không) tới khối
lượng không đổi, cho vào một
bình định mức 100 ml. Hoà tan
trong 70 ml methanol (TT) bằng
cách làm ấm trên cách thuỷ. Để
nguội, thêm methanol (TT) đủ 100
ml, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml
dung dịch này cho vào một bình
định mức 100 ml khác. Thêm
nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa
0,2 mg rutin khan).
 ĐỊNH LƯỢNG
• Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính
xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; và 6,0 ml dung
dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml
riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi
bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5%
(TT), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml
dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại
để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch natri
hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch,
trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp
thụ ở bước sóng 500 nm. Vẽ đường cong
chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ
là trục hoành.
 ĐỊNH LƯỢNG
• Dung dịch thử:
CẢM ƠN CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE!