KIỂM NGHIỆM KIM LOẠI NẶNG

Không được quá 0,1 phần triệu (Phụ lục 9.4.8).

Cách tiến hành kiểm nghiệm như sau:
 Cho vào cốc thủy tinh 200 ml chế phẩm, thêm 0,15 ml dung dịch acid nitric 0.1M.
Cho vào bình cách thủy để bốc hơi đến khi còn 20ml dung dịch.
 Lấy ra 12 ml dung dịch trên để thử kim loại nặng theo phương pháp 1.
 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu chì gồm: 10 ml dung dịch Pb mẫu 1 phần triệu và
0,075 ml dung dịch acid nitric 0,1 M
 Dung dịch mẫu trắng: 10 ml nước và 0.075 ml acid nitric 0.1M
Kết quả nước tinh khiết đạt yêu cầu về kim loại nặng nếu như màu nâu của chế phẩm thử
(nếu có) phải nhạt hơn của dung dịch đối chiếu.
LƯU Ý: Nếu nước tinh khiết nguyên liệu đáp ứng yêu cầu về độ dẫn điện trong chuyên
luận “Nước để pha thuốc tiêm” thì không cần thiết phải tiến hành phép thử kim loại nặng.

PHÉP THỬ NỘI ĐỘC TỐ VI KHUẨN

Căn cứ Dược điển Việt nam 5 – Tập 2 (Phụ lục 13 – 13.2)
Ứng dụng: phát hiện, định lượng nội độc tố vi khuẩn Gram (-)
Các phương pháp (3):
1. Phương pháp tạo gel (Thuốc thử + dung dịch nội độc tố => Tạo gel)
2. Phương pháp đo độ đục (Tạo gel => thay đổi độ đục thuốc thử lysat)
3. Phương pháp đo màu (Thay đổi màu phức hợp màu – peptid)

I. PHƯƠNG PHÁP TẠO GEL

Ứng dụng: phát hiện, xác định nội độc tố
Nguyên lý: Thuốc thử lysat + nội độc tố => Tạo gel
*Lưu ý: Nồng độ độc tố để tạo gel với thuốc thử lysat = Độ nhạy của lysat (xem trên
nhãn sản phẩm) => Phải làm Phép thử kiểm tra (khẳng định độ nhạy trên nhãn) + Kiểm
tra yếu tố ảnh hưởng => Đảm đảm độ chính xác và giá trị của Phương Pháp Tạo Gel.

II. PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG:

1. Phương pháp đo độ đục:
Nguyên lý: xác định lượng nội độc tố dựa trên thay đổi độc đục của thuốc thử lysat (do
tạo gel)
2 kĩ thuật đo: đo tại điểm dừng, đo độ đục động học
- Đo điểm dừng: đo độ đục tại thời điểm xác định cuối giai đoạn ủ
- Đo động học: đo tương quan nồng độ độc tố và thời gian cần để => Đạt độ đục
định trước/Tốc độ tăng độ đục
Điều kiện 37 ± 1oC. Độ đục thể hiện qua thông số Độ hấp thụ/Độ truyền qua
2. Phương pháp đo màu:
Nguyên lý: Nội độc tố + Thuốc thử lysat => Cơ chất mang màu giải phóng màu => Nồng
độ nội độc tố
2 kỹ thuật đo: đo tại điểm dừng, đo màu động học
- Đo điểm dừng: dựa trên tương quan nồng độ nội độc tố và độ đậm của màu (cuối
giai đoạn ủ)
- Đo màu động học: đo tương quan nồng độ độc tố và thời gian cần để => Đạt độ
hấp thụ/độ truyền qua định trước hoặc Tốc độ tăng màu của hỗn hợp
Điều kiện 37 ± 1oC
Quy trình thực hiện:
- Kiểm tra đường chuẩn
- Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng
- Xác định lượng nội độc tố trong mẫu thử
2.1. Kiểm tra đường chuẩn:
*Thực hiện với mỗi lô thuốc thử lysat mới/khi có thay đổi điều kiện mà có thể ảnh hưởng
kết quả.
Dựa trên hướng dẫn ghi trên sản phẩm thuốc thử lysat:
- Pha (ít nhất) 3 nồng độ nội độc tố khác nhau => Tạo được đường chuẩn
- Mỗi nồng độ ít nhất 3 ống nghiệm (về tỷ lệ thể tích, thời gian ủ, nhiệt độ, pH,…)
- Tính toán (Tiêu chuẩn: Hệ số tương quan r ≥ 0,98 đối với khoảng nồng độ đã pha)
2.2. Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng:
Chuẩn bị 4 dung dịch A, B, C, D theo bảng sau => Chuẩn hóa điều kiện (thể tích, tỷ lệ thể
tích dung dịch thử - thuốc thử lysat, thời gian ủ) => Tiến hành phép thử

Dung dịch được Số ống nghiệm/

Dung dịch Nồng độ nội độc tố
thêm nội độc tố Lỗ phản ứng
A 0 Dung dịch thử ≥2
 Khoảng giữa đường cong
B Dung dịch thử ≥2
chuẩn
C Ít nhất 3 nồng độ Nước BET Mỗi nồng độ ≥ 2
D 0 Nước BET ≥2

Tiêu chuẩn:

 Đường chuẩn của dung dịch C: Hệ số tương quan r ≥ 0,98

 Dung dịch D: không vượt quá giá trị trắng (theo quy định của thuốc thử đang dùng)
 Lượng nội độc tố tìm lại được (lấy B – A) từ 50 – 200%
 Kết luận: Dung dịch mẫu cần kiểm tra KHÔNG có yếu tố ảnh hưởng
2.3. Xác định lượng nội độc tố trong mẫu thử:
Chuẩn bị 4 dung dịch A, B, C, D theo bảng sau => Chuẩn hóa điều kiện (thể tích, tỷ lệ thể
tích dung dịch thử - thuốc thử lysat, thời gian ủ) => Tiến hành phép thử

Dung dịch được Số ống nghiệm/

Dung dịch Nồng độ nội độc tố
thêm nội độc tố Lỗ phản ứng
A 0 Dung dịch thử ≥2
Khoảng giữa đường cong
B Dung dịch thử ≥2
chuẩn
C Ít nhất 3 nồng độ Nước BET Mỗi nồng độ ≥ 2
D 0 Nước BET ≥2

Tính toán nồng độ nội độc tố của A dựa theo đường chuẩn từ C
Tiêu chuẩn:
 Đường chuẩn của dung dịch C: Hệ số tương quan r ≥ 0,98
 Lượng nội độc tố tìm lại được (lấy B – A) từ 50 – 200%
 Dung dịch D: không vượt quá giá trị trắng (theo quy định của thuốc thử đang dùng)
 Kết luận: Khi nồng độ nội độc tố tính được của A < giới hạn được quy định trong
chuyên lận => ĐẠT phép thử nội độc tố