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基础研究论著

骨改建中 miR-134-5p 通过靶向 Itgb1 抑制小鼠破骨细胞形成的研究

黄 萌 1,2，江小霞 3，崔建通 1，赵长铭 2，王振宁 1,2，张 宇 1,2，吴丽丽 2，孙兆峰 2，徐璐璐 2

1
解放军总医院研究生院，北京 100853； 2 解放军总医院第一医学中心 口腔正畸科，北京 100853；
3
军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100039

摘要：背景 微 RNA(microRNA) 是一种内源性非编码 RNA，在生命活动的各个方面都拥有不可忽视的地位，尤其在骨改建

中发挥着重要作用。其中，miR-134-5p 及其靶基因整合素 β1(integrin β1，Itgb1) 在破骨细胞中发挥的相互作用尚未见报道。
目的 研究 miR-134-5p 靶向 Itgb1 对小鼠破骨细胞形成的影响。方法 诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (bone marrow-
derived macrophages，BMMs) 分化为破骨细胞，用 TRAP 染色观察破骨细胞形态，并通过 qRT-PCR 检测 BMMs 向破骨细胞
分化的过程中破骨相关基因 TRAP、CTSK、NFATc1 以及 miR-134-5p 的表达水平变化。实验分为过表达 miR-134-5p 组
(agomir)、敲低 miR-134-5p 组 (antagomir) 及其相应对照组 (agomir NC 和 antagomir NC)，将其分别转染入 BMMs 中，qRT-
PCR 检测转染效率后，对各组进行破骨细胞 TRAP 染色和肌动蛋白环 (F-actin) 染色观察细胞形态，同时检测破骨相关基因
TRAP、CTSK、NFATc1 的表达水平；通过生物信息学网站筛选出 miR-134-5p 可能的靶基因 Itgb1，qRT-PCR 和 Western
blot 检测 Itgb1 基因表达。结果 与诱导 1 d 后的 BMMs 细胞相比，BMMs 诱导分化 7 d 后 TRAP 染色阳性的破骨细胞形成
增多，破骨相关基因 TRAP、CTSK、NFATc1 表达水平升高 (P＜0.01)，同时 qRT-PCR 检测结果提示 miR-134-5p 表达水平降
低 (P＜0.01)；转染 agomir 后 BMMs 在体外向破骨细胞的分化受到抑制，TRAP 染色阳性的破骨细胞数目减少，荧光下肌动
蛋白环数目也减少，且 TRAP、CTSK、NFATc1 基因表达水平降低 (P＜0.01)；而转染 antagomir 后促进 BMMs 细胞向破骨细
胞分化表现为 TRAP 染色阳性的破骨细胞数目增加，肌动蛋白环数目同样增加，且 TRAP、CTSK、NFATc1 基因表达水平升
高 (P＜ 0.01)。 通 过 生 物 信 息 学 网 站 筛 选 ， miR-134-5p 与 Itgb1 基 因 在 其 3-UTR 端 存 在 结 合 位 点 ， qRT-PCR 和 Western
blot 检测均显示上调 miR-134-5p 时 Itgb1 表达降低。结论 miR-134-5p 通过靶向 Itgb1 在破骨细胞形成中发挥抑制作用。
关键词 ： 破骨细胞；微 RNA；miR-134-5p；整合素 β1；骨改建
中图分类号 ： R596 文献标志码 ： A 文章编号 ： 2095-5227(2022)01-0067-08 DOI ： 10.3969/j.issn.2095-5227.2022.01.014
网络出版时间 ： 2022-01-14 09:37 网络出版地址 ： https://kns.cnki.net/kcms/detail/10.1117.R.20220113.1140.006.html
引用本文 ： 黄萌，江小霞，崔建通，等. 骨改建中 miR-134-5p 通过靶向 Itgb1 抑制小鼠破骨细胞形成的研究［J］. 解放军
医学院学报，2022，43（1）：67-74.

miR-134-5p inhibits osteoclastogenesis by targeting Itgb1

HUANG Meng1,2, JIANG Xiaoxia3, CUI Jiantong1, ZHAO Changming2, WANG Zhenning1,2, ZHANG Yu1,2, WU Lili2, SUN
Zhaofeng2, XU Lulu2
1
Graduate School of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2 Department of Orthodontics, the First Medical Center,
Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3 Institute of Military Cognition and Brain Science, Academy of Military
Medicine, Academy of Military Sciences, Beijing 100039, China
Corresponding author: XU Lulu. Email: xululu@301hospital.com.cn

Abstract: Background MicroRNAs (miRNA) are endogenous non-coding RNAs holding a nonnegligible position in every aspects
of life, especially in bone remodeling. Among these microRNAs, the interaction between miR-134-5p and its potential target gene
Integrin β1(Itgb1) is still unknown in osteoclastogenesis. Objective To study the effects of miR-134-5p on osteoclastogenesis via
targeting Itgb1. Methods The osteoclastic differentiation of mouse bone marrow-derived macrophages (BMMs) was induced into
osteoclasts and the morphology of osteoclasts was observed by TRAP staining. The expression levels of osteoclast-related genes
TRAP, CTSK and NFATc1 as well as miR-134-5p were detected by qRT-PCR. The experiment included four groups, miR-134-5p
overexpression (agomir) group, downregulating miR-134-5p (antagomir) group, and the control groups including agomir NC group
and antagomir NC group, then the cells were transfected into BMMs. qRT-PCR was then utilized to determine the transfection

收稿日期 ： 2021-09-18
基金项目 ： 国家自然科学基金项目 (92170986)；解放军总医院军事医学青年专项课题成长项目 (QNC19022)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (92170986)
作者简介 ： 黄萌，女，在读硕士，医师。研究方向：干细胞与再生医学。Email: 745266506@qq.com
通信作者 ： 徐璐璐，女，博士，副主任医师，副主任。Email: xululu@301hospital.com.cn
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efficiency and the morphology of osteoclasts was observed by TRAP staining and F-actin staining. The expression levels of TRAP,
CTSK and NFATc1 in each group were also detected. Bioinformatic analysis were used to screen the potential target gene of miR-
134-5p, and the expression levels of Itgb1 gene and protein were detected by qRT-PCR and Western blot. Results Compared with
the BMMs induced for 1 day, the osteoclasts differentiating from BMMs that induced for 7 days represented more TRAP positive
multinucleated cells, and expressed an increasing level of TRAP,CTSK and NFATc1 gene (P＜0.01), while the qRT-PCR results
showed that the expression level of miR-134-5p decreased (P＜0.01). The differentiation of the BMMs in osteoclasts in vitro was
inhibited after transfected with agomir, with decreasing number of TRAP positive multinucleated cells and F-actin rings, as well as
lower expression levels of TRAP, CTSK and NFATc1 (P＜ 0.01). However, after transfected with antagomir, the BMMs
accelerated the formation of osteoclasts, which manifested as the increasing number of TRAP positive multinucleated cells along
with F-actin rings, and the increased expression levels of TRAP, CTSK and NFATc1. Bioinformatic analysis showed that the
binding site between Itgb1 and miR-134-5p was existed at the 3 '- UTR end of Itgb1. qRT-PCR and Western blot showed that the
expression level of Itgb1 decreased when miR-134-5p was upregulated. Conclusion miR-134-5p plays an important role in
inhibiting osteoclastogenesis by targeting Itgb1.
Keywords：osteoclasts; microRNA; miR-134-5p; integrin β1; bone remodeling
Cited as：Huang M, Jiang XX, Cui JT, et al. miR-134-5p inhibits osteoclastogenesis by targeting Itgb1［J］. Acad J Chin PLA Med
Sch, 2022, 43（1）: 67-74.

骨改建是维持骨骼正常结构的重要过程。在 (receptor activator for nuclear factor κB ligand，

骨微环境中，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞 RANKL)、 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 (macrophage
的骨生成相互平衡，共同维持骨的基本结构稳 colony stimulating factor， M-CSF； Peprotech， 美
定。而外伤、激素水平等因素的刺激会引起骨改 国)；转染试剂 LipofectamineTM 2000 试剂盒 (Invit-
建微环境的变化，可能会导致破骨细胞异常激 rogen， 美 国 )； mRNA 引 物 、 miR-134-5p 引 物 、
活，从而导致骨组织出现不必要的吸收、溶解， miR-134-5p 过表达模拟物 miR-134-5p agomir、敲
影 响 骨 结 构 的 稳 态 [1]。 因 此 ， 探 究 骨 改 建 时 影 低 模 拟 物 miR-134-5p antagomir 及 相 应 阴 性 对 照
响破骨细胞的因素及其机制尤为重要。微 RNA (agomir NC 和 antagomir NC；生工生物工程股份
(microRNA，miRNA) 作为转录后基因表达的调控 有限公司，中国)；抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartaric
因 子 ， 是 一 种 长 度 约 22 nt 的 内 源 性 非 编 码 acidic phosphatase， TRAP) 试 剂 盒 (Sigma aldrich，
RNA[2]。研究表明多种 miRNA 在破骨细胞生成过 美国)；Trizol(Invitrogen，美国)；SYBR Green 荧
程中起着不可忽视的作用 [3-4]。它们通过调控靶基 光定量 PCR 检测试剂盒、PrimeScript RT reagent
因从而改变骨稳态，使骨微环境向骨形成或骨吸 kit 反转录试剂盒 (Takara，日本)；4% 多聚甲醛、
收方向进展 [5-7]。在大鼠平滑肌中 miR-134-5p 过表 0.1% Triton X-100 鬼笔环肽、4',6-二脒基-2-苯基吲
达可以促进钙沉积，而这也是成骨作用开始发生 哚 (DAPI；上海碧云天)；RIPA 缓冲液 (Sigma，美
的表现 [8]。然而，miR-134-5p 对骨吸收调控的相 国 )； BCA 试 剂 盒 (Thermo Fisher Scientific，
关机制尚未见报道。因此本研究旨在探讨 miR- USA)；兔抗鼠 GAPDH 、兔抗鼠 TRAP 抗体、兔
134-5p 在破骨细胞分化中发挥的作用及其可能的 抗鼠 CTSK、兔抗鼠 NFATc1 和兔抗鼠 Itgb1 抗体
机制，进一步阐明 miR-134-5p 在骨改建过程中的 (Affinity Biosciences，USA)；羊抗兔二抗 (中杉金
作用机制。 桥)；ECL 发光液 (普利莱)。
3 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离和培养 6 ~ 8
材料与方法
周龄的 C57BL/6 雄性小鼠采用颈椎脱臼法处死，
1 实验动物 6 ~ 8 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小 浸没于 75% 乙醇中。在无菌条件下分离小鼠下肢
鼠购于斯贝福 (北京) 生物技术有限公司，动物许 皮肤，暴露胫骨、股骨，剔除肌肉、筋膜等软组
可证号：SCXK(京)2019-0010。动物实验经军事科 织，用含双抗的 PBS 冲洗股骨和胫骨，随后剪去
学院军事医学研究院伦理委员会审核并予以批准 干 骺 端 ， 使 用 1 mL 无 菌 注 射 器 吸 取 无 血 清
(IACUC-DWZX-2020-729)。 α-MEM 培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔内无
2 主要试剂和材料 α-MEM 培养基 (Gibco，美 血块为止。将含有骨髓细胞的无血清 α-MEM 培养
国)；特级胎牛血清 FBS(Gibco，美国)；磷酸缓冲 基转移至 15 mL 离心管中，移液器将细胞吹打混
盐 溶 液 PBS(Gibco， 美 国 )； 青 霉 素 /链 霉 素 双 抗 匀，1 000 r/min 离心 5 min 后弃去上清，用含 10%
(Gibco， 美 国 )； 核 因 子 κB 受 体 活 化 因 子 配 体 FBS 的 α-MEM 完全培养基重悬细胞，接种于 T25
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培养瓶中，在温度为 37℃、5% CO2 培养箱中培 盒 说 明 书 ， 分 别 对 总 RNA 进 行 反 转 录 合 成

养 6 ~ 8 h。收集培养瓶中未贴壁的细胞，即为小 cDNA，采用 SYBR Green 荧光定量 PCR 检测试剂
鼠骨髓来源的巨噬细胞 (bone marrow monocytes， 盒或 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行检测。实
BMMs)。1 000 r/min 离心 5 min 后弃去上清，用 时定量 PCR 以 β-actin 为内参，检测破骨相关因子
含 10% FBS 的 α-MEM 完全培养基重悬细胞，计 的 表 达 ； 以 U6 作 为 内 参 ， 用 miRNA 荧 光 定 量
数，然后进行后续相关实验。 PCR 试剂盒检测 miR-134-5p 的相对表达量，引物
4 骨髓来源巨噬细胞的诱导分化 将 BMMs 以 序列见表 1，结果以 2-ΔΔCt 表示，实验重复 3 次。
5×105/孔接种于 24 孔板中，用含 30 ng/mL M-CSF 8 预 测 miR-134-5p 靶 基 因 通 过 靶 基 因 数 据
和 50 ng/mL RANKL 的 α-MEM 完全培养基培养， 库 TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRWalk
每 2 d 换液，诱导 7 d 后进行相应检测。将提取的 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) 以 及 miRDB
原代 BMMs 以 1×104/孔接种于 96 孔板中，细胞诱 (http://mirdb. org) 在线预测 miR-134-5p 的靶基因结
导至 7 d 时，根据 TRAP 染色试剂盒说明书对诱导 果，绘制韦恩图，得到交集靶基因。
的 细 胞 进 行 TRAP 染 色 ： 移 除 培 养 液 ， 用 PBS 9 检测靶基因和蛋白表达量 收集诱导后的破
洗 3 遍，每次 5 min。4% 多聚甲醛固定 20 min， 骨 细 胞 ， 分 别 通 过 qRT-PCR(实 验 步 骤 同 上 文
PBS 洗 3 遍 ， 每 次 5 min， 使 用 TRAP 染 色 液 “7 RNA 提取及 qRT-PCR”) 和 Western blot 检测转
37℃ 孵育 1 h 后终止染色，在倒置相差显微镜下 染后各组 Itgb1 基因和蛋白表达量。
观察并拍照，记录每个孔中 TRAP 阳性且细胞核 10 Western blot 检测 Western blot 检测收集转
数目≥3 的破骨细胞数目。 染后的破骨细胞，用 PBS 清洗 2 遍，加入细胞裂
5 细胞分组及转染 实验分为过表达 miR-134- 解液 RIPA 裂解细胞。按照 BCA 试剂盒的说明，
5p(agomir) 组 、 敲 低 miR-134-5p (antagomir) 组 及 测定蛋白含量后，制备 10% SDS-PAGE 的凝胶取
其 相 应 对 照 组 (agomir NC 和 antagomir NC)。 将 定量的总蛋白量进行电泳，PVDF 转膜，室温下
BMMs 细 胞 以 1×106/孔 种 于 12 孔 板 中 ， 按 照 5% 脱 脂 牛 奶 封 闭 1 h， 一 抗 TRAP、 CTSK 和
LipofectamineTM 2000 试 剂 盒 说 明 书 ， 使 用 Lipo- NFATc1 按照 1∶1 000 的浓度配制后 4℃ 孵育过
fectamineTM 2000 将 agomir、antagomir 及其相应对 夜；次日 TBST 洗 3 次，每次 10 min，加入二抗
照 agomir NC、 antagomir NC 分 别 转 染 入 BMMs 室温孵育 1 h 后，TBST 洗 3 次，ECL 发光液显色。
中，在 37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后更换 使用 Image J 软件对 Western blot 条带进行分析。
含 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的 α-MEM 11 统计与分析 采用 Graphpad Prism 7 软件进
培养基继续诱导培养 7 d。按照 TRAP 染色试剂盒 行统计学分析。数据以 3 次独立重复实验的 x̄ ± s 表
说明书对细胞进行 TRAP 染色 (方法同前)，检测 示，两组间样本均数比较采用 t 检验，多组间比较
转染后各组形成的破骨细胞数目。 采用单因素方差分析，进一步两组间样本比较采
6 肌动蛋白环 (F-actin) 染色 为检测诱导后形成
表 1 引物序列
的破骨细胞中肌动蛋白环数目，将提取的原代 Tab. 1 Primer sequences
BMMs 以 1×104/孔接种于 96 孔板中，细胞按照分
Gene Primer Sequnences (5'-3')
组诱导至 7 d 时，PBS 清洗 BMMs 诱导的破骨细 CAAGAACTTGCGACCATTGTTA
Forward
胞 3 次，4% 多聚甲醛冰上固定 15 min，PBS 清洗 TRAP
Reverse ATCCATAGTGAAACCGCAAGTA
细胞 3 次；用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 室温透 Forward GCTTGGCATCTTTCCAGTTTTA
CTSK
化细胞 10 min，PBS 清洗细胞 3 次；加入鬼笔环 Reverse CAACACTGCATGGTTCACATTA
Forward GAGAATCGAGATCACCTCCTAC
肽染色液，在室温避光孵育 20 min，进行染色； NFATc1
Reverse TTGCAGCTAGGAAGTACGTCTT
PBS 清洗细胞 3 次，加入 DAPI 染色液复染 10 min， Forward TACTCTGGAAAATTCTGCGAGT
Itgb1
吸去染色液，PBS 清洗细胞 3 次；吸去多余水分， Reverse ATAGCATTCACAAACACGACAC
封片，荧光显微镜观察纤维状肌动蛋白 (F-actin)。 miR-134-5p
Forward TATGTGACTGGTTGACCAGAGGGG
Reverse GTGCAGGGTCCGAGGT
经标记后细胞呈红色空泡状，含有 3 个或 3 个以
Forward TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC
上 DAPI 蓝染细胞核的阳性细胞即为破骨细胞。 β-actin
CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC
Reverse
7 RNA 提取及 qRT-PCR 使用 Trizol 提取细胞 Forward GCGCGTCGTGAAGCGTTC
U6
中的总 RNA，按照 mRNA 和 miRNA 反转录试剂 Reverse GTGCAGGGTCCGAGGT
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用 Dunnett-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。 转 染 效 率 。 与 各 自 阴 性 对 照 组 相 比 ， miR-134-

5p 过表达组 (转染 agomir 组) 破骨细胞中 miR-134-
结 果
5p 表达显著升高 (P＜0.001)，而在 miR-134-5p 敲
1 BMMs 分离培养和诱导分化情况 小鼠 BMMs 低组 (转染 antagomir 组) 显著降低 (P＜0.05；图 3)，
在含有 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 培养 表明细胞成功实现 miR-134-5p 过表达或敲低。
基的诱导下，在 7 ~ 10 d 内发生细胞融合，形成多 3 miR-134-5p 抑制破骨细胞的形成 对进行转染
核 巨 细 胞 。 通 过 TRAP 染 色 方 法 ， 发 现 与 诱 导 的 细 胞 进 行 TRAP 染 色 对 破 骨 细 胞 数 目 进 行 计
1 d 的 BMMs 细胞相比，诱导 7 d 后的 BMMs 细胞 量，并且进行肌动蛋白环 (F-actin) 染色，同时通
可形成大量多核巨细胞，且两组有统计学差异 过 qRT-PCR 检测破骨相关基因。结果显示，转染
(P＜ 0.001； 图 1)。 对 形 成 的 破 骨 细 胞 进 行 实 agomir 后，TRAP 染色示 agomir 组中 TRAP 染色
时定量 PCR 检测，发现在破骨诱导过程中破骨 阳 性 的 多 核 巨 细 胞 数 较 对 照 组 显 著 减 少 (P＜
相 关 基 因 TRAP、 CTSK 和 NFATc1 表 达 升 高 0.01)；而转染 antagomir 后，antagomir 组中 TRAP
(图 2A~C)，而破骨 细胞中 miR-134-5p 的表 达降 染色阳性的多核巨细胞数较对照组明显增加 (P＜
低 (P＜ 0.05； 图 2D)， 提 示 破 骨 诱 导 成 功 ， 且 0.01；图 4)。通过 F-actin 免疫荧光检测肌动蛋白
miR-134-5p 在破骨细胞中发挥抑制作用。 环数目，并对其进行统计分析，也显示了同样的
2 miR-134-5p 过表达和敲低模拟物转染效率的验 结果——转染 agomir 后肌动蛋白环的形成数目显
证 BMMs 转染 miR-134-5p 过表达和敲低模拟物 著减少，而转染 antagomir 后肌动蛋白环形成数目
及其相应阴性对照 48 h 后，通过 qRT-PCR 检测其 明显增多 (P＜0.01；图 5)。同时，通过 qRT-PCR

图 1 BMMs 破骨诱导分化 7 d 后的 TRAP 染色

A：破骨诱导 1 d 后的 TRAP 染色；B：破骨诱导 7 d 后的 TRAP 染色；C：对形成破骨细胞进行定量分析
Fig.1 TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days
A: TRAP staining after the BMMs was induced for 1 day; B: TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days; C: quantitative
analysis of the formation of osteoclasts

图 2 BMMs 破骨诱导分化 7 d 后的破骨相关基因 TRAP (A)、CTSK (B)、NFATc1(C) 及 miR-134-5p (D) 的表达

Fig.2 Expression levels of osteoclast-related genes TRAP (A), CTSK (B), NFATc1(C) and miR-134-5p after the BMMs was induced for 7 days
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图 3 miR-134-5p 过表达物 agomir、敲低物 antagomir 及其相应对
照的转染效率 A：转染 agomir 后检测其转染效率；B：转
染 antagomir 后检测其转染效率
Fig.3 Transfection efficiency of miR-134-5p
efficiency after agomir was transfected into the BMMs;
B: transfection efficiency after antagomir was transfected
into the BMMs
检测破骨分化相关基因 TRAP、CTSK 和 NFATc1，
转染 agomir 后破骨分化相关基因的表达明显低于
对照组，相反，转染 antagomir 后破骨分化相关基
因表达较对照组升高 (P＜0.001；图 6)。上述结果
提示 miR-134-5p 可显著抑制破骨细胞生成。
4 miR-134-5p 靶 基 因 预 测 为 了 进 一 步 探 究
miR-134-5p 抑制破骨细胞分化的相关机制，通过
TargetScan 、miRWalk、miRDB 这三个靶基因数
据库在线预测 miR-134-5p 的靶基因，对三者所预
测的结果绘制韦恩图，得到交集靶基因。结果提
示 miR-134-5p 与 Itgb1 的 3’UTR 区域存在结合位
点，可能是 miR-134-5p 潜在的靶基因 (图 7)。
5 qRT-PCR 及 Western blot 检 测 miR-134-5p 靶
基因 Itgb1 和蛋白表达量 qRT-PCR 显示，与对照
组 比 较 ， 转 染 agomir 组 中 Itgb1 表 达 显 著 降 低
(P＜ 0.001)， 而 转 染 antagomir 组 中 Itgb1 表 达 升
高 (P＜0.05；图 8)。Western blot 检测 Itgb1 蛋白
的表达水平，条带结果显示，与对照组相比，转染
agomir 后 Itgb1 蛋白表达量减少，转染 antagomir
后 Itgb1 蛋白表达量增加，对 Western blot 条带进
行统计分析，也呈现同样的结果 (P＜0.01；图 9)。
A: transfection
讨 论
骨改建是生物体受外界干预后发生的复杂生
理性反应，其发生的生物学基础即骨组织的可塑
性，也是人们研究的热点和重点 [9]。多种细胞参与
了骨改建的过程，如成骨细胞、骨髓间充质干细
胞、破骨细胞等，其中破骨细胞发挥着重要作
用。破骨细胞的发生主要是通过 RANK 受体激活
RANKL，从而引起下游 NF-κB 和其他信号通路的
激 活 ， 增 强 NFATc1 的 表 达 ， 继 而 引 起 包 括
TRAP、MMP9、Cathepsin K 等破骨细胞相关基因
的表达升高 [10]。这一过程受到多种细胞因子和蛋

图 4 miR-134-5p 过表达 (转染 agomir) 抑制破骨细胞形成，敲低 (转染 antagomir) 促进破骨细胞形成

A：转染 agomir 后进行 TRAP 染色观察破骨细胞形成数目；B：转染 antagomir 后进行 TRAP 染色观察破骨细胞形成数目
Fig.4 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited osteoclasts formation and knockdown of miR-134-5p (transfected
with antagomir) accelerated the formation of the the osteoclasts
A: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with agomir; B: the number of osteoclasts was counted by
TRAP staining after transfected with antagomir
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图 5 miR-134-5p 过表达 (转染 agomir) 抑制肌动蛋白环形成，敲低 (转染 antagomir) 促进肌动蛋白环形成

A：转染 agomir 后进行 F-actin 染色观察肌动蛋白环形成数目；B：转染 antagomir 后进行 F-actin 染色观察肌动蛋白环形成数目
Fig.5 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited actin ring formation and knockdown of miR-134-5p (transfected
with antagomir) accelerated actin ring formation
A: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with agomir; B: the number of actin ring was counted by
F-actin staining after transfected with antagomir

图 6 miR-134-5p 过表达 (转染 agomir) 抑制破骨分化相关基因表达，敲低 (转染 antagomir) 促进破骨分化相关基因表达

A：转染 agomir 后进行 qRT-PCR 检测破骨分化相关基因表达；B：转染 antagomir 后进行 qRT-PCR 检测破骨分化相关基因表达
Fig.6 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited the expression levels of the osteoclast-related genes and knockdown
of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the expression levels of osteoclast-related genes
A: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with agomir; B: the expression levels
of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with antagomir
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图 7 Itgb1 可能是 miR-134-5p 调控的靶基因

A： TargetScan、 miRDB 及 miRWalk 预 测 的 miR-134-5p 交 集 靶 基 因 ； B： 生 物 信 息 网 站 TargetScan 预 测 miR-134-5p 可 能 调 控
Itgb1 以及调控位点区域
Fig.7 Itgb1 may be the potential target gene regulated by miR-134-5p
A: crosstalk of miR-134-5p target genes predicted by TargetScan, miRDB and miRWalk; B: miR-134-5p potentially targeted Itgb1
genes and its regulatory site region

图 8 qRT-PCR 显示过表达或敲低 miR-134-5p 对 Itgb1 基因表达

的影响 A：过表达 miR-134-5p 后 Itgb1 基因表达降低；
B：敲低 miR-134-5p 后 Itgb1 基因表达升高
Fig.8 Expression level of Itgb1 gene was determined after overex-
pression or knockdown of miR-134-5p A: the expression
level of Itgb1 gene decreased with overexpression level of 图 9 Western blot 显示过表达或敲低 miR-134-5p 对 Itgb1 蛋白表
miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 gene increased 达的影响 A： 过 表 达 miR-134-5p 后 Itgb1 蛋 白 表 达 降
with knockdown of miR-134-5p 低；B：敲低 miR-134-5p 后 Itgb1 蛋白表达升高
Fig.9 Expression level of Itgb1 protein was determined after over-
白 的 调 控 ， 其 中 miRNA 的 作 用 不 可 忽 视 。 expression or knockdown of miR-134-5p A: the expres-
miRNA 是 一 类 保 守 性 强 、 内 源 性 的 非 编 码 小 sion level of Itgb1 protein decreased with overexpression
level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 protein
RNA， 由 多 种 酶 加 工 合 成 ， 其 通 过 与 靶 基 因 increased with knockdown of miR-134-5p
mRNA 的 3’-UTR 区域结合起到识别和沉默靶基因
的作用 [11]。miRNA 在包括增殖、代谢和疾病发生 程中发挥的作用。
等领域都发挥着不同的作用，其中包括骨改建的 本研究首次发现，利用小鼠 BMMs 进行破骨
过程。Guo 等 [12]研究发现口颌面发育过程中 miR- 诱导分化，miR-134-5p 的表达在破骨发展过程中
206-3p 可 以 促 进 成 骨 ， 而 抑 制 破 骨 细 胞 分 化 。 降低，据此我们猜想 miR-134-5p 在破骨过程中发
Liu 等 [13] 发现在 TNF-α 诱导的骨丢失中 miR-1247- 挥 作用 。因 此， 我们 通过在 BMMs 中分 别转染
5p 发挥着重要作用。 miR-134-5p 过 表 达 物 (agomir)、 miR-134-5p 敲 低
在血管平滑肌组织中，Choe 等 [8] 发现 miR- 物 (antagomir) 及其各自的阴性对照后进行破骨细
134-5p 可通过抑制组蛋白去乙酰化酶 5 促进血管 胞 诱 导 分 化 ， 验 证 miR-134-5p 在 其 中 的 具 体 作
平滑肌细胞中钙沉积。而成骨细胞正是通过钙沉 用。我们采用 TRAP 染色和 F-actin 染色验证破骨
积逐渐形成骨基质，这提示我们 miR-134-5p 与骨 细胞的形成 [15]。结果显示，与其阴性对照相比，
再生密切相关 [8,14]。然而，miR-134-5p 在骨改建过 agomir 组 TRAP 染色阳性且细胞核数目大于 3 的
程中的作用尚未见报道。因此本研究关注于破骨 破骨细胞数量和肌动蛋白环数目明显减少，这说
分化，主要探讨了 miR-134-5p 在破骨细胞分化过 明 miR-134-5p 抑制了骨髓巨噬细胞向破骨细胞的
 74 解放军医学院学报 Acad J Chin PLA Med Sch Jan 2022，43（1） http://jyjx.cbpt.cnki.net

形成和分化。为了进一步验证 miR-134-5p 在破骨 in an Aβ(1-42)-induced model of Alzheimer's disease［J］. Aging

Cell，2020，19（1）： e13046.
细胞分化中的抑制作用，我们检测了破骨相关基 5 Zhao WH， Shen GY， Ren H， et al. Therapeutic potential of
因 TRAP、CTSK 和 NFATc1 的表达，在过表达后 microRNAs in osteoporosis function by regulating the biology of
cells related to bone homeostasis［J］. J Cell Physiol，2018，
其均下降，而敲低后均上调，与染色结果一致。 233（12）： 9191-9208.
这些结果表明，miR-134-5p 可以负调控破骨进程 6 Li P，Huang G. Long noncoding RNA LINC00858 promotes the
progression of ovarian cancer via regulating the miR-134-5p/
从而影响 BMMs 的破骨分化，这与 Dinesh 等 [16] TRIM44 axis［ J/OL］ . https://doi.org/10.1080/10799893.2021.
的 结 果 相 似 。 同 样 ， Zhang 等 [17] 研 究 发 现 ， 1968433.
7 Yang C， Zhang G， Zhang YS， et al. Exosome miR-134-5p
miR-134-3p 在创伤性股骨头修复中起积极作用， restrains breast cancer progression via regulating PI3K/AKT
可以促进骨髓间充质干细胞增殖，进而加速骨组 pathway by targeting ARHGAP1［J］. J Obstet Gynaecol Res，
2021，47（11）： 4037-4048.
织的修复。
8 Choe N， Shin S， Joung H， et al. The microRNA miR-134-5p
接下来，我们寻找 miR-134-5p 可能的靶标， induces calcium deposition by inhibiting histone deacetylase 5 in
vascular smooth muscle cells［J］. J Cell Mol Med，2020，
我 们 通 过 生 物 信 息 学 方 法 ， 通 过 将 TargetScan、
24（18）： 10542-10550.
miRDB 和 miRWalk 三个数据库中关于 miR-134-5p 9 Ozkalayci N， Karadeniz EI， Elekdag-Turk S， et al. Effect of
continuous versus intermittent orthodontic forces on root
可能调控的基因取交集，对 miR-134-5p 的潜在靶
resorption: a microcomputed tomography study［J］. Angle
基因进行筛选，发现 Itgb1 可能是 miR-134-5p 的 Orthod，2018，88（6）： 733-739.
潜在靶基因。过表达 miR-134-5p 会引起 Itgb1 的 10 Tsukasaki M， Takayanagi H. Osteoimmunology: evolving
concepts in bone-immune interactions in health and disease［J］.
mRNA 和蛋白表达量减少，从而发挥抑制破骨细 Nat Rev Immunol，2019，19（10）： 626-642.
胞形成的功能。既往研究表明，整合素受体不仅 11 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP. Conserved seed pairing, often
flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are
是细胞黏附和迁移的效应器，在细胞分化过程中 microRNA targets［J］. Cell，2005，120（1）： 15-20.
也发挥着重要作用。Itgb1 可调节神经元和星形胶 12 Guo SY， Gu JW， Ma JQ， et al. GATA4-driven miR-206-3p
signatures control orofacial bone development by regulating
质细胞的分化、角质形成细胞分化、Ⅱ型肺上皮 osteogenic and osteoclastic activity［J］. Theranostics，2021，
细胞分化以及软骨发生等，同时 Itgb1 在多种细胞 11（17）： 8379-8395.
13 Liu ZC，Li CW，Huang P，et al. CircHmbox1 targeting miRNA-
表面表达，其中包括破骨细胞 [18-19]。Wang 等 [20] 1247-5p is involved in the regulation of bone metabolism by TNF-
在研究中发现 Itgb1 作为 IGFBP1 的关键受体，对 α in postmenopausal osteoporosis［J］. Front Cell Dev Biol，
2020，8： 594785.
于其发挥促进破骨细胞生成的功能至关重要。而 14 Tarantino U， Greggi C， Cariati I， et al. The role of PTX3 in
miR-134-5p 和 Itgb1 的靶向关系及二者在破骨细胞 mineralization processes and aging-related bone diseases［J］.
Front Immunol，2020，11： 622772.
中发挥的作用尚未见报道。 15 Zenker J， White MD， Gasnier M， et al. Expanding actin rings
综上所述，miR-134-5p 可能通过抑制 Itgb1 基 zipper the mouse embryo for blastocyst formation［J］. Cell，
2018，173（3）： 776-791.
因表达来抑制破骨细胞形成，从而参与骨改建的
16 Dinesh P，Kalaiselvan S，Sujitha S，et al. miR-506-3p alleviates
过程。但若要明确 miR-134-5p 对 Itgb1 基因的具 uncontrolled osteoclastogenesis via repression of RANKL/NFATc1
signaling pathway［J］. J Cell Physiol，2020，235（12）：
体调控作用，仍需进一步的 luciferase 实验进行验
9497-9509.
证，并有必要完善 miR-134-5p 对破骨细胞分化、 17 Zhang Y，Jia SS，Wei QS，et al. CircRNA_25487 inhibits bone
凋亡的影响。 repair in trauma-induced osteonecrosis of femoral head by
sponging miR-134-3p through p21［J］. Regen Ther，2021，16：
23-31.
参考文献
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