Problemes de cinètica enzimàtica

1. ¿Quina o quines diferències hi ha entre “complex activat” i “complex enzim-substrat”?

¿Quines interaccions es donen en aquests complexes?

2. Calcula l’increment de la velocitat d’una reacció a 25 oC si ΔG del complex activat sense

l’enzim és -1 KJmol-1 i ΔG es redueix a la meitat quan la reacció es fa enzimàticament.

3. Un enzim que segueix la cinètica de Michaelis-menten mostra la següent cinètica en absència

de qualsevol inhibidor.

Dibuixeu la representació de
Lineweaver-Burk que li
correspondria i proposeu una
possible explicació per aquesta
cinètica.

4. A la ruta hidrolítica per preparar un additiu d’aliments (A ↔ B ↔ C ↔ D) tots els

substrats i productes que intervenen es troben a la mateixa concentració (10-4 M) i els
enzims tenen les KM que es mostren a continuació:
EA KM = 10-2 M i catalitza el pas de A a B
EB KM = 10-4 M i catalitza el pas de B a C
EC KM = 10-4 M i catalitza el pas de C a D

¿Quin i per què serà el pas determinat de la reacció? ¿Quines són les velocitats de cada pas?

5. S’examina l’efecte del pH sobre l’activitat d’un enzim i se sap que al seu CA té un grup
ionitzable ( pK = 6.0) i que cal que estigui carregat negativament per catalitzar la reacció. El
substrat està carregat positivament en tot l’interval de pH de l’experiment.

E- + S+ ↔ [E-─S+] → E- + P+
+
H+
↕
EH

Dibuixeu la corba de Vo en front al pH quan [S]>> KM

Dibuixeu la corba de Vo en front del pH quan [S]<<KM
¿A quin pH la velocitat serà igual a la meitat de la VMax en aquestes condicions?
6. Per una isomerasa que intervé en l’obtenció d’un edulcorant s’han trobat els següents
resultats:
mM [S] 0.00125 0.01 0.04 0.10 2.00 10.00
mM/min Vo 14 35 56 66 69 70
Troba els seus paràmetres cinètics (VMax i KM)

7. Un enzim que segueix la cinètica de Michaelis-Menten té una KM de 1µM. A [S] = 100 µM té

una Vo = 0.1 µM/min. ¿Quina és la seva Vo si [S]= 1 mM, 1 µM o 2 µM?

8. L’enzim invertasa (EC. 3.2.1.26, β-fructofuranosidasa o també sacarasa) catalitza la hidròlisi

de la sacarosa a glucosa i fructosa trencant l’enllaç β-fructofuranosil. La KM per la sacarosa és
0.5 mM i la Kcat és 175 min-1. Si la [sacarosa] és 0.25mM, amb una [sacarasa] de 25 pmolar,
quina velocitat de la catàlisi s’observarà i quin % de la Vmàx és? ¿Quanta sacarosa hem
d’afegir per arribar al 95% de la VMàx? ¿Quina importància pot tenir a nivell industrial aquest
fet?

9. Per una fructoquinasa de la glicòlisi s’obtenen els següents resultats, amb i sense inhibidor

V (mM/min)

[S] (mM) [I]=0 mM [I]=40 mM [I]=150 mM [I]=300 mM [I]=800 mM

10 1.11 0.81 0.64 0.57 0.52
20 1.52 1.27 1.12 1.00 0.91
40 2.31 1.96 1.61 1.55 1.37
60 2.75 2.41 2.00 1.97 1.86
80 2.80 2.48 2.21 2.05 2.06
100 2.92 2.72 2.52 2.44 2.33
160 3.11 2.96 2.82 2.62 2.67
220 3.22 3.11 2.96 2.94 2.87

Calcula els paràmetres cinètics i troba el tipus d’inhibició.

10. Per una proteasa es va trobar una velocitat de reacció de 20 μg/min per una [S] de 3mM. Si
la [S] ≥ 7 mM la velocitat de reacció no supera els 40 μg/min. A l’afegir un inhibidor competitiu
la velocitat de la reacció va ser 20 μg/min per [S]=8mM. Calcul la KM, VMàx i KI si [I]=6mM
 11. S’ha purificat succinat deshidrogenasa (EC. 1.3.99.1) d’E. Coli. Per poder-la comercialitzar
s’han de determinar experimentalment les constants cinètiques, i per fer-ho es mesura la
velocitat de transformació de succinat a fumarat a diferents concentracions inicials de
succinat:

[succinat] mM velocitat inicial (nM/min)

1.0·10-5 16.0
2.5·10-5 30.8
8.0·10-5 53.4

Calculeu KM i VMàx
Si [enzim] =0.04 nM quina serà la Kcat (o K2) de l’enzim?
Quin és el significat de Kcat?
Expressa l’activitat enzimàtica en Unitats Internacionals si el volum de la reacció és 1 mL.

12. Per la catàlisi d’una ureasa obtenim les següents velocitats de reacció, en mM/min:

[S] (mM) [I] =0 [I]=10 mM

1.25 1.72 0.98
1.67 2.04 1.17
2.50 2.63 1.47
5.00 3.33 1.96
10.00 4.17 2.38

Calculeu VMax i KM amb i sense inhibidor. Calculeu Ki i digueu de quin tipus d’inhibició es tracta.

13. Per estudiar el CA d’un enzim es fan una sèrie de mutacions i es mesuren els paràmetres
cinètics:

Enzim KM (M) VMax (M/S)

Salvatge 3.2x10-5 760
MUT 1 Val 150 →Ala 3.2x10-5 750
MUT 2 Asn74 → Leu 6.0x10-5 350
MUT 3 Ser 43 → Thr 3.4x10-5 200
MUT 4 Val 150 → His 4.0x10-4 735
MUT 5 Ser 43 → Gly 3.6x10-5 0.05

¿Quin mutant té l’afinitat més elevada?

¿Quin mutant té l’activitat catalítica més elevada?
¿Quin aminoàcid participa directament en la reacció catalítica?

14. Una reacció enzimàtica de la hexoquinasa amb un inhibidor competitiu ([I]=3.7x10-4 M) té una
velocitat de reacció quan la [S] és de 1.5x10-3 M igual a la velocitat de reacció sense inhibidor
a una [S]=7.69x10-5 M. Calculeu la KI .
15. La α-quimotripsina catalitza la hidròlisi de la N-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida (GPNA).
Per aquesta hidròlisi obtenim els següents paràmetres cinètics, a una [Eo]=4.0x10-6 M.

[GPNA]/10-4 (M) V mmolL-1min-1

2.50 2.11
5.00 3.73
10.0 5.90
15.0 7.10

Calculeu VMax, KM i el número de recanvi

16. Per un determinat enzim tenim les següents velocitats de reacció, en presència de dos
inhibidors diferents:

[S] (mM) [I] =0 I1 mM I2 mM

1 2.5 1.17 0.77
2 4.0 2.10 1.25
5 6.3 4.0 2.0
10 7.6 5.7 2.5
20 9.0 7.2 2.86

Digueu el tipus d’inhibició i si la [I1] és més gran o petita que la [I2].

17. A partir de les següents dades d’una reacció enzimàtica, determineu de quina manera actua
l’inhibidor.

[S] mM µg producte/h µg producte/h

([I]=0) ([I]=6 mM)

2 139 88

3 179 121

4 213 149

10 313 257

15 370 313

18. La KM per l’etanol de l’enzim alcohol deshidrogenasa de llevat és 1.3x10 -2 M. Si la

concentració de alcohol en el medi de reacció és 59.8 µg/ml, ¿Quina proporció d’enzim
estarà lliure i quina estarà lligada amb el substrat?
19. Les velocitats inicials a diferents concentracions de substrat per a la reacció enzimàtica de la
ureasa són: CO(NH2)2+H2O ↔ CO2+2NH2

[S] (mols/l) V (µmols/min)

5x10-2 0.25

5x10-3 0.25

5x10-4 0.25

5x10-5 0.20

5x10-6 0.071
5x10-7 0.0096

¿Quina és la VMax de la reacció?

¿Per què la velocitat inicial és constant a una [S] més gran de 5x10-4 M

¿Quina és la concentració d’enzim lliure per una [S] de 5x10-4 M?

¿Quina és la KM de l’enzim?

Calculeu la velocitat inicial si [S]=1x10-6 M i [S]=1x10-1 M.

Calculeu la concentració de producte que es forma durant els 5 primers minuts de la reacció amb
10 ml de una dissolució de substrat igual a 2x10-3 M.

20. A partir de l’equació de Michaelis-Menten troba una funció que relacioni el temps amb la
concentració de substrat a qualsevol temps. ¿Com queda aquesta expressió quan [So]>>KM?
¿Quina és la forma d’aquesta equació si [So]<<KM?

21. Un determinat enzim hidrolitza un substrat neutre y no es veu afectada aquesta activitat en
un ampli rang de pH (entre 6 i 8). SI que mostra activitat en un interval més estret de pH quan
el substrat te un grup imidazol. Es fan 30 assaigs a 10 concentracions diferents de substrat a
una concentració fixa d’enzim a 5 valors diferents de pH. A cada valor de pH l’enzim dona
gràfiques lineals de Lineweaver-Burk, y les estimacions de les KM i V màx són:

pH KM (mmol·L-1) (±0.01) Vmàx (µmol·L-1·min-1) (±0.03)

8.0 1.10 80.01
7.5 1.30 80.02
7.0 2.00 79.98
6.5 4.20 80.01
6.0 11.00 79.99

a) Descriu l’efecte de la variació del pH sobre Vmàx i KM.

 b) ¿Què implica que amb un substrat no carregat quasi no es vegi canvi de l’activitat a
valors de pH entre 6 i 8?
c) Proposa un esquema de la reacció que sigui coherent amb els resultats.
d) Calcula la constant de protonació del substrat.

22. Un enzim mutat s’uneix a un substrat amb una força 100 vegades més gran que la de l’enzim
no mutat. ¿Quin és l’efecte d’aquesta mutació sobre la velocitat catalítica de l’enzim si la unió
de l’estat de transició no es veu afectada? ¿Com varia l’energia d’activació de la reacció
respecte a l’enzim no mutat?

23. A partir de l’equació de Michaelis-Menten troba la representació de Eadie-Hofstee.

a) Troba la intersecció amb l’eix “Y”, amb l’eix “X” i el pendent.

b) Dibuixa de forma esquemàtica la gràfica de l’activitat enzimàtica amb i sense inhibidor
utilitzant aquesta representació.