1. A DNS és RNS kémiai felépítése, szerkezetük és funkcióik.

A DNS- és RNS-molekulák nukleotid egységekből felépülő lineáris polimerek,

amelyek az örökletes információkat hordozzák. A nukleotidok három összetevőből, egy
nitrogén tartalmú szerves bázisból, egy cukormolekulából és egy foszfátcsoportból állnak.
A nitrogén tartalmú bázis purin (A,G)- vagy pirimidingyűrűt (C,T,U) tartalmaz. A cukor 1’
szénatomja kapcsolódik a pirimidin bázis N1-es vagy a purin bázis N9-es nitrogénjéhez,
β-N-glikozidos kötéssel. Az ilyen módon létrejött molekulát nukleozidnak nevezzük.
A DNS dezoxiribózt, az RNS ribózt tartalmaz. A különbség a pentóz gyűrű 2’
szénatomjához kapcsolódó OH csoport, amelyet a DNS nem tartalmaz. Ez a különbség
stabilabbá teszi a DNS-t, ezzel egyeben reaktívabbá teszi az RNS-t, ezzel funkcióbeli
eltérésének alapját adja, tudniillik a DNS a genetikai állomány stabil hordozómolekulája,
míg az RNS a genetikai információt továbbító szerepe mellett pl. katalitikus funkcióval
bírhat.
Ha egy nukleozidhoz észterkötéssel egy foszfát csoport kötődik, azt nukleotidnak
nevezzük. Ilyen nukleotidokból áll össze a DNS és az RNS. Mind a DNS-t mind az RNS-t
négy nukleotid építi fel. Három (guanin, citozin, adenin) mind a kettőben megtalálható, de
a timin csak a DNS-ben, az uracil csak az RNS-ben lelhető fel. Ezek egymáshoz, sorban
kapcsolódva építik fel a polinukleotid láncot.
A polinukleotidok cukor foszfát gerincét 3’-5’ foszfodiészter kötések tartják össze,
és ehhez kapcsolódnak a bázisok a már ismertetett módon (1’N-glikozidos kötéssel).
Szintézisekor a nukleinsavlánc egy szabad 5’-foszfát csoporttal rendelkezik, míg az utolsó
nukleotid egy szabad 3’-OH csoporttal (ezért írjuk a nukleotidok sorrendjét 5’-3’ irányban).
Ez tekinthető az elsődleges szerkezetnek.
A nukleotidok egymás között nem kovalens kapcsolódásokat hoznak létre, ez adja
a másodlagos és harmadlagos szerkezetet. Az RNS változatos struktútákat vehet fel, az
alábbiak jellemzőek általánosságbban: csak egy szálú, amely szálon belül a
bázispárosodás szabályainak megfelelően H kötések alakulhatnak ki; minden RNS
molekulának más a szerkezete, nincs univerzális szerkezet, mint a DNS-nél.

(RNS szerkezetek)

A DNS az élő szervezetekben általában a B-formában van jelen. A B formát két

helikális polinukleotid lánc alkotja, amelyek ellentétes (antiparalell) lefutásúak (az egyik
5’-3’, a másik 3’-5’), közös tengelyük körül jobbmenetesen csavarodnak. A cukor-foszfát-
gerinc kívül helyezkedik el és negatív töltést hordoz, míg a bázisok belül helyezkednek el.
A cukor-foszfát-gerinc lefutás asszimetrikussá teszi a kettős hélixet, így azon kis és nagy
árkok alakulnak ki (ide, főleg a nagy árokba, kapcsolódnak a transzkripciós faktorok!!!)

1.
 A bázispárosodás szabályai alapján a guanin specifikusan kötődik a citozinhoz
három hidrogénkötéssel, míg az adenin a timinhez két hidrogénkötéssel a két lánc
szemközti oldalán (így egy pirimidinnel szemben egy purin bázis kerül). Az egymás feletti
bázispárok között van der Waals erők lépnek fel(gyenge apoláris kölcsöhatás), amely
stabilizálja a DNS szerkezetét és kiszorítják a vizet a DNS belsejéből amely H kötéseket
alakítana ki a bázisokkal, és lazítaná a DNS szerkezetét.

(DNS hélix és nukleotidok)

2.
2. Az eukarióta genom, a sejtmag szerkezeti jellemzése.

A sejtmag az eukarióta sejtekben a genomot tartalmazó, kettős membránnal

határolt sejtrész. A nem osztódó, interfázisos sejt a következő részekből épül fel:
• kromatin (lásd lentebb)
• nucleolus (magvacska): RNS-t és fehérjéket tartalmaz, itt zajlik az rRNS szintézise
• nucleoplasma: kitöltő szerepe van
• maghártya:
- külső és belső, köztük ún. perinuclearis tér
- magpórusok járják át
- külső lemeze összeköttetésben áll a rER membránjával, gyakran ribosomák is
ülnek rajta

A genom a sejt teljes haploid DNS-szekvenciája, humán genom esetén benne kb.
20-25.000. fehérje kódoló génnel, mely a 3 milliárd bázispár mindössze 1,5%-a. Az
eukarióta genomot DNS építi fel.
Egy DNS molekula egy kromoszómát alkot, -vagy megfordítva- egy
kromoszómában egy (lineáris) DNS helyezkedik el. A kromoszómák a sejtosztódás
folyamán válnak fénymikroszkóppal láthatóvá (a mitózis metafázisában a legkönnyebben
felismerhetők). Minden faj saját, jellegzetes számú és morfológiájú kromoszóma-készlettel
rendelkezik, ezt nevezik kariotípusnak, melynek ábrázolásásra a kariogram szolgál. Egy
gén kromoszómán elfoglalt helye a lokusz.
A DNS egy sorrendspecifikus biopolimer. Alapvető építőkövei a nukleotidok,
melyek részei: N-tartalmú szerves bázis + dezoxiribóz + foszfát-csoport. (esetlegesen a
nukleozidok fogalma is megkérdezhető: nukleozid = pentóz + bázis)
A nukleotidok csoportosítása:
Szerkezet szerint: H+-kötés kialakítás szerint:
• purin váz: A,G • két H+-kötés: A,T
• pirimidin váz: T,C • három H+-kötés: C,G
A DNS szintézise során dNTP-k (dezoxinukleotid-trifoszfátok) úgy kapcsolódnak
össze, hogy minden újabb nukleotid becsatlakozása során egy pirofoszfát hagyja el a
láncot, mellyel energia szabadul fel. Az így kialakult láncban minden nukleotid már csak 1
foszfátcsoportot tartalmaz. A DNS-láncban a nukleotidok között 3’-5’ foszfodiészter kötés
van. A DNS szerkezetének általános jellemzői:
• két szála kettős hélix formában egymás köré tekeredik
• a szálak vége kémiailag különbözik: foszfátcsoport az 5’ végen, OH-csoport a 3’
végen
• a két szál lefutása antiparallel
• a két szálon az egymással szemben lévő bázisok komplementer párokat képeznek
(Watson-Crick szabály)
• a bázispárok egy síkban, a hélix tengelyére merőlegesen helyezkednek el
• a kettős hélix nem teljesen szimmetrikus, kis- és nagy árkok váltják egymást
Eukariótákban a sejteknek náluknál több nagyságrenddel nagyobb méretű DNS-t
kell tárolniuk, sőt ahhoz szabályozottan hozzáférést kell biztosítaniuk. A DNS
“összecsomagolását” alapvetően két mechanizmus segíti:
• a DNS hisztonfehérjék köré tekeredik —> nukleoszóma
• a DNS a kettős hélix tengelye körül feltekeredve ún supercoiled szerkezetet vesz fel

3.
 A DNS a magfehérjék több osztályával komplex szupramolekuláris struktúrát alkot,
azaz kromatin szerkezetbe szervezett. A kromatin típusai:

EUKROMATIN HETEROKROMATIN

világos sötétebb

lazább szerkezetű tömörebb szerkezetű

transzkripció + transzkripció -

2 típus: konstitutív, fakultatív

1. DNS
2. Nukleoszóma: 11 nm-es elemi kromatinszál
• DNS + hiszton oktamer (2X H2A, H2B, H3, H4)
3. Szolenoid: 30 nm-es kromatinszál
• a H1 hiszton közel húzza a nukleoszómákat egymáshoz
4. Hurkos domén: kb. 100.000. bp.-onként
• a szolenoidok a nukleáris mátrix fehérjéihez, illetve sejtosztódás során a scaffold
(kromoszómaváz) fehérjéihez kapcsolódnak
5. További, nagyobb hurkok alakulnak ki
6. Kromoszóma

A sejtciklus során a kromoszómák kondenzálódnak, majd dekondenzálódnak. Az

osztódások közötti időszakban (interfázisban) a kromatinra a legkevésbé kondenzált
állapot a jellemző. A sejtosztódás során (metafázisban) a kromatin kondenzált formája van
jelen.

A humán genomban a gamétákká differenciálódó sejtek (ivari sejtvonal) kivételével

minden, a testet felépítő sejt szomatikus sejt. Ezek sejtmagja 2n = 46 db kromoszómát
tartalmaz, melyet 22 pár autoszóma és 1 pár nemi kromoszóma (X vagy Y) alkot. A párok
tagjai homológok, ami azt jelenti hogy egymásnak megfeleltethetőek, az azonos
fenotípusos jellegekre vonatkozó géneket azonos sorrendben tartalmazzák.
Egyes kromoszóma régiók génekben gazdagabbak vagy szegényebbek lehetnek,
az előbbiek rendellenességei általában súlyosabb következményekkel járnak. A DNS
szekvenciák osztályozása:
• nem ismétlődő:
- funkciójuk nem ismert

4.
 • ismétlődő:
- kromoszóma szerkezetének kialakításához és fenntartásához járulnak hozzá
- típusai:
• tandem (egy csoportban található) ismétlődő szekvenciák
• szétszórt ismétlődő szekvenciák
Különböző egyének genomjában kisebb eltérések is előfordul(hat)nak, ilyen egyedi
különbségek forrásai lehetnek:
• pontmutációk: 1-1 nukleotid megváltozása
• “indel” mutációk: inzerció, deléció
• CNV (copy number variation): egy-egy DNS szakasz a szokásostól eltérő
kópiaszámban van jelen

5.
3. Mutassa be a fehérjék szerkezetének szerveződési szintjeit!

A fehérjék egy vagy több polipeptid láncból épülnek fel. Az egyes

polipeptidláncokat egymással peptidkötésekkel összekapcsolódó aminosavak alkotják. A
fehérjék számos feladatot látnak el az élő szervezetben, lehetnek katalitikus enzimek,
strukturális alkotók mind a sejtben mind a sejt közötti állományban, lehetnek
membránhoz kötötten transzportfolyamatokat ellátva stb. Ezeket a feladatokat az
aminosavsorrendjükból adódó, egyedi, ún. natív térszerkezetük segítségével töltik be.

A fehérjék szerkezetének négy szintjét különítjük el: Az elsődleges szerkezet az

aminosavak peptidkötésekkel meghatározott sorrendjét jelöli. A másodlagos szerkezet az
aminosavsorrendben egymás melletti vagy egymáshoz közel elhelyezkedő aminosavak
által kialakított fehérjeszerkezeteket különbözteti meg. A fehérjék harmadlagos szerkezete
egy polipeptid teljes 3D-s szerkezetét jelöli. Negyedleges szerkezetről akkor beszélünk,
ha több polipeptidlánc kapcsolódik össze, vagy a polipeptidlánchoz más, nagyobb
molekula is kapcsolódik(pl. két azonos monomer fehérjéből kialakult homodimer)

Másodlagos szerkezet:
a) Alfa-hélix
- Primer struktúrában egymás mellett elhelyezkedő aminosavak jobbmenetes hélixbe
csavarodnak.
- A jobbmenetesség az aminosavak L konfigurációjából következik, bal menetben
ugyanis átfedésbe kerülnének az aminosavak oldalláncai a peptidkötésekkel
- A hélixet a hélix tengelyével párhuzamos H kötések stabilizálják, amik a
peptidkötések NH csoportjai és karbonilcsoportjai között alakulnak ki.
- A hélixben kevés hely lévén, az aminosavak oldalláncai az alfa-hélix külsején
helyezkednek el
- A bizonyos aminosavak „hélixtörőek” pl.glicin nem fordulnak elő az alfa-hélixben

b) ß-redős lemez
- A ß-redős lemez szerkezetet cikk-cakkos struktúrára emlékeztető, nyújtott egyedi
peptidláncok, ß-redők alkotják
- Az egyedi ß-redőket a rájuk merőledes állású H kötések stabilizálják, amelyek a
peptidkötések karbonil és NH csoportjai között alakul ki. Több, hidrogén kötéssel
összekötött ß-redő, ß-redős szerkezetet alakít ki
6.
 - A ß-redők a lemezben, N- és C-terminális aminosavaik elhelyezkedése szerint
lehetnek parallelek(egymással párhuzamosak) vagy antiparalellek(egymással ellentétes
állásúak).
- Az antiparallel lemez ß-redőit rövid szakaszok kötik össze, amelyek gyakran ß-hajtű
struktúrát vesznek fel. A paralell lemez ß-redőit hosszú aminosavszakaszok kötik össze,
az összekötő szakaszok alfa-hélixet alkotnak a lemez síkja felett vagy alatt
- A ß-redős lemezben(az alfa hélixhez hasonlóan) kevés hely van, ezért az aminosavak
oldalláncai vagy a lemez felett vagy a lemez alatt, a lemez síkjából kiemelkedve
helyezkednek el

c) ß-hajtű
A ß-hajtű struktúrát 4 aminosav hozhatja létre, amelyek között hidrogén kötés tartja
fent a kapcsolatot. Ebben a szerkezetben a polipeptidlánc megfordul, ezért ilyen elemek a
fehérjemolekula külső felszínén helyezkednek el a legtöbb esetben.

d) Rendezetlen szerkezetű fehérjeszakaszok

Ezek olyan szakaszok a fehérjében, amelyek nem érik el a másodlagos szerkezetet.
Összeköthetik a másodlagos szerkezetű szakaszokat, de akár kiterjedhetnek a fehérje
egy jelentős részére is. Ezen rendezetlen struktúrák, a kémiai kötések alacsony sűrűsége
miatt, nagyon flexibilisek, ezért lehetővé teszik az őket hordozó fehérjék kapcsolódását
más fehérjékhez és egyéb molekulákhoz. A kötödéskor legtöbbször a rendezetlen
szakaszok rendeződése következik be.

Harmadlagos szerkezet:
A fehérjék harmadlagos szerkezetének egyik legfontosabb tulajdonságát az a vizes
közeg határozza meg, amelyben a fehérjék többsége létezik. A víz hidrogén-hidas
szerkezete kiszorítja az aminosavak hidrofób oldalláncait, így azok a fehérje belsejében
helyezkednek el. Így a fehérje egy globuláris szerkezetet vesz fel. A másodlagos
szerkezeteket összekötő ß-lemez és alfa-hélixek alkotják.

7.
Fehérjedomének:
A fehérjedomének olyan szerkezeti egységek amelyek a másodlagos szerkezeten
túlmutatnak, de a teljes polipeptidlánc által alkotott szerkezetnél általában kisebb
fehérjeszerkezeti egységek, amelyek funkciókat hordoznak és a genomban konzerváltak.
Funkciójuk lehet pl. nukleotidkötés, kináz-, illetve foszfatázdomének.

Egy fehérjemolekula több domént is tartalmazhat és egy domén több különböző

funkciót betöltő (!!) fehérjén is előfordulhat. Ez azért van, mert a domének struktúrája
univerzálisan használható és szükségszerű is a használata, mivel a fehérjék harmadlagos
szerkezete nem tesz lehetővé végtelen mennyiségű konformációs lehetőséget. Éppen
ezért jól bevált doméneket használ a „természet” a különböző funkciók ellátására(ennek
bizonyítéka a domének genetikai konzerváltsága, ami lehetővé teszi a generációkon
keresztüli öröklését a „bejáratott” struktúrának).
Ilyenek például az „EF-kéz”, amely két alfa hélixből alkot Ca2+ kötőhelyet, a
találkozásnál elhelyezkedő glutaminsav és aszparaginsav-oldalláncok karboxilcsoportjai
képeznek komplexet. Ilyen struktúrát tartalmaz a kálciumfüggő jelátvitelben szerepet
játszó kalmodulin is.
Egy másik példa a a négy cisztein ls/vagy hisztidin oldallánccal komplexet képező, cink
ionnal stabilizált „cink ujj”, amely a fehérjék DNS-hez, illetve foszfotirozinokhoz való
kötődésben vesz részt.

8.
4. Ismertesse röviden a Michaelis-Menten kinetikai modell alapjait!

A legegyszerűbb elsőrendű kémiai reakciónál a nem katalizált S→P reakció

sebessége V= Δ[P]/Δt = [S]. Más szóval a reakció sebessége egyenesen arányos S
koncentrációjával. A sebesség így elvileg „végtelenségig” növelhető, annak csak S
oldhatósága szabna gátat.
Amennyiben egy enzim katalizálja az átalakulást, a reakció nagyságrendekkel
gyorsabban zajlik, ugyanakkor jellegzetesen eltérő az [S]-V függvény. Állandó [E] esetén
kis [S] értékeknél az [S] növelésével a V reakciósebesség közel egyenes arányban, tehát
lineárisan növekedik, de egyre nagyobb kiindulási [S] esetén a V egyre kevésbé
növekedik, és egy maximális érték felé tart.

Az első kinetikai modell, amely sikeresen magyarázta a fenti jelenséget a Michaelis-

Menten kinetikai modell, mely a következő feltételezéseken alapul: az enzim és a
szubsztrát között pillanatszerűen gyors reakcióban alakul ki az ES-komplex, ezért ennek a
részreakciónak a sebességi állandóival a modell nem is foglalkozik. Ezek helyett csak az
egyensúlyi állandót, KS-t (nem-kovalens ES kölcsönhatás esetén disszociációs állandó)
definiálják:

KM/KS: Az a szubsztrátkoncentráció, melynél a reakció a maximális sebesség (Vmax)

felével zajlik. Felvilágosítást ad arról a szubsztrátkoncentráció-tartományról, melyben a
reakció nagy hatékonysággal zajlik.
Vmax: Az a reakciósebesség, melyet akkor mérünk ha az enzim aktív centruma
telítve van szubsztráttal, azaz [S] >> KM.

(E szerint a modell szerint a termék irányú bomlás olyan alacsony ütemű, hogy a
mérés során praktikusan nem befolyásolja az [E], [S] és [ES] egyensúlyi koncentrációkat.)

A valóságban jellemzően egy az enzim és a szubsztrát mennyisége ismert. Ahhoz,

hogy olyan egyenlethez jussunk, amely ES nem ismert koncentrációja helyett ismert
enzim és szubsztrát-koncentrációkat tartalmaz, ki kell fejeznünk az ES koncentrációt a
kísérletben beállított, tehát ismert koncentrációkkal. Ez annak figyelembevételével
lehetséges, hogy a szabad enzimkoncentráció (E), a teljes enzimkoncentráció (ET), és az
ES-komplexben lévő enzimkoncentráció között az alábbi egyszerű összefüggés áll fenn:

9.
 Az előbbi két reakciót kombinálva és rendezve:

Amikor a szubsztrát koncentrációja nagymértékben meghaladja a KS értékét, a

szubsztrát telíti az enzimet, minden enzim ES komplexbe kerül, a kezdeti sebesség (V0)
eléri a maximálisan elérhető értéket (Vmax), további szubsztrát koncentráció növelésével a
sebesség már nem növelhető. Ebben a szubsztrát koncentráció tartományban a kezdeti
sebesség tehát már gyakorlatilag nem függ a szubsztrát koncentrációjától. Ekkor tehát
[ES] = [ET]. Ennek figyelembevételével kapjuk az alábbi egyenletet, ami a legegyszerűbb,
eddig tárgyalt enzimkinetikai modell végső egyenlete:

A Michaelis-Menten kinetikai modell csak akkor érvényes, ha:

• a reakció 2. lépése nem megfordítható
• kinetikailag stabil ES-komplex alakul ki
• a reakció során a S koncentrációja nem változik
• a P azonnal ledisszociál az E-ről, azaz EP-komplex nem képződik
• az E aktív centrumához csak egy S kötődik
• k3 << k1,k2
A Michaelis-Menten kinetikai modell hibái:
1. Amikor a szubsztrát koncentrációja éppen megegyezik a KS számértékével,
akkor a reakció kezdeti sebessége (V0) éppen a Vmax érték fele. Ez alapvető
problémákat vet fel: minél hatékonyabb egy enzim, annál inkább
tarthatatlan az a feltételezés, hogy az enzimkatalízis során a
nagysebességgel zajló szubsztrát fogyás ne mozdítaná be az enzim, a
szubsztrát és az ES-komplex között – az eredeti feltételezés szerint
pillanatszerűen gyorsan - kialakuló egyensúlyt. A fenti leírás tehát éppen a
leghatékonyabb enzimek jellemzésére a legkevésbé alkalmas.
10.
 2. A KS egy disszociációs állandó, ami mint ilyen, kötéserősség, más szóval
affinitás jellemzésére is alkalmas. A KS ebben a modellben megadja, hogy
az enzim mennyire stabil kölcsönhatást létesít a szubsztráttal, milyen
„erősen” köti azt. A modell szerint minél alacsonyabb a KS, annál
hatékonyabb az enzim, hiszen annál alacsonyabb szubsztrát koncentráción
éri el a reakció sebessége Vmax értékének a felét. Csakhogy a valóságban
minél stabilabb kölcsönhatást létesít az enzim a szubsztráttal, annál
lassabbnak kell lennie a reakciónak, hiszen az enzim éppenséggel
stabilizálná a szubsztrátot. Az enzimnek természetesen meg kell kötnie a
szubsztrátot, de igazán hatékonyan a rendkívül instabil átmeneti állapottal
kell kölcsönhatást létesítenie, azt kell stabilizálnia.

A modell továbbfejlesztett formája lesz a Briggs-Haldane-féle “steady state”

kinetikai modell, mely szerint az enzim és a szubsztrát oldatának összekeverésekor nem
egy dinamikus egyensúly, hanem egy stacionárius állapot (steady state) áll be szinte
pillanatszerű gyorsasággal. A stacionárius állapotban a körülményektől függően akár
hosszú ideig állandó lehet az ES komplex koncentrációja. Nem érvényes a k3 << k1,k2.

11.
5. Ismertesse és röviden jellemezze az enzimgátlások típusait!

Az emberi szervezetben szűk pH, nyomás és hőmérséklet határok között mennek

végbe kémiai reakciók, sokkal gyorsabban mint az természetes módon lejátszódna. A
reakciók körülményeinek optimalizálásában és gyorsításában az enzimek vesznek részt,
amelyek az általános kémiai katalizátorok analógjai. Az enzimek képesek a sejt bonyolult
belső környezetében kiválasztani a megfelelő kémiai anyagokat(szubsztrátok) és kizárólag
ezen anyagok kémiai átalakulását katalizálni. Ez az enzimek specificitása. Ezen enzimek
specificitása, és aktivitása külső szignálokra változtatható, ez adja szabályozhatóságukat.

A szabályozás különböző időskálán történik. A leggyorsabb hatást a szabályozó

anyag(ligand) bekötődése okozza, amely azonnal képes kifejteni aktivációs vagy
inhibitorikus hatását. Ennél hosszabb időt igényel az enzim kovalens módosítása(pl.
egyes aminosav oldalláncok foszforilálása) vagy egy új enzim molekula szintézise.

Az enzimgátlások ismertetése előtt szükséges néhány enzimkinatikai alapfogalom

áttekintése.

Az enzimaktivitás mértékegységei:
Standard enzim egység (U, unit) vagy aktivitás: Egy unit (U) enzimaktivitás 1
mikromol szubsztrátot alakít át percenként termékké, meghatározott körülmények között.
Egy katal (kat) enzimaktivitás a reakció sebességét egy mól/sec értékkel növeli
meg, meghatározott körülmények között.
Specifikus aktivitás: egységnyi fehérje mennyiségére vonatkozó enzimaktivitás
(U/mg). Segítségével egy enzim tisztulása nyomon követhető.
Katalitikus állandó vagy átviteli szám: egy enzimmolekula (katalitikus hely) által
időegység alatt átalakított szubsztrátmolekulák maximális száma. Dimenziója: s-1.
Megadja, hogy milyen hatékony az enzim, ha az aktív hely telítve van.
Ezek mellett szükséges a Km és a vmax értelmezése, amely a Michalis-Menten kinetikai
modell alapján számítható (lásd 4.tétel).

A Km a maximális sebesség (vmax) félértékéhez (vmax/2) tartozó

szubsztrátkoncentrációt jelenti. Ismeretében tudjuk azt a szubsztrát koncentráció
spektrumot/intervallumot amelyben az enzim a leghatékonyabban működik. Ha a
k3<<<k2, vagyis sokkal kisebb érték, akkor a Km=Ks-sel vagyis a szubsztrát
disszociációs állandójával, és ilyenkor ez minnél kisebb értéket vesz fel, annál jobban
kötődik a szubsztrát az enzimhez.

A vmax az a reakciósebesség, amit akkor mérünk, ha az enzim aktív helye telítve

van szubsztráttal, (S)>>Km, vagyis a szubsztrát koncentráció sokszorosa a maximális
sebesség félértékéhez tartozó szubsztrátkoncentrációval.(Km fogalma)

12.
Az enzimgátlások típusai:
Két fő csoportot különböztetünk meg, reverzibilis és irreverzibilis gátlást. Ezeken
belül további alcsoportokról beszélhetünk.

I. Reverzibilis kompetitív gátlás

Ebben az esetben az inhibitor hasonlít a szubsztrátra és azzal verseng az aktív
centrumhoz való kötődésért. A gátlószer csak a szabad enzimmel kapcsolódhat, ám
kellően magas szubsztrátkoncentrációval leszorítható, hiszen ilyenkor az inhibitor nem
képes kötődni az enzimhez(a kötődés valószínűsége nagyon lecsökken)
A gátlás növeli a Km értéket, de nem változtatja meg a vmax értékét.

II. Reverzibilis inkompetitív gátlás

Az inhibitor nem verseng a szubsztráttal az aktív kötőhelyért. Szerkezetileg nem
hasonlít a szubsztráthoz. Az inhibitor képes az enzimhez vagy akár az enzim-szubsztrát
komplexhez kötődni, így a szubsztrát koncentrációjának növelése nem változtat az
inhibíción.
A gátlás nem változtatja a Km értékét, de csökkenti az elérhető vmax értéket.

III. Reverzibilis unkompetitív gátlás

Ebben az esetben az inhibitor csak az enzim-szubsztrát komplexhez kötődik, ezzel
megakadályozza a további katalitikus reakciót, a termék létrejöttét. Ezek az inhibitorok
gyakoriak a több-szubsztrátos reakcióknál.
A gátlás meváltoztatja mind a Km mind a vmax értékét.

IV. Irreverzibilis gátlás

Ebben az esetben az enzim aktív centrumának egy vagy több funkciós csoportja
módosul kovalensen. Az inhibitor nem távolítható el dialízissel vagy a szubsztrát
koncentrációjának növelésével az enzimről. Példa: növényvédőszerekben található
organofoszfát, amely az enzim aktív szerin oldalláncával kovalens foszfátésztert képezve
irreverzibilisen blokkolja az acetilkolin észterázt (AChE) a kolinerg neuronok
posztszinaptikus rostjaiban. Ezzel elsődlegesen a légzőizmok bénulásást idézi elő.

13.
6. Foglalja össze a DNS replikáció jellegzetességeit!

A molekuláris biológia centrális dogmája, hogy a genetikai információ áramlása a

DNS-molekuláktól az RNS-molekulák közvetítésével történik a fehérjék irányába.
(DNS→RNS→fehérje) A DNS replikációnak 3 fő lépése van:

1. Iniciáció a replikációs origóban:

A DNS-szintézise a replikációs origóknak nevezett DNS-szakaszokkal kezdődik. A
másoláshoz először a két szálat el kell választani egymástól egy rövid szakaszon, ami a
replikációs origók közelében kötődő helikáz enzimek feladata. Ezek ATP-hidrolízis mellett
felbontják a hélix H-kötéseit.
Prokariótákban 1 db replikációs origó van, tehát egyetlen helyen indul meg a
replikáció. Jellemzően AT-gazdag területek, ami megkönnyíti a DNS-szálak
szétválasztását. (hiszen köztük csak két H-kötés alakul ki) DnaA kötőhelyeket
tartalmaznak, melyek kötődése további fehérjék kötődését teszi lehetővé, így megindítja a
replikációt.
Eukariótáknál kromoszómánként átlagosan 220 replikációs origó van, tehát
egyidejűleg több helyen indul meg a replikáció, így gyorsabb. A replikáció kezdetének
lépései:
1. G1 fázisban kijelölődik a replikációs origó
2. ORC (origin recognition complex) kötődik a DNS-hez
3. az ORC-hez CDC6 (cell division cycle 6) és CDT1 (chromatin licensing and DNA
replication factor 1) kötődik, melyek elősegítik a 4. lépést
4. legalább két MCM2-7 helikáz (mini-chromosome maintenance) kapcsolódik az
origó közelében a kettős szálú DNS köré, így létrejön a prereplikációs komplex a
G1 fázis elején.
5. helikáz aktivációja: foszforiláció útján a ciklin-ciklindependens kináz (ciklin-CDK)
komplexek az S fázisban aktiválják a prereplikációs komplexeket
Többsejtű eukarióták esetében
- az MCM2-7 mellett további fehérjék komplexéből áll, melyek meghatározott
sorrendben kötődnek, pl. DNS-polimeráz
- nem minden prereplikációs komplex aktiválódik minden sejtosztódásnál, a
fel nem használtak a replikáció áthaladásával ledisszociálnak a DNS-ről

6. az aktív helikázok a késlekedő szálon haladva szétválasztják a DNS két szálát

7. re-replikációs blokk: a ciklin-CDK-komplexek további célfehérjéket foszforilálnak,
ezáltal megakadályozzák azt hogy az eukarióta genom adott régiói többször
replikálódjanak

A helikáz komplex aktivációja több, a replikációhoz szükséges fehérje bekötődését

is lehetővé teszi, melyek együttesen alkotják a replikációs komplexet. A replikációs
komplex mindkét szálat egyidejűleg másolja, ezzel mindkét irányban Y-alakú replikációs
villát eredményez. Minden replikációs origótól két replikációs villa indul, azaz a replikáció
kétirányú. Baktériumokban a replikáció sebessége 1000 bp/s, míg emberben 100 bp/s.
A helikáz előrehaladásával a DNS-hélixek felcsavarodnak, DNS-szuperhélix alakul
ki, ami gátolja a replikációt. Ennek ellazítására szolgálnak a topoizomerázok. Ezen
enzimek időről időre elvágják a DNS-szálakat, majd a szuperhélix letekeredése után
összekapcsolják a szálvégeket. Két csoportjuk van:
• topoizomeráz I.: a DNS egyik láncának reverzibilis hasítását végzi
• topoizomeráz II.: a DNS mindkét láncának reverzibilis hasítását végzi, ATP-függő
- bakteriális megfelelője a giráz, egyes antibiotikumok ezt gátolják
Többsejtű eukariótákban a topoizomerázgátlók megakadályozzák a sejtek
osztódását, így a daganatellenes szerek
14. (citosztatikumok) közé tartoznak.
 2. DNS polimeráz által katalizált szintézis:

A replikációs komplex központi fehérjéi a templátfüggő DNS-polimerázok, melyek

a DNS templát szekvenciája alapján, a komplementer bázispárosodás szabálya szerint az
új DNS-szálat szintetizálják. A DNS-polimerázok között vannak ún. replikatív polimerázok,
melyek az új DNS szintézisét végzik, illetve olyan polimerázok melyek a hibajavításban
vesznek részt. Fontos tulajdonságuk, hogy primerfüggőek, azaz nem képesek a lánc de
novo szintézisére.
Ezért a DNS szintézisét nem a DNS-polimerázok kezdik meg, hanem egy
templátfüggő, de primerfüggetlen RNS-polimeráz, a primáz, ami a DNS-templát alapján
egy rövid, 7-12 nukleotid hosszúságú RNS-primert szintetizál. Az RNS-primert a DNS-
polimeráz-α hosszabbítja meg további kb. 25 nukleotiddal. A primáz-DNS-polimeráz-α-
komplex kötődik a helikázhoz, és azzal együtt mozog a DNS-szál mentén.
A DNS-polimerázok 3’-5’ irányban olvasnak, míg 5’-3’ irányban szintetizálnak.
Ezért az egyik szál, az ún. vezető szál komplementerének szintézise folyamatos, a
szintézist a DNS-polimeráz-α végzi. A másik, ún. késlekedő szálé “ugrásonkén” kb.
150-200 bázispárt lefedve szakaszos, semidiscontinuus, a szintézist a DNS-polimeráz-δ
végzi. A késlekedő szál újonnan szintetizálódott DNS-szakaszait Okazaki-fragmentumok-
nak nevezik. Ezen fragmentumok energiaigényes összekapcsolását a DNS-ligáz végzi,
köztük 3’-5’ foszfodiészter kötéseket hozván létre.

https://www.youtube.com/watch?
v=TNKWgcFPHqw

A szintézishez hozzájárul még a DNS-kapocsnak nevezett fehérjekomplex is, két fő

funkciója van:
1. a replikatív DNS-polimerázt a templát szállal asszociálva tartja
2. a replikatív DNS-polimerázt a 3’-OH véghez irányítja (a vezető szál esetén erre
csak egyszer az elején, a késlekedő szál esetén azonban minden Okazaki-
fragmentum szintézise előtt szükség van)

15.
 3. Terminálás:

Baktériumokban a terminálást a cirkuláris DNS molekulán található terminátor

szekvenciák végzik, valamint őket segítik az ún. Tus-fehérjék is, melyek jellegzetessége
hogy a replikációs villa csak az egyik irányból képes áthaladni rajtuk, a másik irányból
érkezve fennakadnak.
Eukariótákban a terminálás a replikációs buborékok összeolvadásával történik.
Megemlítendő, hogy a késlekedő szál végén az eltávolított hibrid RNS-DNS-primer által
hagyott hézagot a DNS-polimeráz nem tudja betölteni, hiszen nincs szabad 3’-OH véget
nyújtó nukleotid, amit meghosszabbíthatna. Ezért az eukarióta kromoszómák telomerje
(vége) a replikáció során egyre rövidül. A telomerek rövidülése határozza meg a Hayflick-
limitet, mely egy átlagos emberi sejttársulás osztódásainak száma, amíg az meg nem áll.
A telomerek addig rövidülnek, míg el nem érnek egy kritikus hosszt, ami fölött képtelenek
már egy új osztódásra.
Klinikum: A telomer legfőbb funkciója a kromoszómák védelme az
exonukleázoktól, mechanikai sérülésektől és a szomszédos kromoszómákkal való
fúziótól. (a cipőfűző végén levő sapkához hasonlít) Őssejtekre illetve daganatos sejtekre
magas telomeráz aktivitás jellemző. Ez a kromoszómák telomerjét reverz transzkriptáz
aktivitással képes kiegészíteni, így az nem rövidül, a sejt praktikusan végtelen osztódásra
képes. A reverz transzkriptáz aktivitás onnan ered, hogy a telomeráz RNS-templátot
tartalmaz, mellyel az 5’ véget meghosszabbítja, amelyet utána a DNS-polimeráz egészít ki
kétszálúvá.

16.
7. Mutassa be a fő DNS hibajavító rendszereket!

A DNS-ben fellépő hibák lehetőséget nyújtanak a pozitív szelekciós előny

kialakulására, abban az esetben, ha azok olyan változásokat indukálnak, amelyek a
megváltozott körülményekhez való adaptációt segítik elő. Minden más esetben a sejtek
és azok összességének, az organizmusoknak, hátrányuk származik ezekből. Ezért a
sejtek, a kialakult hibákat korrigálni, illetve a hibák kialakulását megelőzni próbálják.

Egy sejt DNS állományát naponta tízezer-egymillió károsodás éri, amelyek nagy
részét a repair mechanizmusok kijavátják. A maradandó DNS károsodásokat mutációknak
nevezzük.
A replikációs hibákon túl, bekövetkezhetnek spontán, továbbá a metabolizmus során
keletkező vagy kívülről bevitt exogén genotoxikus molekulák által kialakuló hibák is. A
szerkezeti változás érintheti pl. csak a bázisokat(pl. depurináció, dezamináció, alkilálódás
stb.) vagy egy- ill. kétszálú DNS-törést is okozhat(pl. sugárzás által)
A DNS szekvencia változatlan megőrzése a cél az organizmus élete és a replikáci során.
Ezt a feladatot több védelmi vonal (mesterséges fogalom, nem hivatalos felosztás, csak a
tételben segít!!!) látja el:

1.védelmi vonal: DNS replikázok önálló repairje

A DNS replikázok a templát szál nukleotidját felismerve kiválsztja az új nukleotidot
a komplementaritás alapján, és az épülő szál utolsó nukleotidjának 3’-OH csoportjához
észterkötéssel hozzákapcsolja az új nukleotidot.
Ha nem megfelelő nukleotid kötődik be, akkor az enzim aktív centruma
kedvezőtlen konformációt vesz fel, ezzel csökken a reakció sebessége, késik az
észterkötés kialakulásának sebessége, így van ideje a ledisszociálni a rossz nukleotidnak
és a jónak kötődnia. (Emlékeztető: a kémiai rekaciók lejátszódása nem egyértlemű,
hanem statisztikai alapokon nyugszik. A megfelelő időben, megfelelő szögben és
megfelelő energiával találkozó molekulák között jön létre az adott átalakulás. Ezt segítik
elő az enzimek, mind a helyes komformáció kialakulásával, mind az energiaszintek
emelésével. A replikázok fent ismertetett mechanizmusa ezek alapján értelmezhető)
Ha mégis beépül egy rossz nukleotid(statisztikai esély van rá!), akkor a torz szerkezetet
érzékeli az enzim és a 3’ végét odahajlítja hibajavító doménjéhez amely 3’-5’ exonukleáz
aktivitású. Az enzim hatására az inkorrekt nukleotid lehasad, majd a DNS vége
visszahajlik az enzim polimeráz doménjéhez.
A hibajavítás 1/ 10 a hetediken nukleotid hibával dolgozik.

2.védelmi vonal: Mismatch repair

A hibás bázispárosodás kijavítását végzi, 1 hiba/ 10 a kilencediken nukleotid rátára
csökkenti a hibalehetőséget.
Eldönti hogy a két ép nukleotid közül melyik az eredeti, ennek érdekében
azonosítania kell az újonnan szintetizált szálat. Az azonosítás történhet, az Okazaki-
fragmentumok közötti még be nem töltött vagy ligálás előtt álló részek alapján, az új
DNS eltérő metiláltásga alapján(emlékeztető: az újonnan szintetizált szál még
hypometilált az eredeti szálhoz képest) vagy az újonnan beépülő hiszton-oktamerek
eltérő kov. módosításai alapján.
Az azonosítás után kivágódik a hibás nukleotid, a hézag(gap) betöltődik és a DNS
végek ligálódnak.

17.
3.védelmi vonal: báziskivágásos javítás(BER)
A BER enzimek a kémiailag módosult bázisokat ismerik fel. Ilyen pl. a depurináció,
amely a az eredeti nukleotid helyén apurint eredményez, így a következő replikáció során
deléciót okoz(leolvashatatlan lesz).
Egy másik eset a citozin deaminációja, amely uracilt eredményez így timin
beépülést eredményezne, a vad típusú(természetes) guanin helyett. Az uracil idegen a
DNS-ben, ezért az enzimek könnyen felismerik. Ez az oka annak, hogy a DNS uracil
mentes, mivel ha nem így lenne, képtelen lenne eldönteni, hogy melyik uracil volt eredeti
és melyik képződött deaminációval(ugyanis a deamináció viszonylag gyakori). Az uracil-
guanin missmatchet egy N-glikozidáz ismeri fel. Glikozidos kötést hasítva a nukleotidban,
levágja a bázist a cukor-foszfátról. A hasítást követően, egy apurin(AP) jön létre
(dezoxiribóz-foszfát) amelyet egy AP-endonukleáz és a javító DNS-polimeráz AP-liáz
eltávolít, majd a létrejött gap-t egy javító DNS-polimeráz (a normál szálat templátként
használva) megszintetizálja a nukleotidot.

4.védelmi vonal: nukleotidkivágásos javítás(NER)

A DNS eltorzult komformációját ismerik fel enzimei, amely több nukleotid kémiai
módosulása miatt keletkezett. Például szomszédos pirimidin bázisok, UV hatására
bekövetkező összekapcsolódását ciklobután gyűrűvé.
Az enzim működése alatt egy 24-36 nukleotid hosszúságú szakaszt kivág,
eltávolítva ezzel a hibás részt, a hiányzó részt pedig a replikatív DNS polimerázok
újraszintetizálják, a végeket a DNS-ligáz kapcsolja össze.

DNS kettős szálú törésének javítása:

1. Nem homológ végek összekapcsolása:

A törés két végén a DNS-t először exonukleázok visszametszik, majd a DNS ligáz
összakapcsolja őket. Ezzel ugyan elveszik jó pár nukleotid, de a törés megszűnik. Csak
abban az esetben működik, ha az eltört fragmentek közel maradtak egymáshoz.

2. Homológ rekombináción alapuló összekapcsolás:

Abban az esetben működik, ha a DNS replikáció már megtörtént, és a
testvérkromatida(normális) jelen van. Ez tehát az S fázis megkettőződött szakaszában,
illetve a G2 során lehetséges. A működésben közös az előzővel, hogy az első lépésben
exonukleázok visszametszik a DNS szálak 5’ végeit, majd ezek az ép testvérkromatid
DNS duplex szálai közé vándorolnak, megkeresik a komplementer szakaszukat és
kialakul a komplementer duplex. 0Ezt követően a törött DNS véget a javító DNS polimeráz
meghosszabbítja a törés végéig.

18.
8. Ismertesse a DNS klónozás fő lépéseit egy orvosi példán keresztül!

A DNS klónozás in vivo technika, amellyel egy adott DNS-fragmentum nagy

mennyiségben előállítható.
Egy kiválasztott DNS-fragmentum, az inszert beklónozható egy olyan DNS-
molekulába, az ún. vektorba, ami aztán élő sejtben szaporodásra képes, és így jön létre a
rekombináns DNS.
A klónozás egyik fontos lépése a kettős szálú DNS-darabok szekvenciaspecifikus
vágása, melyet a restrikciós endonukleázok végeznek. Ezek a kettős szálú DNS-t
szekvenciaspecifikusan két vagy több fragmentumra hasítják. Általában az általuk
felismert szekvencia egy 4-8 bp. hosszúságú palindrom (mindkét irányból olvasva
ugyanaz) szekvencia. A hasítás kétféleképp történhet:
1. mindkét szál ugyanazon helyen hasítódik → tompa vég
2. a hasítás nem egymással szemben történik → ragadós/kohezív vég

A kohezív végeknek kiemelt szerepe van a klónozásban, mivel ha a vektort és az

inszertet ugyanazzal a restrikciós endonukleázzal hasítjuk, akkor lehetségessé válik azok
kohezív végeinek összetapadása, így jön létre a rekombináns DNS. Összekapcsolódásuk
először csak H-kötések révén valósul meg, majd a DNS-ligáz segítségével az 5’-3’-
foszfodiészter kötések is kialakulnak.

A korábbiakban leírt elméleti bevezető után a DNS-klónozás fő lépéseit a

bakteriális (pl. E.coli) plazmid-vektorokon keresztül mutatnám be:

1. Rekombináns vektor létrehozása:

- az idegen DNS-t, az inszertet restrikciós endonukleáz kezeléssel előállítjuk és
izoláljuk, majd a linearizált vektor kompatibilis végződéseivel ligáljuk, így végül
egyetlen rekombináns plazmid gyűrűt kapunk

2. Transzformáció: (a rekombináns plazmid megfelelő gazdasejtbe juttatása)

- a rekombináns plazmid és a kompetens sejtek elegyének alacsony-magas-
alacsony (4-42-4℃) hőmérsékleten történő inkubálását jelenti
- a hatékony transzformálás feltételei:
• megfelelő befogadó szervezet (pl. E.coli)
• replikációra képes hordozóvektor
• a rekombináns plazmidot befogadó sejtek megkülönböztetésére szolgáló
módszer
- hatékonysága fokozható: a gazdasejt CaCl2 oldatban való szuszpendálásával
a DNS hozzáadása előtt

3. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése:

- a hangsúly a szelektív szón van: antibiotikummal kezelve tenyésztik a
baktériumokat, így csak azok élnek túl amelyek már tartalmazzák a
rezisztenciát kialakító gént

4. A rekombináns izolálása és jellemzése:

- lehetséges módszerek:
• plazmid DNS izolálása
• restrikciós enzimmel való emésztés
• agaróz gélelektroforézis
• DNS-szekvenálás
19.
 A plazmidoknak fontos szerepe van a baktériumok antibiotikum-rezisztenciájának
kialakításában. Például: az ampicillin egy antibiotikum, melynek hatásmechanizmusa az,
hogy a baktériumok transzpeptidáz enzimjét gátolja, mely a sejtfalszintézishez szükséges.
Plazmiddal kezelt baktérium esetén a vektor antibiotikum rezisztencia marker génje olyan
fehérjét kódol, ami az antibiotikumot hatástalanítja.

A plazmidok mellett még vektorként szolgálhatnak:

- bakteriofág lambda vagy fág lambda
- kozmid
- élesztő mesterséges kromoszóma (YAC)

20.
9. Ismertesse a PCR technika alapelvét, lépéseit és felhasználási lehetőségeit az
orvostudomány területén!

A polimeráz-láncreakció(polymerase chain reaction, PCR) egyike azon molekuláris

biológiai módszereknek amelyeket széleskörűen használnak az orvostudományban.
Lényege, hogy a humán vagy más sejtekből származó DNS-molekulák tetszőleges
részletét felsokszorozza, ezzel kezelhetővé, felhasználhatóvá, mérhetővé tegye. A
technika egyszerűen kivitelezhető és nem túl költséges, ezért felhasználható rutin
vizsgálatokra.

A PCR elve, hogy a humán genomi DNS 3 milliárd bázispárjából kb. néhány száz
bázispárt felsokszorozunk. A sokszorozni kívánt DNS szakasz kiválasztása rövid, 16-20
bázispár hosszúságú, egyszálú DNS-sel az úgynevezett primerekkel történik. Mivel a
humán gén szekvenciája (vagy általában az előlény DNS-e amit keresünk) ismert,
megfelelő programokkal kiválaszthatjuk a két primert, amely a sokszorozni kívánt DNS-
szakasz két végével komplementer. A primer kiválasztásának feltétele, hogy nem
csatlakozhatnak más DNS szakaszhoz nagy erővel, illetve egymáshoz sem, mivel ez
rontaná a folyamatok menetét, illetve hamis eredményt adna.
A sokszorozást DNS polimeráz végzi, amelynek alapvető tulajdonsága, hogy kettős
szálú DNS-hez kapcsolódva tudják elkezdeni az új szál szintézisét, emellett templát és
primer függőek. Szubsztrátjaik a dezoxinukleotidok. Másik fontos tulajdonságuk, hogy a
primereknek csak a 3’ végét tudják meghosszabbítani. A PCR során hőstabil DNS
polimerázt használunk mivel a ciklusok során 95°C-ra is fel kell melegítani az oldatot, sok
lépéses ciklus során (lásd alább). Ez általában Taq polimeráz, amely egy hőforrásból
származó baktérium polimeráza. (ezért bírja a magas hőt)
A ciklus három lépésből áll: 1) denaturáció 95°C-on melynek során a két szálú DNS
molekula egyszálúvá válik, 2) anneálás, azaz a primerek specifikus kapcsolódása az
egyszálú DNS molekulához végül 3) a primerek meghosszabbítása (polimerizáció) az
alkalmazott DNS polimeráz hőmérsékletén.

A hosszú szálú DNS molekula felmelegítésével majd lehűtésével az egyszálú DNS

molekukának lenne lehetősége renaturálódni, de nagy koncentrációban tartalmazza az
oldat a primereket ezért a hibridizáció a primer és a DNS között történik. A DNS polimeráz
a szétválaszott egyszálú DNS+primer hibridben a primer 3’ végét meghosszabbítja, ezzel
létrejön az első termék ami az eredeti DNS-ből és a primerektől kiinduló új DNS
molekulából áll.
A folyamat 30-40 cikluson keresztül ismétlődik, így a DNS mennyisége
folyamatosan, ciklusonként exponenciálisan nő.
A PCR- alapú technikák alkalmasak lehetnek mutációk vizsgálatára,
szövettenyészetek/sejttelepek fertőzőttségének megállapítására (pl. bakteriális fertőzés)
az idegen DNS felismerésével. (nyilván egy adott virulens DNS-t lehet vele keresni)
További felhasználási területe az apasági tesztek, illetve a DNS-en alapuló
személyazonosítás.
21.
10. Röviden ismertesse az eukarióta génexpresszió lépéseit!

A génexpresszió a genomban tárolt információ alapján a funkcionális fehérje- vagy

RNS-molekula kialakulásáért felelős biokémiai folyamatok összességét jelenti.
Egyszerűbben fogalmazva ez teszi lehetővé, hogy a különböző sejtekben és szövetekben,
időben és térben szabályozottan fejeződjenek ki a szükséges fehérje- és RNS-molekulák.
A molekuláris biológia centrális dogmája: DNS→RNS→fehérje.
A génexpresszió lépései:

1. Transzkripció:
- iniciáció I.: TFIID protein komplex a TBP proteinen keresztül kötődik a TATA-boxhoz
- iniciáció II.: TFIIA, TFIIB is kapcsolódnak a TFIID komplexhez
- iniciáció III.: TFIIE,F,H és J is kapcsolódnak és az RNS-polimeráz II. köt a
promoterhez
- iniciáció IV.: egyéb transzkripciós faktorok kötődnek a DNS-hez és stabilizálják az
RNS-polimeráz II. kapcsolódását
- iniciáció V.: mediátor komplex is kötődik, kialakul a stabil preiniciációs komplex
- iniciáció VI.: az RNS-polimeráz II. foszforilálódik, elhagyja a promotert és
megkezdődik az RNS-szintézis (elongáció)
- pre-elongáció: 25 nukleotid után az RNS-polimeráz II. elakad
- elongáció: új transzkripciós faktor kötődik be, folytatódik a szintézis
- termináció: poliA-farok (kb. 250 adenozin az mRNS 3’ végén)
2. Poszttranszkripciós módosítások:
- hnRNS→mRNS érés: Alternatív splicing
• 5’ capping Ugyanabból a hnRNS-molekulából eltérő
exonok kerülnek a végső, érett mRNS-be.
• splicing: az intronok eltávolítása
• poliadeniláció: poliA-farok keletkezik
- tRNS és rRNS:
• a baktériumokhoz hasonlóan kémiai módosításokat kapnak (pl. metiláció,
deamináció, kén szubsztitúció)
3. RNS degradáció:
- az eukarióta mRNS-ek féléletideje változatos, néhány perctől néhány óráig
terjedhet
- két legfontosabb mechanizmus:
• deadeniláció függő decapping (citoplazmában)
• exoszómás degradáció (citoplazmában és sejtmagban)
4. RNS szállítása
5. Transzláció (lásd: Bevezető kérdések II./13.)
6. Poszttranszlációs fehérjemódosítások (lásd: Bevezető kérdések II./17.)
7. Protein degradáció (lásd: Sejtbiokémia/17.)
22.
11. Foglalja össze az eukarióta mRNS érés főbb folyamatait!

Az eukarióta génekpresszió első lépéseként az adott génszakaszról hnRNS (pre-

mRNS) átírat készül. A transzkripció templát szála a 3’-5’ DNS szakasz, amelyről egy 5’-3’
átirat készül (mondhatjuk, hogy az mRNS az eredeti DNS 5’-3’ szála csak minden egyes
timin helyett uracilt találunk benne). Az mRNS átírat tartalmazza az adott gént (intonokkal
és exonokkal) és az UTR-t. (untransleted region = nem átíródó szakasz).
Az átírás után az mRNS érési folyamaton megy keresztül amely során a 3’ végen
egy poly-A farkat, az 5’Cap-t kap, illetve splicingon esik át. Ezek a módosítások az mRNS
stabilitását biztosítják.
A splicing során a mRNS-ből kivágódnak az intronok, amelyek a splicing irányító
szekvenciái, és az exonok összekapcsolódnak. Az intronok nagy része –GU-val kezdődik
és –AG-vel végződik. Az intronon belül, egy a kivágódásban szerepet játszó adenin
(elágazódási pont) és tőle 3’ irányban többnyire egy polipirimidin régió helyezkedik el. A
splicing főbb faktorai az U1,2,4,5,6 snRNSek, amely fehérjékhez kötődve hozzák létre a
small nuclear ribonucleoproteineket (snRNP-ket). Ezek más fehérjékkel komplexet
alkotnak, ezt nevezzük splicesome-nak. A splicesoma felületén az elágazódási pontban
lévő adenin nukleofil támadást indít az intron 5’ vége ellen, emiatt az 5’ vég elhasad és
5’-2’ foszfodiészterkötés alakul ki az intron 5’ vége és az adenin között. A folyamat
második felében az első exon szabad 3’-OH vége indít nukleofil támadást az intron 3’
vége ellen (3’ splice hely) és megtörténik a második transzészterifikáció, az intron lehasad
és létrehozza a hurok (lariat) formát.
Az 5’ végre már az elongáció alatt felkerül a cap struktúra. A cap-képződést az
mRNS-capping enzim végzi, amelynek trifoszfatáz aktivitása van. Ez lehasítja az 5’ vég
gamma helyzetű foszfátját, majd GTP-ből GMP-t alakít ki, ami 5’-5’-trifoszfát kötéssel
kapcsolódik az 5’ véghez. A kapcsolódó guanozin metilálódik (7-metilguanozin alakul ki),
amely az mRNS magból történő transzlokációjához szükséges.
Az mRNS 3’ végének védelmét a poszttranszlációsan felkerülő poli(a)-farok
biztosítja. Az RNS szintézis során az RNS polimeráz II. áthalad egy poliadenilációs szignál
szekvencián, amely az adenilációs fehérjekomplex felépülését indukálja. Ez a komplex
tartalmaz egy vágást stimuláló faktort (CstF), valamint a vágó és poliadenilációs faktort
(CPF). A komplex elhasítja az RNS-t, majd a poli(A)-polimeráz ATP felhasználása mellett
megszintetizálja a poli(A)-farkat. A poli(A)-polimeráz egy templátfüggetlen, de primer
függő polimeráz, amely az elhasított mRNS 3’ végét használja primerként.

23.
12. Az mRNS kimutatására/mérésére alkalmas technikák

Egyes gének mRNS-ének kimutatására/mérésére a RT-PCR és northern blot

technikák használatosak. Egy adott szövet vagy sejt összes mRNS-ének globális
vizsgálatára a microarray módszere nyújt lehetőséget.

A RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) alapja, hogy a

sejtekből izolált RNS-t átírjuk reverz transzkriptáz enzimmel cDNS-sé, amely a PCR
reakció templátjául szolgálhat. Felsokszorozása után meghatározható, hogy az adott gén
kifejeződik-e vagy nem, valamint a primerek megválasztásával eldönthető melyik splice
variáns fejeződik ki.
A PCR-termék detektálására alkalmas módszerek:
- agaróz gélelektroforézis (interkalálódó festék)
- CCD-kamera (fluoreszcens szignál, ami arányos a keletkező termék
mennyiségével, ez a kvantitatív PCR)

Vegyünk példaként egy gént annak két alternatív splice variánsával:

1. 1-5 exon, 1000 nukleotid
2. 2-8 exon, 1500 nukleotid
Arra vagyunk kíváncsiak, hogy kifejeződik-e az mRNS, illetve hogy melyik splice
variáns expresszálódik a különböző szövetekben. Ennek meghatározására RT-PCR
vizsgálatot végzünk két primer párral, az első primer a 1-2. exonra van tervezve, a
másik primer a 7-8. exonra. Ezt követően a fentebb említett detektálási módszerekkel
az eredmény kiértékelhető.

A northern blot alapja, hogy a sejtekből izolált RNS-t gélelektroforézissel

elválasztjuk méret szerint, majd transzferáljuk/blottoljuk egy membránra, amihez a
detektálni kívánt mRNS-nek megfelelő szekvenciájú, jelölt specifikus oligo/polinukleotidot
hibridizálunk, majd a jelölésnek megfelelően detektáljuk az mRNS jelenlétét vagy hiányát,
meghatározzuk mennyiségét, hosszát. A legérzékenyebb jelölési módszer a radioaktív
jelölés, ekkor a detektálás autoradiográfiával lehetséges.

A microarray -szemben az előző módszerekkel- nem egy mRNS-t tanulmányoz egy

időben, hanem mindet. Egy tárgylemezen egy-egy meghatározott helyen, ún. spot-okban
helyezkednek el az egyes génekre specifikus oligonukleotid vagy cDNS szekvenciák. A
minta mRNS-t megjelöljük és hibridizáljuk a tárgylemezen lévő célszekvenciákhoz. Minél
magasabban fejeződik ki egy adott gén, annál több az mRNS, annál erősebb lesz a jel az
adott gén pozíciójában. Ezt leolvasva, a jelintenzitás arányos lesz az adott mRNS
szintjével.
Jelölésként használhatunk kemilumineszcens vagy fluoreszcens módszereket, a
detektáláshoz a nagy számú transzkript egyidejű vizsgálatából fakadóan scanner és
adatfeldolgozó szoftverek is szükségesek.

24.
13. Az eukarióta transzláció mechanizmusa.

A transzláció során a DNS-ben foglalt genetikai információ alapján, a sejt

megszintetizálja az adott fehérjét. A folyamatban központi szerepet játszik az mRNS, a
tRNS és a riboszóma. Az mRNS-ről itt csak részben, a tRNS-re és a riboszómára
részletsen térünk ki.

I. tRNS:
Az mRNS kodonjai nem képesek az
aminosavakhoz kötődni, ezért a tRNS teremt
kapcsolatot a riboszomális fehérjeszintetizáló
rendszer és az mRNS között. Szerkezete síkban
három levelő lóherére emlékezte, térben „L” alakú.
Felépítésében sok módosított bázis vesz részt, a
módosítások nélküli tRNS lebomlik.
Négy főbb rész van:
a) 3’ CCA vég: ez egy poszttranszkripciós
módosítás, amelyhez az aminosavak kapcsolódnak
b) antikodon hurok: a tRNS három bázisból álló
antikodonját tartalmazza
c) D-hurok: dihidrouridin tartalmú
d) ribotimidin, pszeudouridin, citidin bázisokat
tartalmazó hely, amely a nyagyobbik riboszóma
alegység rRNS-vel lép kapcsolatba

II. Riboszómák:
A riboszómák szupramolekuláris képletek, kis és nagy alegységből állnak(amelyek
további aldoménekből). Alapvázát az rRNS adja, amelyre a további fehérjék épülnek. A
riboszómák ribozimek(enzim aktivitású), mivel peptidil-transzferáz-centrumot
tartalmaznak, ami az aminosavak peptidkötéseit alakítja ki.
A kis- és nagy alegységükön 3-3 kitüntetett helyet találunk, amelyek egymással
ellentétes oldalon helyezkednek el a fehérje harmadlagos szerkezetében(A-A, P-P, E-E)
a) A: amino-acil-tRNS kötő hely; ide kapcsolódnak az aktivált aminosavak a tRNS-el
kapcsolódva
b) P: peptidil-tRNS kötü hely: a növekvő peptidlánc kötődési helye
c) E: exit hely; itt lépnek ki a szabad tRNS-ek a folyamat végén

25.
III. A fehérjeszintézis lépései:

1. Aminosavaktiválás:
A folyamat során az aminosavak, az adott aminosavra specifikus tRNS-hez
kötődnek. A kötődés egy ATP igényes folyamat, amelyben az aminosav karboxil
csoportja kapcsolódik a tRNS 3’ végi ribózának egyik OH csoportjához. Így jön létre
az aminoacil-tRNS komplex. A folyamatot az aminoacil-tRNS-szintetázok katalizálják. A
kémiai reakcióban egy nagy kötési energiájú kapcsolat jön létre, amely energiákja majd a
peptid kötés kialakulásához fog hozzájárulni.
A tRNS-aminoacil-tRNS szintáz nagy specificitással kötődik az aminosavhoz,
szoros kapcsolatot kialakítva. Megfelelő aminosav azonosításhoz nem elegendő az
aminosav-enzim kapcsolat, ezen felül az aminosav specifikus oldalláncait is figyelembe
veszi. A megfelelő tRNS kiválasztása kevésbé specifikusan a tRNS
szekvenciájának(antikodon) azonosításán alapszik. Az egy aminosavat több kodon is
kódol elv alapján, az enzim más antikodonú tRNS-t is választhat, de csak olyat, amely
ugyan azt az aminosavat kódolja!!!
A tRNS-aminoacil szintáz önálló ellenőrző funkcióval rendelkezik amit
proofreadingnek nevezünk. Ez egy olyan mechanizmus, amely során az AMP-aminosav
vagy a már kész aminoacil-tRNS komplex a szintézis helyéről átkerül az enzim hibajavító
helyére ahol a térszerkezetbe nem passzoló/illő aminosav hidrolizál.

26.
2. Iniciáció:
A folyamat második lépésében az mRNS kodonja kapcsolatot létesít a tRNS
antikodonjával. A kapcsolat nem minden bázispár esetében egyforma erősségű. A kodon
első és második bázis, az antikodon harmadik és második bázisával(antiparallel
lefutásúak!!) a Watson-Crick bázispárosodási szabály alapján kapcsolódik. A kodon
harmadik bázisa, az antikodon első bázisával alkotott kapcsolata nem ilyen egyértelmű,
ugyanis itt nem feltétlenül érévnyesül ez a szabály. A kodon első bázisa több más bázissal
tud kapcsolatot létrehozni(lásd táblázat.)
Ezt hívjuk „lötyögésnek”. A lötyögés optimalizálja a fehérjeszintézis sebességét,
mivel a tökéletes kapcsolat lelassítaná a kodon-antikodon disszociációját, ezzel lassítaná
a transzlációt és rontaná a sejt pillanatnyi alkalmazkodásának lehetőségeit.
Az iniciációs lépés során a scanning mechanizmus keresi meg a transzláció START
helyét(AUG szekvencia-metionin), ahová az első aminosav, a metionin kötődik majd.
A 40 S riboszóma alegységgel komplexet alkotó eukarióta iniciációs faktor(eIF) és a
riboszóma P kötőhelyéhez kapcsolódó Met-tRNSi(iniciátor metionint hordozó tRNS)
végzik az AUG szekvencia keresését. Ebben segít az AUG szekvencia környezetében lévő
szekvenciák, legfőképpen a -3-as pozícióban lévő purinbázisok, amelyeket Kozak-
szekvenciaként ismerünk. Az utóbbi két faktor nem állandó részei a riboszómának.
A scanning csak aktivált mRNS-en mehet végbe, ezért ezt megelőzően az mRNS
aktiválódik, cirkuláris szerkezetet vesz fel. Ennek során az 5’ cap struktúráhou az eIF4E
fehérje, a 3’ poly-A farokhoz a PABP(poly-A binding protein) kapcsolódik, amely fehérjék
egy közös „tartó” fehérjéhez kapcsolódva alakítják ki a cirkuláris szerkezetet. Ez a
szerkezet védelmet nyújt az RNázokkal szemben illetve biztosítja, hogy csak az ép
mRNS-ről készüljön átirat(ugyanis a poly-A farok és az 5’ cap érettségi jelek)
Az AUG szekvencia megtalálása után a kodon és a Met-tRNSi antikodon
kapcsolódik és a metionin beépül. Az eIF2 GTP-t hasít GDP-vé és leválik a többi
iniciációs faktorral együtt.

3. Elongáció:
A továbbiakban az mRNS bázissorrendje alapján amino-acil-tRNS komlpexek
kapcsolódnak a riboszóma mRNS komplexhez, növelik a polipeptid lánc hosszát egészen
a STOP kodonig.
Az iniciáció befejeztével a riboszóma P helyén az iniciációban résztvevő Met-tRNS
található, az A hely üres. Első lépésben az A helyre a kodonnak megfeleő antikodonú
amino-acil-tRNS komplex kötődik, továbbá a komplex tovább komlpikálódik () az eEF1-
el(aktivált, GTP kötött formájával) így aminoacil-tRNS-eEF1-GTP komplexről
beszélünk. Második lépésben a riboszómális peptidil-transzferáz peptidkötést hoz létre
az iniciátor metionin karboxilcsoportja és az A helyen lévő aminoacil-tRNS között(annak
aminocsoportja között). Ezt megelőzően az eEF1 GTP-t hidrolizál és leválik a komplexről.
A folyamat nem igényel ATP-t mert a szintézishez kellő energia az aminoacil-tRNS
nagyenergiájú kötésében már előzőleg elraktározódott!! (Emlékeztető: az eEF1-t az AMPK
célpontja, amely foszforilálással gátolja ezt a faktort és ezzel gátolja a fehérjeszintézist.
lásd még: sportbiokémia)
A következő elongációs lépéshez az A helyet fel kell szabadítani, ehhez az
eukarióta elongációs faktor 2(eEF2-szintén G fehérje), transzlokáz kell. Ez a dipeptidil-
tRNS-t a mRNS-el együtt, vigyázva a kodon-antikodon kapcsolatra, 3 nukleotiddal
5’irányba viszi a riboszóma P helyére. Eközben az aminosav nélküli iniciátor tRNS az E
helyre kerül(a késöbbiekben minden tRNS) és egy újabb ciklus veszi kezdetét. Fontos,
hogy az elongáció az N-terminális felől a C-terminális felé történik(abból az okból
kifolyólag, hogy a bekötődő aminosav C terminálisának karboxil csoportja a tRNS-hez
kapcsolódik, így az N terminális tud bekötődni)
27.
4. Termináció és a riboszóma reciklizációja:
A fehérjeszintézis végét a terminációs kodonok jelzik. A nem kódoló
tripletekhez(UAG, UAA), amelyeket nonszensz kodonoknak is nevezünk, nem
kapcsolódnak tRNS-ek, csak terminációs/releae faktorok. Eukariótákban az eRF1 ismeri
fele ezeket a kodonokat. Ez a faktor GTP kötött formában a felismerés után a riboszóma
A helyére kötődik a terminációs kodonokhoz és aktiválja a riboszóma peptidil-
transzferázát, ami most a peptid láncot hidroláz aktivitásán(második aktivitás) keresztül
„vízre rakja”(OH- csoporttal látja el). Az utolsó tRNS az E helyre kerül és onnan szabadul
fel.

28.
14. Röviden mutassa be a Western-blot módszert, térjen ki az SDS poliakrilamid-
gél-elektroforézis elvére is!

A génről átírt mRNS mennyisége nem feltétélenül arányos a keletkezett fehérje

mennyiségével, ezért a sikeres génexpresszió igazolásához a keletkezett fehérje
mennyiségi mérése szükséges. Erre alkalmas a Western-blot technika, melynek lépései:

1. A fehérjekeverék elválasztása SDS-tartalmú poliakrilamid gélen (SDS-PAGE):

Az SDS PAGE fehérjék elválasztására használt módszer, csakhogy itt a fehérjéket
denaturált állapotukban vándoroltatjuk. A hagyományos (natív) akrilamid gélelektroforézis
során a szeparáció a fehérjék töltésétől, alakjától és méretétől függ, de nem alkalmas pl.
fehérje molekulatömeg meghatározásra és arra sem ad választ, hogy egy már tisztított
mintában lévő fehérje több alegységes-e, hiszen natív körülmények között az alegységek
együtt maradnak. Ezen kérdések megválaszolására a poliakrilamid gél elektroforetikus
technikák leginkább elterjedt válfaja, az SDS poliakrilamid gélelektroforézis bizonyult
alkalmasnak.
Az SDS (sodium-dodecyl-sulphate) egy anionos detergens. Ha a fehérjemintát
SDS-sel és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezeljük magas
hőmérsékleten, a fehérjék denaturálódnak és mivel az SDS anionos detergens, a
fehérjéket negatív töltésekkel látja el.
A kötődött SDS mennyisége nagyjából független a polipeptidlánc szekvenciájától,
ellenben egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével.
Ebből következik: az SDS kezelés után az összes fehérje relatív töltése nagyjából azonos
lesz, alakjuk is hasonlóvá válik, így csak méretük szerint lesznek elválaszthatóak. Mivel a
molekulaméret arányos a molekulatömeggel, az SDS poliakrilamid gélelektroforézis végső
soron molekulatömeg szerint szeparál.
Ez a legelterjedtebb, legolcsóbb módszer a fehérjék alegység molekulatömegének
viszonylag pontos meghatározására. A tapasztalat szerint a fehérje relatív mobilitása (a
fehérje futási távolsága osztva a jelzőfesték futási távolságával) a fehérje molekulatömeg
logaritmusának függvényében monoton csökken.
Az SDS poliakrilamid gél elektroforézis a leginkább elfogadott módszer annak
eldöntésére, hogy egy fehérje, ill. enzimpreparátum homogén-e.

2. Blottolás: a fehérjéket technikai okok miatt átvisszük a poliakrilamid gélről egy

fizikailag tartósabb felszínre (pl. nitrocellulóz) úgy, hogy az elektromos térben
történt vándorlási távolságok ne változzanak

3. Elsődleges antitest bevitele: a kimutatandó fehérje antigénként fog viselkedni, így

erős kötés alakul ki ki az elsődleges antitest és a célfehérje között

4. Membrán mosása: az elsődleges antitest a többi fehérjéhez csak lazán kötődött,

így mosással eltávolítjuk

5. Másodlagos antitest bevitele: az elsődleges antitestekhez kötődnek a másodlagos

antitestek, melyekhez rendszerint egy enzim kapcsolt

6. Az enzim szubsztrátjainak hozzáadása: hozzáadás után fényreakció jelzi a

kimutatandó fehérje helyét, mely a membránra rakott filmen sötétedést okoz

29.
15. Antitestek alkalmazásán alapuló technikák az orvosi utatásban.

A specifikus antitestek előállítása lehetővé tette a fehérjék affinitás-

kromatográfiávaal és immunkicsapással történő tisztitását. Ezen antitestek szintén
alkalmazhatóak a fehérjék azonosítására immunoblottal (Western blot) és sejten belüli
lokalizációjuk meghatározására immunhisztokémiai eljárással.
Az antitest molekulákat 5 fő csoportba osztályba soroljuk (IgA, IgD, IgE, IgG és
IgM) amelyek az immunizáció során különböző időben és különböző mértékben jelennek
meg. Az immunglobulinok 2 alegységből álló tetramer molekulák, 2 nehéz és 2 könnyű
láncot tartalmaznak, amelyek diszulfid-hidak kötnek össze. Mind a nehéz, mind a könnyű
láncban található aminosavak hozzájárulnak az antigén kötőhely kialakulásához. Bivalens
molekulák, amelyeknek két antigénkötő doménjük van.

Az eljárásokhoz használatos antitesteket különböző tenyészállatokban termeltetik

meg a kutatók. Az adott állat immunrendszere képes bármely, a szervezet számára
idegen anyag ellen antitesteket termelni, de nem minden anyag vált ki immunválaszt.
Azokat az anyagokat amelyek immunválaszt váltanak ki immonogéneknek, azt az anyagot
amelyhez antitest kötődni képes, antigénnek nevezzük. Ha egy antigén a véráramba kerül,
az antigénre specifikus antitest néhány nap múlva szintén megjelenik a véráramban. Az
antigén termeltetés alapján két fő csoportot különböztetünk meg.
A poliklonális antitest előállításról akkor beszélünk, amikor nagyobb mennyiségű
tiszta antigén áll rendelkezésre, amellyel nagy affinitású, specifikus antitesteket állíthatunk
elő többszöri immunizálással. Az immunválasz során a B sejtek aktiválódnak, amelyek
számos, az antigénre specifikus antitestet termelnek. A képződött poliklonális antitestek

30.
nagyszámú, eltérő epitópra (rövid peptidszakasz az entigénen, ahová az antitest
kapcsolódik) specifikus antitestek elegyének tekinthetők.
A monoklonális antitesteket akkor nyerünk, ha a megfelelő mennyiségű antitesetet
termelő egerek lépét eltávolítjuk, és az azokból izolált B sejteket, B sejt eredetű mieloma
sejtekkel fuzionálva az egyes epitopokra specifikus antitesteket szekretáló immortális
hibridóma sejteket hozunk létre. A monoklonális antitestek rövid peptidszakaszokra
specifikusak, emiatt pozitív eredményt adhat egy-egy vizsgálat, amelyben a keresett
fehérje nincs jelen, viszont egy másik, amelynek bizonyos peptidszakasza homológ a
keresett fehérjéével. Az immunizálás ebben az esetben is jár poliklonális antitest
termeléssel, amely a szérumból mutatható ki.
Immunológiai vizsgálatokban az alapelv az antigén-antitest kapcsolódás. Az
antigének detektálásához jelöléssel ellátott primer(elsődleges) vagy
szekunder(másodlagos) antitesteket használnak. Az antitestekhez enzimek is
kapcsolhatók, amelyek színváltozást, ill. kemilumineszenciát eredményező reakciót
katalizálnak, jelezve az antigén-antitest kölcsönhatás helyét és mértékét. Az indirekt
jelölés során az antitestre kapcsolják a jelző molekulát vagy struktúrát, míg az indirekt
jelölés során, az antitestre termeltetett antitestre rakják ezeket(az antigénre termeltetett
antitestet újra egy állatba juttatják amire szintén antitestek termelődnek, és ezt jelölik
meg). Az indirekt módszer előnye, hogy egy primer antitesthez több szekunder antitest is
kapcsolódhat, ezzel felsokszorozódhat a mérés erőssége, viszont a pontosságból veszít a
rendszer.

ELISA:
Az enzimmel való kapcsoláson alapuló immunadszorpciós eljárás(ELISA), az oldható
antigének és antitestek vizsgálatának leggyakrabban alkalmazott módszerévé vált. A
módszer lényegét az ábra szemlélteti.

Immunoblot/Western blot: lásd 14. tétel

31.
16. Mi a rekombináns fehérje? Ismertesse a rekombináns fehérjék felhasználási
lehetőségeit!

Klónozott gének segítségével olyan expressziós vektorok állíthatók elő, melyek

segítségével baktériumban vagy eukarióta sejtben egy adott fehérje előállítható. Az ily
módon szintetizált fehérjéket rekombináns fehérjének nevezik.

A bakteriális expressziós vektor szerkezeti elemei:

- replikációs origó
- szelekciós marker (antibiotikum rezisztencia)
- többszörös klónozó hely
- transzkripciós promóter és -terminátor
- riboszóma kötőhely (Shine-Dalgrano)
- a célfehérje szabályozott expressziója
- fúziós tag, proteáz hasítási hely (nélkülözhető)

Az emlős expressziós vektor szerkezeti elemei:

- promóter
- szelekciós markerek
- poliadenilációs/terminációs szignál
- intron (nélkülözhető)
- eukarióta replikon (pl. ori; nélkülözhető)

A rekombináns fehérje expresszió felhasználási lehetőségei:

1. gén azonosítása, DNS és kódolt fehérje közötti kapcsolat igazolása
2. adott fehérje funkciójának, más fehérjékkel való kölcsönhatásának
tanulmányozása
3. antitest termeltetés
4. szerkezeti vizsgálatok (röntgen krisztallográfia, NMR)
5. irányított mutagenezissel egyes aminosavak, domének szerepének
tanulmányozása egy adott fehérjében
6. gén regulációs elemek vizsgálata
7. fehérjék előállítása nagy mennyiségben orvosi, ipari, mezőgazdasági
felhasználásra

32.
17. Poszttranszlációs módosítások és jelentőségük.

A fehérjeszintézis során a szintetizált polipeptidlánc biológiai aktivitással redelkező

konformációja fokozatosan alakul ki. A legtöbb fehérje esetében az aktív forma
poszttranszlációs módosításokkal érhető el. Az alábbiakban ismertetésre kerülnek a
módosítások fő típusai:

1. Amino- és karboxi-terminális aminosavak módosításai

A de novo fehérjeszintézis során a polipeptidlánc első aminosav maradéka az N-
terminális metionin. Viszont ez a sejt fehérjéinek jelentős részében már nem található
meg, mert az amino-terminális metionin maradék, illetve más amino- és karboxi-terminális
aminosav kihasítódhat. A fehérje új N-terminálisába lépő aminosav módosulhat pl.
acetilálódhat.

2. Szignálpeptidek eltávolítása
A riboszómán keletkezett új fehérjék, működési helyükre kerülésük érdekében,
szignál peptideket kapnak, amelyek pl. a magba vagy az extracelluláris térbe való
transzporthoz elengethetetlenek. Ezeket egy specifikus proteáz enzim lehasítja, a
posztszintetikus módosítás során.

3. Aminosav oldalláncok módosításának lehetőségei

A Ser, Thr és a Tyr maradékok hidroxilcsoportjai Mg-ATP jelenlétében
enzimatikusan foszforilálódhatnak. Ez egy reverzibilis folyamat amely során negatív
töltésű foszforil csoport kerül a polipeptidláncra. Ez a legtöbb esetben biológiai aktivitás
változással jár pl. anyagcsere útvonalakban, gén transzkripcióban, ionok és metabolitok
membrántranszportjában, stb. A reverzibilis defoszforilációt protein-foszfatázok végzik.
A tirozin-specifikus kinázok és foszfatázok gyakran transzmembrán fehérjék,
amelyek az extracelluláris jelek továbbításában vesznek részt.

4. Proteolízis
Irreverzibilis poszttranszlációs módosítás, amely az erre a feladatra specializált
enzimek, a proteázok segítségével megy végbe. Ennek fontos jellegzetessége, hogy a
sejten kívül is végbemehet, mert nem igényel ATP-t. A peptidázokat két fő csoportra
osztjuk. Exopeptidázokra, amelyek a fehérjék és a peptidek N- és C-terminálisa
közelében hasítanak(pl. aminopeptidázok- az N-terminális aminosavat hasítják) és
endopeptidázokra, amelyek a peptidekben és a fehérjékben belső peptidkötéseket
bontanak(pl. szerint endopeptidázok-tripszin, kimotripszin, elasztáz)
Példák:
• Proteolitízisen mennek keresztül az emésztőenzimek a pankreászban, amelyek a
vékonybélbe való szekretálódásuk után proteolitikusan aktiválódnak.
• A véralvadásban a proteáz proenzim alvadási faktorok egymást követő aktiválásával
valósul meg egy erősítési folyamat, mely utolsó lépéseként az oldható fibrinogén
oldhatatlan fibrinné alakul.
• A kollagén oldható prokollagén formában szintetizálódik és szekretálódik. Az
extracelluláris térben prokollagén peptidáz hasítja le róla a propeptid szakaszokat.

5. Glikoziláció
A glikoziláció során több, enzimkatalizált lépésben cukoregységek kapcsolódnak a
-főleg a plazmamembránba vagy szekrécióra kerülő- fehérjékhez. Két fő típusa az N-és
O-glikoziláció. Az N-glikolizációban a fehérje aszparagil oldalláncához kapcsolódnak
cukor egységek.
33.
 Az O-glikolizilációban a szeril, treonil, hidroxizil oldalláncok hidroxilcsoportjának
oxigénjéhez kapcsolódik a cukor egység.
A glikoziláció az endoplazmás retikulum membránjában és a Golgi apparátusban
zajlik.
A fehérjék ilyen módosítása:
• Fokozza az oldhatóságot, növeli a rezisztenciát a proteázokkal szemben.
• Sejtfelszíni kötésük az oligoszacharidok nagyobb térigénye és merevebb
térszerkezete miatt növeli a fehérjék hőstabilitását.
• A sejtfelszíni markererek is glikozilációs mintázatok, ami alapján az immunrendszer
megkülönbözteti az idegen és a saját sejteket. (pl. vércsoportok vagy a natív
immunrendszer működése)

34.