E.

coli is one of the most widely used hosts for the production of heterologous proteins of
comercial or therapeutic interest, including high-value products such as biofuels or drugs
Among many other advantages, E.coli can grow on inexpensive substrates and, because of
extensive genetic knowledge and the large number of compatible molecular biology tools that
are available, it can be easily genetically modified. However, many eukaryotic proteins of
interest such as therapeutic proteins (e.g., antibodies) have complex tertiary or quaternary
structures that usually require post-translational modifications such as glycosylation,
phosphorylation, and addition of fatty acid chains that are necessary to obtain correct folding
and biological activity. Therefore, the overexpression of these heterologous proteins often
causes an imbalance in cell equilibrium that results in misfolding and aggregation of
recombinant proteins as inclusion bodies. The increase of misfolded proteins and aggregates
induces the E. coli HSR. Nevertheless, the induced HSR is usually not sufficient for high-speed
production of proteins that are difficult to fold. The use of synthetic biology strategies to
regulate the HSR of E. coli can help to avoid protein aggregation, increase protein solubility,
and increase the yield of correctly folded recombinant target proteins. For example,
overexpression of the heterologous protein in combination with chaperones (DnaK/DnaJ/GrpE,
GroEL/GroES, ClpB) or s32 proved to be effective in several studies because this enhanced
protein folding, solubility, and activity. . IbpA and IbpB, two small HSPs, are also known to
interact with the disaggregation and folding machinery of the cell . The presence of both
proteins slows protein misfolding and maintains partially folded proteins at the surface of the
aggregate. This is crucial for efficient stabilization and disaggregation. Their interplay increases
the ability of the DnaK system to refold proteins trapped in aggregates. Therefore,
manipulating the expression of HS genes using synthetic biology strategies can help to fine-
tune the production of heterologous proteins in E. coli.

E. coli es uno de los huéspedes más utilizados para la producción de proteínas heterólogas de
interés comercial o terapéutico, incluidos productos de alto valor como biocombustibles o
medicamentos Entre muchas otras ventajas, E. coli puede crecer en sustratos económicos y,
debido a un amplio conocimiento genético y al gran número de herramientas de biología
molecular compatibles disponibles, se puede modificar genéticamente fácilmente. Sin
embargo, muchas proteínas eucariotas de interés, como las proteínas terapéuticas (por
ejemplo, anticuerpos) tienen estructuras terciarias o cuaternarias complejas que generalmente
requieren modificaciones postraduccionales como glicosilación, fosforilación y adición de
cadenas de ácidos grasos que son necesarias para obtener un plegamiento y actividad
biológica correctos. Por lo tanto, la sobreexpresión de estas proteínas heterólogas a menudo
causa un desequilibrio en el equilibrio celular que resulta en un plegamiento incorrecto y la
agregación de proteínas recombinantes como cuerpos de inclusión. El aumento de proteínas y
agregados mal plegados induce la HSR de E. coli. Sin embargo, la HSR inducida generalmente
no es suficiente para la producción a alta velocidad de proteínas que son difíciles de plegar. El
uso de estrategias de biología sintética para regular la HSR de E. coli puede ayudar a evitar la
agregación de proteínas, aumentar la solubilidad de las proteínas y aumentar el rendimiento
de las proteínas diana recombinantes correctamente plegadas. Por ejemplo, la sobreexpresión
de la proteína heteróloga en combinación con chaperonas (DnaK/DnaJ/GrpE, GroEL/GroES,
ClpB) o s32 demostró ser eficaz en varios estudios debido a que esto mejoró el plegamiento, la
solubilidad y la actividad de la proteína. . También se sabe que IbpA e IbpB, dos pequeñas HSP,
interactúan con la maquinaria de desagregación y plegado de la célula. La presencia de ambas
proteínas ralentiza el plegamiento incorrecto de proteínas y mantiene las proteínas
parcialmente plegadas en la superficie del agregado. Esto es crucial para una estabilización y
desagregación eficientes. Su interacción aumenta la capacidad del sistema DnaK para reactivar
las proteínas atrapadas en los agregados. Por lo tanto, manipular la expresión de genes HS
utilizando estrategias de biología sintética puede ayudar a afinar la producción de proteínas
heterólogas en E. coli.

However, although overexpression of the heterologous proteins in combination with

chaperones generally increases protein solubility, this may not apply to all chaperones. No
universal chaperone system is effective in every case because they often handle specific
substrates, and different chaperones should therefore be tested to determine efficient protein
folding. Owing to the important role of chaperones in heterologous production, TaKaRa Bio
commercializes a chaperone plasmid set (Cat. 3340-TK) that includes five plasmids for
chaperone expression in E. coli. The plasmids allow coexpression of the E. coli HSP chaperones
GroES, GroEL, DnaK, DnaJ, and GrpE in different combinations, and these have been used in
several studies to increase the recovery of expressed proteins in the soluble fraction. Zhang
and colleagues used a different approach to increase recombinant protein production. They
reprogrammed E. coli proteostasis network by co-overexpressing a s32 mutant that is
insensitive to negative feedback regulation by the DnaK and GroE systems . The increased
stability of the mutant allows a non-transient HSR to be maintained. In addition, in this method
it is not necessary to study which chaperone system is most suitable to increase recombinant
protein solubility. Cho and colleagues compared the overexpressing s32 mutant to co-
overexpressing DnaK or GroE systems, and verified that overexpression of the s32 mutant
allows increased recombinant protein folding. In the future, the use of synthetic biology tools
such as gene-editing technology to modify the s32 gene in the E. coli genome could be an
interesting approach to increase recombinant protein production.

Sin embargo, aunque la sobreexpresión de las proteínas heterólogas en combinación con

chaperonas generalmente aumenta la solubilidad de las proteínas, esto puede no aplicarse a
todas las chaperonas. Ningún sistema de chaperonas universal es efectivo en todos los casos
porque a menudo manejan sustratos específicos y, por lo tanto, se deben probar diferentes
chaperonas para determinar el plegamiento eficiente de proteínas. Debido al importante papel
de las chaperonas en la producción heteróloga, TaKaRa Bio comercializa un conjunto de
plásmidos chaperonas (Cat. 3340-TK) que incluye cinco plásmidos para la expresión de
chaperonas en E. coli. Los plásmidos permiten la coexpresión de las chaperonas HSP de E. coli
GroES, GroEL, DnaK, DnaJ y GrpE en diferentes combinaciones, y estos se han utilizado en
varios estudios para aumentar la recuperación de proteínas expresadas en la fracción soluble.
Zhang y sus colegas utilizaron un enfoque diferente para aumentar la producción de proteínas
recombinantes. Reprogramaron la red de proteostasis de E. coli mediante la co-sobreexpresión
de un mutante s32 que es insensible a la regulación de retroalimentación negativa por los
sistemas DnaK y GroE. La mayor estabilidad del mutante permite mantener una HSR no
transitoria. Además, en este método no es necesario estudiar qué sistema de chaperonas es el
más adecuado para aumentar la solubilidad de proteínas recombinantes. Cho y sus colegas
compararon el mutante s32 sobreexpresado con los sistemas DnaK o GroE de co-
sobreexpresión, y verificaron que la sobreexpresión del mutante s32 permite un mayor
plegamiento de proteínas recombinantes. En el futuro, el uso de herramientas de biología
sintética, como la tecnología de edición de genes, para modificar el gen s32 en el genoma de E.
coli, podría ser un enfoque interesante para aumentar la producción de proteínas
recombinantes.

In addition to increasing recombinant proteins solubility and activity, chaperones can be

cooverexpressed to engineer a stress response system capable of increasing E. coli tolerance
to solvents. For example, the co-overexpression of GroES, GroEL, GrpE, and ClpB increased
tolerance to toxic chemicals such as butanol and ethanol. IbpA overexpression also improved
isopentenol yields. Chaperones have also been overexpressed in E. coli, purified, and
immobilized on a chromatography column to refold apparently irreversibly denatured
proteins, to renature insoluble proteins from an inclusion body, or to recondition enzymes that
have lost their activity because of long storage. GroEL is the most commonly used chaperone
for in vitro refolding. GroES in combination with GroEL, or with folding catalysts such as
protein disulfide isomerase and peptidyl-prolyl isomerase, also proved to be beneficial.
Although the application of chaperones on an large scale is limited, the chaperone systems
proved to be stable and maintain biological activity even after long storage, and some patents
on this topic have been filed

Además de aumentar la solubilidad y la actividad de las proteínas recombinantes, las

chaperonas pueden ser cosobreexpresadas para diseñar un sistema de respuesta al estrés
capaz de aumentar la tolerancia de E. coli a los solventes. Por ejemplo, la co-sobreexpresión de
GroES, GroEL, GrpE y ClpB aumentó la tolerancia a productos químicos tóxicos como el butanol
y el etanol. La sobreexpresión de IbpA también mejoró los rendimientos de isopentenol. Las
chaperonas también se han sobreexpresado en E. coli, purificadas e inmovilizadas en una
columna de cromatografía para reactivar proteínas aparentemente irreversiblemente
desnaturalizadas, para renaturalizar proteínas insolubles de un cuerpo de inclusión o para
reacondicionar enzimas que han perdido su actividad debido al almacenamiento prolongado.
GroEL es la chaperona más utilizada para el repliegue in vitro. GroES en combinación con
GroEL, o con catalizadores de plegamiento como la proteína disulfuro isomerasa y peptidil-
prolil isomerasa, también demostró ser beneficioso. Aunque la aplicación de chaperonas a
gran escala es limitada, los sistemas de chaperonas demostraron ser estables y mantener la
actividad biológica incluso después de un largo almacenamiento, y se han presentado algunas
patentes sobre este tema.

In addition to upregulating HSP genes, HS promoters may also be useful for producing
heterologous compounds in synthetic biology applications. Chemical inducers such as IPTG or
anhydrotetracycline (aTc) are commonly used to trigger protein expression in smallscale
fermentations . . However, their use should be avoided in large-scale fermentations because,
as previously stated, they can be expensive and can lead to safety problems because chemical
inducers are potentially toxic. Therefore, their presence in waste effluents or as contaminants
in the final purified recombinant product must be eliminated. This concern is even greater in
the production of pharmaceutical-grade proteins and other products for human or animal use.
Furthermore, the number of inducible promoters is limited and, because the complexity of
metabolic pathways is increasing, new inducible promoters will be necessary to control specific
elements of each pathway. Therefore, the usefulness of HS promoters to trigger the expression
of novel biological parts, networks, and pathways has been evaluated . Temperature induction
is a very simple inducible system because increasing/ decreasing the temperature of the
medium is technically easily achievable, safe, fast and cheap. In addition, the use of heat may
simplify downstream processing because it minimizes culture handling and contamination
risks. The heat transfer limitations of bioreactors should be considered, but slow heating rates
such those often observed in large-scale bioreactors may favor heterologous protein
production. Fast heating rates generate a large imbalance between tricarboxylic acid cycle and
glycolysis, leading to high energy requirements for overcoming the physiological stress. In
addition, HS promoters can help to reduce inclusion body formation and proteolytic
degradation of more complex proteins because they are in general weaker promoters, and
therefore the synthesis rate of the recombinant protein is reduced, allowing proper folding. HS
promoters may also be used in a synthetic circuit that couples the control of recombinant
protein production to a stress-induced, negative feedback mechanism. This circuit allows the
cell to shut down recombinant protein production when stress signals are detected. For that
purpose, synthetic biology principles, such as the integration of standardized parts in a
synthetic circuit, have been used. For example, a target recombinant protein was expressed
from an inducible bacteriophage T7 promoter engineered to be repressed by TetR expressed
from the stress-sensitive ibpA promoter

Además de regular al alza los genes HSP, los promotores de HS también pueden ser útiles para
producir compuestos heterólogos en aplicaciones de biología sintética. Los inductores
químicos como IPTG o anhidrotetraciclina (aTc) se usan comúnmente para desencadenar la
expresión de proteínas en fermentaciones a pequeña escala. . Sin embargo, su uso debe
evitarse en fermentaciones a gran escala porque, como se dijo anteriormente, pueden ser
costosos y pueden provocar problemas de seguridad porque los inductores químicos son
potencialmente tóxicos. Por lo tanto, debe eliminarse su presencia en efluentes residuales o
como contaminantes en el producto recombinante purificado final. Esta preocupación es aún
mayor en la producción de proteínas de grado farmacéutico y otros productos para uso
humano o animal. Además, el número de promotores inducibles es limitado y, debido a que la
complejidad de las vías metabólicas está aumentando, serán necesarios nuevos promotores
inducibles para controlar elementos específicos de cada vía. Por lo tanto, se ha evaluado la
utilidad de los promotores de HS para desencadenar la expresión de nuevas partes, redes y
vías biológicas. La inducción de temperatura es un sistema inducible muy simple porque
aumentar / disminuir la temperatura del medio es técnicamente fácilmente alcanzable,
seguro, rápido y barato. Además, el uso de calor puede simplificar el procesamiento posterior
porque minimiza el manejo del cultivo y los riesgos de contaminación. Se deben considerar las
limitaciones de transferencia de calor de los biorreactores, pero las tasas de calentamiento
lentas, como las que a menudo se observan en los biorreactores a gran escala, pueden
favorecer la producción de proteínas heterólogas. Las velocidades de calentamiento rápidas
generan un gran desequilibrio entre el ciclo del ácido tricarboxílico y la glucólisis, lo que lleva a
altos requisitos de energía para superar el estrés fisiológico. Además, los promotores de HS
pueden ayudar a reducir la formación de cuerpos de inclusión y la degradación proteolítica de
proteínas más complejas porque en general son promotores más débiles y, por lo tanto, la tasa
de síntesis de la proteína recombinante se reduce, lo que permite un plegamiento adecuado.
Los promotores de HS también se pueden usar en un circuito sintético que acopla el control de
la producción de proteínas recombinantes a un mecanismo de retroalimentación negativa
inducido por el estrés. Este circuito permite que la célula cierre la producción de proteínas
recombinantes cuando se detectan señales de estrés. Para ello, se han utilizado principios de
biología sintética, como la integración de partes estandarizadas en un circuito sintético. Por
ejemplo, se expresó una proteína recombinante diana a partir de un promotor de bacteriófago
T7 inducible diseñado para ser reprimido por TetR expresado a partir del promotor ibpA
sensible al estrés.

Therapeutic Applications

The human HSR has been studied for potential applications in gene therapy owing to its
efficiency and its potential to be induced by an external heat source. Controlling gene
expression in gene therapy is crucial for managing the timing and location of drug production
because minimizing systemic toxicity is vital. Hyperthermia (a procedure that increases the
body or local temperature above 37C) can be applied in a well-defined volume of tissue using
appropriate heating techniques. Several studies have demonstrated the feasibility a delivering
a therapeutic gene product controlled in space and time and activated by a minimally invasive
heating method using a HS promoter. The development of a novel gene therapy to treat
cancer cells in which therapeutic genes are activated by heat seems a logical approach because
hyperthermia is currently often used in combination with chemotherapy and radiotherapy. For
instance, by introducing into cancer cells a suicide gene under the control of a HSP promoter,
selective reduction or even elimination of the tumor was observed. Heat-inducible gene
expression was also combined with stem cell delivery to permeabilize in a non-invasive way
the blood–brain barrier with spatiotemporal precision. This method may be used in the future
to deliver different therapeutic drugs and to facilitate the treatment of central nervous system
diseases.

Aplicaciones terapéuticas

El HSR humano ha sido estudiado para aplicaciones potenciales en terapia génica debido a su
eficiencia y su potencial para ser inducido por una fuente de calor externa. El control de la
expresión génica en la terapia génica es crucial para controlar el momento y la ubicación de la
producción de fármacos porque minimizar la toxicidad sistémica es vital. La hipertermia (un
procedimiento que aumenta la temperatura corporal o local por encima de 37 ° C) se puede
aplicar en un volumen bien definido de tejido utilizando técnicas de calentamiento adecuadas.
Varios estudios han demostrado la viabilidad de administrar un producto génico terapéutico
controlado en el espacio y el tiempo y activado por un método de calentamiento
mínimamente invasivo utilizando un promotor HS. El desarrollo de una nueva terapia génica
para tratar las células cancerosas en la que los genes terapéuticos se activan por calor parece
un enfoque lógico porque la hipertermia se utiliza actualmente a menudo en combinación con
quimioterapia y radioterapia. Por ejemplo, al introducir en las células cancerosas un gen
suicida bajo el control de un promotor de HSP, se observó una reducción selectiva o incluso la
eliminación del tumor. La expresión génica inducible por calor también se combinó con la
administración de células madre para permeabilizar de manera no invasiva la barrera
hematoencefálica con precisión espaciotemporal. Este método se puede utilizar en el futuro
para administrar diferentes fármacos terapéuticos y para facilitar el tratamiento de
enfermedades del sistema nervioso central.

Likewise, E. coli HS promoters may also have important roles in healthcare applications using
synthetic biology approaches. Using synthetic biology, bacteria can be engineered for
therapeutic applications such as gene delivery vectors, vaccines, or to sense the environment
and generate a biological response, for example the release of a specific drug. Bacteria could
be engineered to produce a required compound in situ, and the expression of specific
biological parts or pathways could be triggered by a temperature increase. This increase could
occur by combining the bacterial therapy with, for example, laser or focused ultrasound
treatments [82] that are often used to treat solid tumors and that increase the local body
temperature. This in situ production could be highly beneficial in the cases where the drug has
low bioavailability (e.g., curcumin). Future microbial therapy applications may also include the
ability to detect fever in the host and reduce the response to inflammation by releasing a
therapeutic agent . In addition, temperature-dependent killing switches may be used to
prevent the survival of administered microbes after the desired treatment. This type of
containment strategy can decrease the safety concerns of using E. coli as a vector in the clinic

Del mismo modo, los promotores de E. coli HS también pueden tener un papel importante en
aplicaciones de atención médica utilizando enfoques de biología sintética. Usando biología
sintética, las bacterias pueden diseñarse para aplicaciones terapéuticas como vectores de
entrega de genes, vacunas o para detectar el medio ambiente y generar una respuesta
biológica, por ejemplo, la liberación de un medicamento específico. Las bacterias podrían
diseñarse para producir un compuesto requerido in situ, y la expresión de partes o vías
biológicas específicas podría desencadenarse por un aumento de temperatura. Este aumento
podría ocurrir combinando la terapia bacteriana con, por ejemplo, tratamientos con láser o
ultrasonido focalizado que a menudo se usan para tratar tumores sólidos y que aumentan la
temperatura corporal local. Esta producción in situ podría ser altamente beneficiosa en los
casos en que el fármaco tiene baja biodisponibilidad (por ejemplo, curcumina). Las futuras
aplicaciones de la terapia microbiana también pueden incluir la capacidad de detectar fiebre
en el huésped y reducir la respuesta a la inflamación mediante la liberación de un agente
terapéutico. Además, se pueden usar interruptores de muerte dependientes de la temperatura
para prevenir la supervivencia de los microbios administrados después del tratamiento
deseado. Este tipo de estrategia de contención puede disminuir las preocupaciones de
seguridad del uso de E. coli como vector en la clínica.

The E. coli HSR mechanism can also be used to detect novel b-lactam antibiotics in the
environment . For example, the E. coli grpE promoter was fused to the lux reporter and, when
multi-resistant strains were exposed to antibiotics to which they were not resistant, the stress
response was triggered and bioluminescence was detected. Moreover, chaperone
overexpression could be very promising in treatments for diseases associated with protein
aggregation such as Alzheimer’s or Huntington’s. Therefore, research has aimed at
understanding how chaperones with a role in protein disaggregation (disaggregases) function
in E. coli with a view to applying that knowledge to the treatment of human disease .

El mecanismo HSR de E. coli también se puede utilizar para detectar nuevos antibióticos b-
lactámicos en el medio ambiente. Por ejemplo, el promotor grpE de E. coli se fusionó con el lux
reporter y, cuando se expusieron cepas multirresistentes a antibióticos a los que no eran
resistentes, se desencadenó la respuesta al estrés y se detectó bioluminiscencia. Además, la
sobreexpresión de chaperonas podría ser muy prometedora en tratamientos para
enfermedades asociadas con la agregación de proteínas como el Alzheimer o la enfermedad de
Huntington. Por lo tanto, la investigación ha tenido como objetivo comprender cómo
funcionan las chaperonas con un papel en la desagregación de proteínas (desagregasas) en E.
coli con el fin de aplicar ese conocimiento al tratamiento de enfermedades humanas.

Concluding Remarks and Future Perspectives

The E. coli HSR involves a large number of complex controls that integrate multiple different
signals to precisely regulate the amounts of all the proteins involved. These controls can
minimize cellular requirements for HSPs and save energy. Therefore, they can be very useful in
synthetic biology to create parts, devices, and systems that can be used in different
applications. Although extensive research is still required before hyperthermia-regulated gene
therapy using E. coli HS promoters can be combined with different treatments, other potential
applications are not far from becoming a reality. For example, the creation of biosensors to
detect chemical pollutants in water using synthetic biology has received a great amount of
attention in recent years. The combination of a HS promoter and a reporter with a colorimetric
output can be used to create a cheap and practical device for use in developing countries. The
use of HS promoters in industry can also bring several advantages, as well as the coexpression
of chaperones to increase recombinant protein folding, solubility, secretion, and final yield.
Overall, the use of the E. coli HSR mechanism in synthetic biology approaches holds great
promise even though many challenges remain (see Outstanding Questions).

Observaciones finales y perspectivas futuras

La E. coli HSR implica una gran cantidad de controles complejos que integran múltiples señales
diferentes para regular con precisión las cantidades de todas las proteínas involucradas. Estos
controles pueden minimizar los requisitos celulares para las HSP y ahorrar energía. Por lo
tanto, pueden ser muy útiles en biología sintética para crear piezas, dispositivos y sistemas que
se pueden utilizar en diferentes aplicaciones. Aunque todavía se requiere una amplia
investigación antes de que la terapia génica regulada por hipertermia utilizando promotores
de E. coli HS pueda combinarse con diferentes tratamientos, otras aplicaciones potenciales no
están lejos de convertirse en realidad. Por ejemplo, la creación de biosensores para detectar
contaminantes químicos en el agua utilizando biología sintética ha recibido una gran atención
en los últimos años. La combinación de un promotor del SA y un reportero con una salida
colorimétrica se puede utilizar para crear un dispositivo barato y práctico para su uso en los
países en desarrollo. El uso de promotores de HS en la industria también puede traer varias
ventajas, así como la coexpresión de chaperonas para aumentar el plegamiento de proteínas
recombinantes, la solubilidad, la secreción y el rendimiento final. En general, el uso del
mecanismo HSR de E. coli en los enfoques de biología sintética es muy prometedor a pesar de
que quedan muchos desafíos (ver Preguntas pendientes).