Мартищенко Д.Ю.

11202 НМУ Богомольца

Pneumocystis jirovecii
Pneumocystis jirovecii (Pneumocystis carinii в минулому) - Це
мікроскопічний гриб, який проникає в легені та викликає
пневмонію, зокрема у людей зі схильністю до імунодефіциту,
пацієнтів після трансплантації внутрішніх органів, тих, що
отримують хіміотерапію або страждають від вроджених вад.
Незважаючи на те, що P. jirovecii розглядається як патогенний гриб,
його надзвичайно важко лікувати стандартними протигрибковими
засобами.
Морфологія Pneumocystis радикально змінюється під час утворення
біоплівки. (А) P. carinii з надлишкового розчину 3-денного
стандартного короткотермінованого культурного методу,
розфарбованого Hema3, що ілюструє відмінності в морфології
структур біоплівки. (Б-Г) Зображення взяті з 16-денної біоплівки,
що відбулася з P. murina (одержаної як свіжий ізольований штам).
Зображення були отримані з плівок на вставках, які були почищені
за допомогою наконечника піпетки, аспіровані, висушені повітрям і
розфарбовані Hema3, швидким фарбуванням за методом Врайта-
Гімзи. Зображення переглядалися під масляним зануренням.
Смужки, 10 мкм. (Б) Кластер P. murina, що показує структуру,
схожу на цисту, з ніжкою (стрілка). (В) Аскус в ланцюгу з
внутрішньоцистичними формами. (Д) Відбивний кластер, який
починає утворювати відростки (стрілка). (Е) Два великих кластери,
які утворюють ланку або місток (стрілка). (Ф) Серія структур,
схожих на цисти, що утворюють ланцюг (стрілки). (Г) Циста, що
містить структуру, яка, схоже, є трофічними формами, що
проходять бінарний поділ або кон'югацію (стрілка). (Ґ) Форми,
схожі на аскус, що містять внутрішньоклітинні морфології, схожі
на спори (стрілки). (І-Л) Зображення взяті з біоплівок P. carinii на 9-
й день першого пасажу. (І) Маса кластерів, які, здається,
складаються з трьох кластерів, які приєдналися в центрі (стрілка).
(Й) Структури, схожі на аскуси в кластері з очевидним
внутрішньоклітинним вмістом, схожі на спори (стрілки). Форми,
схожі на ланцюги. Смужки, 10 мкм.

Тривалий час вчені розглядали Pneumocystis jirovecii з точки зору

таксономії, і в результаті наукових досліджень вони прийшли до
висновку, що цей мікроорганізм відноситься до царства Грибів.
Аналіз мітохондріальних білків, ключових ферментів (таких як
тиміділатсинтаза і дигідрофолатредуктаза) та послідовності рРНК
підтвердив, що P. jirovecii більше схожий на гриби, ніж на інші
організми. Дослідження біології цього мікроорганізму ускладнене
тим, що він не росте в культурі. У своєму життєвому циклі P.
jirovecii проходить кілька стадій, включаючи трофозоїти (розміром
1—4 мкм), предцисти та цисти (розміром 5—8 мкм). Цисти мають
товсті клітинні стінки і сферичну форму, а всередині можуть
містити до 8 спорозоїтів. Трофозоїти мають амебоїдну форму та
одне або кілька прозорих сферичних вакуолей та одне ядро в
цитоплазмі. Внутрішньоцистні тіла є поліморфними, амебоїдними
або подовженими. Зрілі цисти можуть мати внутрішньоцистні
органи та багато трофозоїтів всередині сотоподібного матеріалу в
альвеолярному просторі.

На основі морфології Pneumocystis існує у двох основних формах:

трофічній формі - безстатевій (раніше називалася трофозоїтом) і
цистовій формі – статевій (також відомий як оболонка спор). Було
припущено, що трофічні форми можуть кон'югувати і утворювати
цисти, які дозрівають і містять вісім ядер. Ці цисти розриваються,
вивільняючи вісім трофічних форм. Трофічні форми можуть
реплікуватися і не статеова - через бінарне ділення. Незважаючи на
те, що життєвий цикл ще не був повністю розкритий, організм було
ізольовано в альвеолярних просторах організму-господаря, де
трофічна форма прикріплюється до епітеліальних клітин альвеол.
Ця взаємодія важлива для виживання організму, і його не вдалося
успішно утримувати в штучному сердовищі. Останні роботи
вказують, що утворення біоплівки також критичне для виживання
організму і може стати основою для майбутніх експериментів in
vitro.
Клітинні стінки цист багаті вуглеводами, в основному складаються
з ß-1,3-глюкану, а також хітину та білків. Основний антиген
поверхні клітин відомий як головний глікопротеїн поверхні (MSG)
або глікопротеїн A (gpA). Він є високозмінним і відрізняється серед
різних видів Pneumocystis, які заражають різних ссавців. MSG
взаємодіє з організмом-господарем, зв'язуючись як із білком
поверхні легень - поверхневий білок D, який накопичується при
пневмонії Pneumocystis, так і з макрофагами господаря через
рецептори маннози. Здатність локуса MSG до рекомбінації
допомагає організму ухилятися від захисту господаря. У
Pneumocystis також міститься сериновий протеаза-кексин,
закодований локусом Kex1. Вважається, що ця протеаза,
знаходячись на поверхні клітин, має меншу варібельність антигену,
ніж MSG, хоча останні звіти вказують на генетичні поліморфізми в
цьому гені.
Було визначено кілька ферментативних мішеней у Pneumocystis,
включаючи дигідроптероат-синтазу (DHPS) і дигідрофолат-
редуктазу (DHFR), ферментативні цілі для сульфонамідів та
триметоприму відповідно. Гени, що кодують ці ферменти, а також
локус цитохрому B (місце дії атоваквону), були ідентифіковані та
послідовані. Зміни в цих локусах, припускається, пов'язані з
лікарською стійкістю.
Pneumocystis виявляє видово-специфічну двю для господарів, і
номенклатура була переглянута для відмінності цих різних видів.
Цей збудник у щурів називається P. carinii, але цей вид не заражає
людей. Назва Pneumocystis, яка заражає людей, була змінена з
Pneumocystis carinii на Pneumocystis jirovecii на честь Отто
Йіровеця, одного з перших вчених, який визначив цього збудника у
людей.
Людський P. jirovecii не може бути вирощений in vitro, тому
традиційні методи визначення не можуть бути використані.
Молекулярні техніки дозволяють виявляти мутації у ферментах-
мишенях для різних препаратів, проте клінічне значення цих
мутацій наразі невідоме.
Оскільки P. jirovecii був під дією сульфаніламідів(антибіотиків),
можна припустити, що цей організм може розвивати стійкість до
них. TMP/SMX (Trimethoprim/sulfamethoxazole AND Sulfamethoxazole
інгібують фермент біосинтезу фолієвої кислоти DHPS. Теоретично
стійкість до сульфаніламідів може виникнути в результаті точкових
мутацій у гені DHPS. Здається, що мутації DHPS відбуваються
частіше за останні роки, ніж один або два десятиріччя тому, і
частіше виявляються у пацієнтів із значущим попереднім впливом
сульфаніламідів. Цікаво, що опір до триметоприму не виявлено, що
може свідчити, що, можливо, триметоприм не справляє великого
селективного тиску через свою низьку активність. Експерименти на
гризунах in vivo підтримують цей концепт.
Чи ступінь визнаної наразі стійкості до сульфаніламідів є клінічно
достатньою для виклику неефективності лікування або
профілактики поки не було остаточно визначено. Данське
дослідження повідомило, що пацієнти з мутованим DHPS менше
ймовірно виживають від пневмоцистозу, хоча відповідь на TMP-
SMX специфічно не розглядалася. Більш пізнє дослідження
показало, що, хоча більшість пацієнтів із мутованим генотипом
вижили після прийому лікувальних доз TMP-SMX, спостерігалася
тенденція до того, що ці пацієнти частіше потребують механічної
вентиляції легень та мають смертельний перебіг хвороби. Крім
того, ще два дослідження повідомили, що немає впливу на
виживання або відповідь на терапію у тих, хто має мутований
DHPS. Існує занепокоєння тим, що в майбутньому може виникнути
вищий рівень стійкості, що зменшить ефективність сульфаніламідів
ще більше.
Остаточний діагноз хвороби P. jirovecii передбачає демонстрацію
цист або трофозоїтів в тканинах людини чи рідинах тіла, оскільки
людський Pneumocystis не може бути виведений в культурі в
лабораторних тваринах чи in vitro. До епідемії СНІДу для
діагностики ПЦП зазвичай вимагалася відкрита біопсія легенів. З
розвитком вдосконалених методів діагностики тепер можна
встановити діагноз менш інвазивними способами. Практично всі
пацієнти із ВІЛ можуть бути діагностовані за допомогою уважного
аналізу бронхоальвеолярної лаважної рідини (БАЛ), хоча БАЛ
менше чутливий у пацієнтів без ВІЛ. За допомогою індукованої
мокроти показано чутливий, простий і неінвазивний метод для
діагностики ПЦП у ВІЛ-інфікованого населення і часто зменшує
потребу в бронхоскопії. Звітовані виходи щодо відновлення
організму варіюють від 70-95% в різних установах, і ефективність
тесту залежить від знайомства лабораторії з технікою. У рідкісних
випадках може знадобитися тканинна діагностика. Можна виконати
трансбронхіальну біопсію, біопсію за допомогою відеоасистованої
торакоскопії (VATS) чи відкриту біопсію легенів. Найчастіше, коли
бронхоальвеолярне лаваж не виявляє Pneumocystis, біопсія розкриє
патологічний процес, відмінний від ПЦП.
Ідентифікація P. jirovecii в мокроті чи рідині БАЛ традиційно
використовувала фарби, такі як метенамінове срібло, толуїдиновий
блакитний-O, Геймса, Діфф-Квік чи імунофлюоресцентні тести.
Використання моноклональних антитіл спричинило виникнення
швидкого, чутливого і легкого для виконання імуногістохімічного
аналізу, який ефективніший за традиційні фарбування, для
виявлення Pneumocystis jirovecii в респіраторних матеріалах.
Нещодавно були розроблені молекулярні аналізи для виявлення P.
jirovecii в рідині БАЛ, індукованій мокроті чи оральних зразках
(промивні води з ротової порожнини). Методи ПЛР
використовують різні генетичні мішені, але найвища чутливість
спостерігається у методів, які використовують ампліфікацію
мітохондріального рРНК чи головного поверхневого
глікопротеїну , або методу ПЛР з внутрішніми етапами, щоб
збільшити чутливість. У одному дослідженні кількісний тест ПЛР
за методом "тач-даун" за геном MSG мав чутливість 88% і
специфічність 85% для діагнозу ПЦП в оральних промивальних
зразках. Ініціація лікування ПЦП до збору промивки рота зменшила
чутливість тесту ПЛР, що свідчить про те, що зразки слід збирати
якомога раніше в клінічних умовах. З використанням ПЛР на
індукованій мокроті чи БАЛ чутливість збільшується, але
специфічність зменшується через виявлення більше випадків
колонізації. Ці високочутливі молекулярні техніки на даний момент
не є стандартом у клінічній практиці, але вони є корисними
інструментами для досліджень щодо стійкості до ліків, вивчення
колонізації пневмоціст та вирішення питань щодо передачі
хвороби.
Газометрія артеріальної крові (в спокої та при навантаженні)
виявляє гіпоксію, інколи в поєднанні з гіпокапнією та дихальним
алкалозом. Чутливим, однак мало специфічним показником є
зниження TLCO. Кількість лейкоцитів в крові залишається в нормі; у
ВІЛ інфікованих зустрічається анемія з лімфопенією із зниженням
числа CD4+ лімфоцитів, часто <200/мкл, підвищення активності
ЛДГ сироватки.

Також досліджуються інші новаторські методи діагностики ПЦП.

S-Аденозилметіонін (AdoMet) є молекулою, яку Pneumocystis
потребує для метилювання та синтезу поліамінів і яку Pneumocystis
видобуває зі своїх господарів. Два дослідження показали, що рівні
AdoMet знижуються у людей з ПЦП. З пороговим значенням між
59 та 66 нМ AdoMet чутливість та специфічність складають
відповідно 0,88 та 1,0 для діагностики ПЦП. Рівні AdoMet
зростають із успішним лікуванням, що свідчить про те, що це може
бути неінвазивним, швидким тестом для діагностики ПЦП та
визначення відповіді на лікування. Однак у наступному
перспективному дослідженні 31 ВІЛ-негативного пацієнта із та без
ПЦП рівні AdoMet не надійно відрізняли пацієнтів із та без ПЦП.
Іншим швидким тестом, який виявився корисним, є рівень
сироватки β-D-глюкану. З пороговим значенням 31,1 мг/мл
чутливість та специфічність β-D-глюкану складають відповідно
92,3% та 86,1%. У перспективному дослідженні пацієнтів із ВІЛ-
негативним статусом підвищений рівень сироваткового β-D-
глюкану з пороговим значенням 60 мг/мл мав чутливість 0,90 та
специфічність 0,89. Ця молекула підвищується при інших
грибкових інфекціях, і специфічність може бути нижчою, якщо
застосовується більш широко.
Клінічний приклад: (стаття за жовтень 2023.
Università degli Studi di Torino Turin, Piedmont, Italy )

Післятрансплантаційна пневмоцистозна пневмонія (PcP) є

рідкісним, але все частіше згадуваним захворюванням серед
пацієнтів яким трансплантують органи, пов'язаним із значною
морбідністю та смертністю. Хоча впровадження профілактики PcP
знизило загальну її поширеність, її поширеність залишається
високою, особливо протягом другого року після трансплантації,
періоду після припинення профілактики. Недавно описано два
випадки PcP, які виникли більше, ніж через один рік після
трансплантації серця (HT) у пацієнтів, які більше не отримували
профілактику PcP згідно з місцевим протоколом. У обох випадках
захворювання було діагностовано після виявлення вірусної
інфекції, що призвело до значного збільшення ризику розвитку PcP.
Хоча поточні рекомендації щодо трансплантації серця
рекомендують профілактику Pneumocystis jirovecii протягом 6-12
місяців після трансплантації, після цього періоду вони тільки
вказують на розширену схему профілактики для високоризикових
пацієнтів. Останні дослідження визначили кілька нових факторів
ризику, які можуть бути пов'язані із збільшеним ризиком
інфікування PcP, включаючи лікувальні режими та характеристики
пацієнта. Також індикації для профілактики PcP у пацієнтів без ВІЛ
були розширені в зв'язку з введенням нових лікарських засобів та
терапевтичних режимів для імуномодульованих захворювань. За
нашим досвідом перший пацієнт успішно лікувався неінвазивною
вентиляцією, тоді як другому знадобилося трахеальне введення,
інвазивна вентиляція та екстракорпоральне видалення CO2 через
важку респіраторну недостатність. Метою цього подвійного звіту
про випадок є огляд поточного моменту проведення профілактики
PcP після пересадки серця, конкретних потенційних факторів
ризику для PcP після ПС та визначників швидкої діагностики та
терапевтичного підходу у критично хворих пацієнтів.
Високороздільні зображення комп'ютерної томографії висвітлюють
випадки, про які повідомлялося. Панелі (А) підкреслюють дві зрізи
з високороздільної КТ першого звітованого випадку, зображення
показують білатеральні розсіяні затемнення, з апікальним
переважанням та заощадженням на периферії, а панелі (Б)
відносяться до другого випадку і показують розсіяні тонкі
затемнення в обох легенях, без апікального переважання чи
заощадження на периферії.
Морфологія Pneumocystis радикально змінюється під час утворення
біоплівки. (А) P. carinii з надлишкового розчину 3-денного
стандартного короткотермінованого культурного методу,
розфарбованого Hema3, що ілюструє відмінності в морфології
структур біоплівки. (Б-Г) Зображення взяті з 16-денної біоплівки,
що відбулася з P. murina (одержаної як свіжий ізольований штам).
Зображення були отримані з плівок на вставках, які були почищені
за допомогою наконечника піпетки, аспіровані, висушені повітрям і
розфарбовані Hema3, швидким фарбуванням за методом Врайта-
Гімзи. Зображення переглядалися під масляним зануренням.
Смужки, 10 мкм. (Б) Кластер P. murina, що показує структуру,
схожу на цисту, з ніжкою (стрілка). (В) Аскус в ланцюгу з
внутрішньоцистичними формами. (Д) Відбивний кластер, який
починає утворювати відростки (стрілка). (Е) Два великих кластери,
які утворюють ланку або місток (стрілка). (Ф) Серія структур,
схожих на цисти, що утворюють ланцюг (стрілки). (Г) Циста, що
містить структуру, яка, схоже, є трофічними формами, що
проходять бінарний поділ або кон'югацію (стрілка). (Ґ) Форми,
схожі на аскус, що містять внутрішньоклітинні морфології, схожі
на спори (стрілки). (І-Л) Зображення взяті з біоплівок P. carinii на 9-
й день першого пасажу. (І) Маса кластерів, які, здається,
складаються з трьох кластерів, які приєдналися в центрі (стрілка).
(Й) Структури, схожі на аскуси в кластері з очевидним
внутрішньоклітинним вмістом, схожі на спори (стрілки). Форми,
схожі на ланцюги. Смужки, 10 мкм.