2.4.

Biểu hiện và tinh chế chitinase

Để tránh thành phần lạ (artifacts), quy trình sàng lọc (screening) và lựa chọn
(selection) được thực hiện bằng cách sử dụng ChiA mà không có bất kỳ đuôi ái lực
(affinity tag) nào.
Để tinh chế các biến thể ChiA, các gen kiểu hoang dã (wild-type genes) và
128mt được hợp nhất với thẻ His ở đầu C và chèn vào vectơ biểu hiện pFLAG-CTS
bằng cách nhân bản PCR bằng cách sử dụng chiHind3 và chi6HXho (5'-GCA CAG
CTC GAG TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTC GCA GCC TCC GAT CAG
CCG CC- 3') làm mồi.
Mồi ngược (Reverse primer) chứa đuôi hexa histidine để tinh chế ái lực của
ChiA tái tổ hợp.
Cấu hình nhiệt PCR bao gồm biến tính ban đầu ở 95°C trong 2 phút,  sau đó
là 30 chu kỳ 95°C trong 45 giây, 56°C trong 55 giây và 72°C trong 2 phút, tiếp
theo là bước mở rộng cuối cùng ở 72°C trong 10 phút.
Các cấu trúc được chuyển thành E. coli Top10.
Các chất biến đổi chứa cấu trúc chính xác được nuôi cấy trong môi trường LB
qua đêm trước khi chuyển sang 500 mL môi trường LB chứa 100 μg/mL ampicillin.
Sau khi nuôi cấy ở 37°C cho đến khi OD600 đạt 1,0, các tế bào được tạo ra
bằng IPTG ở nồng độ cuối cùng là 1 mM , tiếp theo là nuôi cấy tiếp ở 28°C trong 4
giờ.
Sau đó, các tế bào được thu hoạch bằng cách ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút ở
4°C trong 20 phút.
Enzym thô được điều chế từ tế bào vi khuẩn bằng cách hòa lại trong 1–2 mL
dung dịch đệm ly giải (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl và 10 mM imida zole, pH
8,0),
sau đó là siêu âm (Bộ xử lý siêu âm; biên độ 60, xung 6 s, trong 2 phút) trên
băng. Các mảnh vụn của tế bào sau đó được tách ra ở tốc độ 10 000 × g và dịch nổi
phía trên được thu thập dưới dạng lysate của tế bào.
Dịch nổi (Supernatant) phía trên chứa chitinase hòa tan được sử dụng để tinh
chế thêm bằng cách sử dụng nhựa Ni-NTA theo giao thức của Qiagen. Nhựa được rửa
bằng dung dịch đệm (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl và 40 mM imidazole, pH 8,0)
và rửa giải bằng dung dịch đệm rửa giải (elution buffer) chứa 250 mM imidazole.
Các phần chứa chitinase rửa giải được gộp lại và cô đặc bằng cách sử dụng
máy cô đặc màng Vivaspin (ngưỡng MW 30 000).
 Các dung dịch enzyme đậm đặc được chia thành các phần nhỏ và giữ ở nhiệt
độ –20°C trong dung dịch đệm natri phosphat, độ pH 6,0 chứa 15% glycerol để phân
tích thêm.
2.5. Xét nghiệm chitinase
Để xác định các thông số động học,
các phản ứng enzyme đã được thiết lập bao gồm 0,4 µg enzyme tinh khiết và
0,008–0,7 mM cơ chất, p-NP-(GlcNAc)2, trong dung dịch đệm natri photphat 100 mM
(pH 6,0), với tổng thể tích là 100 µL, trừ khi có quy định khác.
Sau khi ủ ở 37°C trong 30 phút, phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 10 µL
1N NaOH, và lượng p-nitrophenol giải phóng từ p-NP- (GlcNAc)2 được đo bằng cách
ghi lại độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm,
sử dụng đường cong chuẩn cho pNP. Trước khi xác định các thông số động
học, người ta đã xác định rằng sự hình thành sản phẩm là tuyến tính theo thời gian
trong các điều kiện của thử nghiệm này.
Các điều kiện phản ứng sao cho lượng cơ chất được chuyển hóa dưới 20% tổng
lượng cơ chất được thêm vào, ở tất cả nồng độ cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu
này.
Các giá trị của hằng số động học được tính toán từ biểu đồ Michaelis-Menten
bằng phương pháp khớp đường cong phi tuyến tính (GraphPad Prism 5).