4.

POGLAVLJE Spolne prastanice

Gametogeneza je proces nastanka jajne stanice i spermija iz nezrelih spolnih prastanica ili germinativnih stanica. Germinativne stanice omoguuju kontinuitet ivota izmeu generacija, a mitotski preci naih vlastitih germinativnih stanica nekada su naseljavali spolne lijezde gmazova, vodozemaca, riba i beskraljenjaka. U veine ivotinja, kao to su kukci, oblii i kraljenjaci, germinativne stanice se vrlo rano i jasno odvajaju od somatskih stanica. U nekim skupinama (arnjaci, virnjaci i platenjaci) dioba nije tako jasna, odnosno somatske stanice mogu vrlo lako postati germinativne, i u odraslom organizmu. Primjer za to su zooidi, pupoljci i polipi navedenih beskraljenjaka, u kojih su somatske stanice sposobne izrasti u novi organizam. Germinativne stanice, koje tijekom razvitka postaju zasebna loza stanica, i vrlo rano se razdvajaju od ostalih somatskih stanica, ne diferenciraju se unutar gonada. Prekursori germinativnih stanica nazvane spolne prastanica (primordial germ cells, PGCs) nastaju drugdje, a tijekom ranog embrionalnog razvoja migriraju do buduih gonada. Prema tome, prvi korak u gametogenezi je nastajanje spolnih prastanica te njihovo putovanje do spolnih nabora, iz kojih e se razviti gonada. Meusobnim interakcijama razvija se gonada i nastupa gametogeneza. Gamete svih organizama koji se razmnoavaju spolnim putem, nastaju iz spolnih prastanica, meutim njihov specifian postanak razlikuje se unutar razliitih skupina ivotinja. U oblia, muha i aba dokazano je da se podrijetlo spolnih prastanica moe pratiti od citoplazmatskih determinatora u jajnoj stanici do germinativne plazme u vegetativnim stanicama nastalim tijekom brazdanja. U tim stanicama postoje odreeni proteini, odnosno mRNA, nazvani zajednikim imenom germinativna plazma, i rasporeuju se po stanicama kerima tijekom brazdanja te ih odreuju kao budue germinativne stanice. U drugih ivotinja, kao to su dadevnjaci i sisavci, spolne prastanice postaju specifine tijekom interakcija sa susjednim stanicama. U sisavaca se razvoj germinativnih stanica inducira tijekom ranog embrionalnog razvoja (Slika 4.1 i 4.2)

36

Slika 4.1 Putevi migracije spolnih prastanica u mia. Stanice izvanembrionalnog ektoderma induciraju susjedne stanice epiblasta da postanu prekursori spolnih prastanica i stanica izvanembrionalnog mezoderma. Tijekom gastrulacije (strelice) te stanice se smjetaju u posteriorni dio epiblasta, zatim izrastaju iz primitivne pruge i na kraju migriraju u definitivni endoderm samog embrija. Kako je endoderm zametni listi iz kojeg se razvija probavilo, spolne prastanice se u daljnjem stadiju razvoja mogu vidjeti kako iz probavila migriraju prema spolnim naborima. (Preuzeto
iz: Gilbert, 2003).

37

Slika 4.2 Gonade enke (A) i mujaka (B) mijih embrija obojane protutijelima protiv Ekadherina (crveno) i laminina (zeleno). Spolne prastanice oba spola pokazuju jaku ekspresiju Ekadherina i vide se u nakupinama u korteksu ovarija, dok su u testisima smjetene kao unutranji traci stanica. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003). Migracija germinativnih stanica u ptica i gmazova U ptica i gmazova germinativne stanice potjeu od stanica epiblasta koje migriraju iz centralnog dijela ranog embrija, nazvanog area pellucida, prema hipoblastu, tj. njegovom anteriornom dijelu, gdje na granici te zone nastaje struktura nazvana germinativni polumjesec (Slika 4.3). Tu se spolne prastanice mnoe.

Slika 4.3 Germinativni polumjesec pileeg embrija. (A) germinativne stanice u stadiju primitivne pruge (otprilike 18 sati nakon oplodnje) obojane ljubiasto, kao pozitivna reakcija za Vasa protein. (B) Na veem poveanju vidi se zadebljali epiblast i germinativne stanice obojane smee. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003). Nakon toga slijedi migracija prema spolnim naborima i to putem krvotoka. Kada se u
38

germinativnom polumjesecu stvore prve krvne ile, germinativne stanice ulaze u njih i cirkulacijom stiu do dijela gdje se formira stranje probavilo. Tu izlaze iz cirkulcije i dijapedezom putuju kroz mezenterij, dok ne stignu do epitela spolnih nabora (Slika 4.4).

Slika 4.4 Migracija zametnih stanica u embriju pileta. A - Scanning elektronskomikroskopska

snimka primordijalnih germinativnih stanica u kapilari u gastruli pileta. Germinativne stanice se istiu svojom veliinom i mikrovilima na povrini. B Shematski prikaz poprenog presjeka kroz mjesto nastanka budue gonade. Germinativne stanice su u nakupini unutar krvne ile, prolaze kroz endotel i pribliavaju se epitelu gonada (genitalnom naboru). C nakon prolaska kroz endotel germinativne stanice migriraju (strelice na slici) prema genitalnom naboru. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Spermatogeneza (gr. sperma sjeme, genesis postanak)

U mukoj spolnoj lijezdi (testisu) nalaze se praspolne stanice koje se diobom dijele i daju dvije vrste stanica: jedan dio stanica ostaju praspolne koje e se i dalje dijeliti, a druge se razvijaju u spermije. Proces nastanka spermija naziva se spermatogeneza, i sastoji se od 3 osnovne faze: 1. spermatocitogeneza,
39

2. mejoza 3. spermiogeneza (Slika 4.5). U tom procesu postoji nekoliko stadija razvoja, od kojih su prve spermatogonije koje nastaju iz praspolnih stanica. Spermatogonije se mitotski dijele, imaju diploidan broj kromosoma i kada dovoljno narastu prelaze u spermatocite i time se zavrava proces spermatocitogeneze. Primarne spermatocite su najvee stanice, sa spiraliziranim kromatinom, one ulaze u mejotiku diobu pa nastaju sekundarne spermatocite koje imaju haploidan broj kromosoma. Nakon sekundarnih spermatocita nastaju spermatide iz kojih nastaju spermiji u procesu spermiogeneze.

Slika 4.5 Spermiogeneza. Iz centriola nastaje dugaki bi koji e biti posteriorni dio spermija, a iz Golgijevog aparata na prednjem dijelu se formira akrosom. Mitohondriji se nakupljaju oko bia i sudjeluju u stvaranju sredinjeg dijela bia. Jezgra se kondenzira, a ostatak citoplazme se gubi. Zadnji stadij razvoja je na slici prikazan uvean u odnosu na ostale. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Tijekom sazrijevanja spermatida u spermije dolazi do promjena: veina citoplazme se izgubi, DNA u jezgri se komprimira, iz Golgijevog aparata se formira akrosom koji sadrava enzime za prodiranje kroz ovojnice i membrane jajne stanice, te nastaju vrat i rep spermija. Vrat i rep sadravaju
40

mitohondrije i centriole iz kojih nastaju mikrotubuli i flagelum (bi). Svaki spermij sadri haploidan broj kromosoma, sistem koji omoguava pokretanje i enzime za prolazak kroz jajnu ovojnicu. Nain na koji se spermiji kreu ovisi o njihovoj prilagodbi na okoli kroz koji prolaze. Kod veine vrsta spermiji se aktivno pokreu pomou flageluma. On se sastoji od mikrotubula koji nastaju od centriola pri bazi nukleusa. 2 sredinja mikrotubula okruena su s 9 dvostrukih mikrotubula. Mikrotubuli su izgraeni od proteina tubulina i dineinskih ruica koje oslobaaju energiju za pokretanje, jer imaju aktivnost ATP-aze (Slika 4.6).

Slika 4.6 Graa bia spermija. A popreni presjek kroz bi spermija sisavaca na kojem se vidi sredinja aksonema i periferna vlakanca. B shema grae aksoneme od 9+2 mikrotubula. Parovi mikrotubula sastoje se od 2 podjedinice (A, B) od kojih A ima 13 protofilamenata, a B samo 11 protofilamenata. C trodimenzionalni model A mikrotubula s i tubulinskim podjedinicama. Mikrotubuli mogu mijenjati oblik polimerizacijom ili depolimerizacijom tubulinskih podjedinica na oba kraja. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

U procesu spermatogeneze iz svake spermatocite nastaju etiri spermija koji su svi funkcionalni, mali i vrlo pokretni. Tijekom diobe spermatogonija citokineza nije potpuna. Stanice formiraju sincicij, odnosno uz pomo citoplazmatskih mostia veliine oko1 m, meusobno komuniciraju. Zbog toga stanice sazrijevaju sinhronizirano te dolazi do transkripcije gena iji produkti e kasnije stvarati proteine potrebne za razvoj aksoneme i akrosoma (Slika 4.7).

41

Slika 4.7 Formiranje sincicija-klona mukih spolnih stanica. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).
42

Oogeneza (gr. oon jaje, genesis postanak) Jajna stanica se razvija iz spolnih prastanica unutar folikula u kortikalnom podruju enskih spolnih lijezda. Najprije nastaju oogonije. Oogonije se mitotski dijele, a zatim rastu, ispunjavaju se hranjivim tvarima i prelaze u primarne oocite. Primarna oocita se zatim dijeli i nastaje sekundarna oocita koja ima reducirani broj kromosoma. Najee iz jedne primarne oocite diobom nastaje sekundarna oocita i tri polocite. Polocite su male stanice koje sadre vrlo malo citoplazme, i u najveem broju sluajeva one propadaju. Samou kukaca polocite sudjeluju u stvaranju ovojnice oko zametka. Iz sekundarne oocite, koja predstavlja veliku stanicu s velikom koliinom citoplazme, razvija se jajna stanica. enska gameta moe biti jajna stanica s haploidnim brojem kromosoma (npr. jeinci) ili primarna oocita u ranom stadiju razvoja, gdje je nukleus je jo uvijek diploidan, kao kod veine sisavaca i maloetinaa. Sekundarna oocita sisavaca nastaje nakon prve mejotske diobe i haploidna je, a drugu mejotsku diobu zavrava tek pri ulasku spermija kroz membranu jajne stanice (Slika 4.8).

Slika 4.8 Razvojni stadiji jajne stanice u trenutku oplodnje u razliitih vrsta. Zametni mjehuri (eng. germinal vesicle) je naziv za veliku diploidnu jezgru primarne oocite. Polarna tijela se vide na manjim stanicama. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Za razliku od spermija, koji ima minimalnu koliinu citoplazme, jajna stanica zadrava i jo akumulira dodatnu koliinu citoplazme. Tijekom diobe kada nastaju oocite i polocite, oocite iz kojih se razvija jaje zadravaju cjelokupnu citoplazmu, dok polocite zadravaju samo tanki sloj citoplazme. I upravo zbog toga je jaje volumenom mnogo vee od spermija. Jajna stanica morskog jeinca volumenom je oko 10,000 puta vea od spermija (Slika 4.9).

43

Slika 4.9 Jajna stanica morskog jeinca u trenutku oplodnje. Prikazan je omjer veliine spermija i same jajne stanice. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

U nekih skupina, jajna stanica, za vrijeme dok je u jajovodu, akumulira vitelogenin, transportni oblik umanjka, koji se stvara u jetri i krvotokom doprema u jaje. Kada dospije u jaje vitelogenin prelazi u umanjane palete koje se sastoje od nutrijenata potrebnih za prehranu embrija. Veina tvari akumuliranih u citoplazmi jajne stanice stvara se tijekom profaze prve mejotske diobe. Obino se ta faza razvitka jajne stanice dijeli u previtelogenu (prema grkom prije stvaranja umanjka) i vitelogenu fazu. Vitellogenesis ili stvaranje umanjka poinje u diplotenom stadiju. umanjak nije jedna tvar ve je mjeavina razliitih molekula potrebnih za prehranu embrija. Dio jajeta u kojem je smjetena najvea koliina umanjka je vegetativni pol, dok je na animalnom polu smjeteno malo umanjka s jezgrom i citoplazmom, kao u vodozemaca. U nekim sluajevima ista ivotinjska vrsta stvara jaja razliite veliine i oblika ovisno o godinjem dobu, kao napr. kod vodozemaca ili kod vodenbuha, koje ljeti razvijaju ljetna, mala jaja s malom koliinom umanjka, a zimi vea i bogatija hranom. Sazrijevanje oocita u abe (Slika 4.10), odnosno vodozemaca, odvija se kroz due razdoblje, jer je jajna stanica i njezine razliite citoplazmatske molekule u nekih vrsta, odgovorna za zapoinjanje i odvijanje ranog embrionalnog razvoja. U nekih vrsta oplodnja ak nije niti potrebna. Molekule koje se akumuliraju u citoplazmi ukljuuju: molekule za energiju (sadrane u vitelusu), enzime i prekursore za sintezu DNA, RNA i proteine, strukturne proteine i morfogenetike regulacijske faktore koji kontroliraju rani embrionalni razvoj te ve sintetizirane mRNA molekule Osim sinteze mRNA, za vrijeme oogeneze dolazi do transkripcije i ribosomalne i transfer RNA, koje su potrebne za razvoj embrija do stadija srednje blastule (Slika 4.11).

44

Slika 4.10 Rast oocita u abe. Tijekom prve tri godine ivota proizvode se 3 stadija jajnih stanica (kohorte). Na crteu je prikazan rast prve generacije oocita. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Slika 4.11 Stvaranje rRNA produkata u oocitama Xenopus sp. Relativni odnosi sinteze molekula za vrijeme oogeneze tijekom 3 zadnja mjeseca prije ovulacije. Ovisno o hormonskoj stimulaciji, oocita zavrava svoju prvu mejotsku diobu i ovulira. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003). 45

U zreloj jajnoj stanici dakle mora postojati itav niz razliitih molekule potrebnih za rast i razvoj: Proteini. Proi e dosta vremena prije nego se zametak moe sam prehranjivati. Stoga se jajna stanica mora opskrbiti tvarima bogatim energijom i aminokiselinama. U mnogim vrstama to se postie nakupljanjem umanjka koji se uglavnom proizvodi u jetri i masnim tijelima te putem majinog krvotoka dospijeva u jajnu stanicu tijekom njezinog rasta i sazrijevanja. (Jajna stanica ptica primjer je za najveu stanicu u ivotinjskom svijetu). Ribosomi i tRNA. Rani zametak treba itav niz vlastitih proteina pa se u mnogih vrsta nakon oplodnje dogaa masovna sinteza proteina. To omoguuju ribosomi i tRNA ve prisutni u jajnoj stanici. Jaje u razvoju ima specifine mehanizme za sintezu ribosoma; neke oocite vodozemaca u vrijeme profaze u mejozi stvaraju i do 1012 ribosoma. Glasnika RNA. U veine organizama su upute za proteine potrebne u ranim stadijima razvoja zapakirane u citoplazmi jajne stanice. Procjenjuje se da u jajima morskog jeinca postoje tisue razliitih tipova mRNA. Ona je u mirovanju, a aktivira se tek nakon oplodnje (Tablica 4.1). Morfogenetiki faktori ili morfogeni. U jajnoj stanici su takoer prisutne i molekule koje usmjeruju diferencijaciju stanica u odreeni tip stanica. U mnogih vrsta te su molekule smjetene u razliitim dijelovima citoplazme jajne stanice, a tijekom brazdanja raspodjeljuju se u razliite blastomere. (Za takve molekule koristi se i naziv citoplazmatski determinatori razvitka). Zatitne kemijske tvari. Zametak ne moe pobjei od predatora ili nepovoljnih uvjeta okolia. Stoga neke jajne stanice sadre UV filtere i enzime za popravak DNA, druge su neugodnog okusa za eventualne predatore, a umanjak ptica sadri ak protutijela.

46

Tablica 4.1 mRNA koje se nalaze u citoplazmi oocite i premjetaju za vrijeme oplodnje. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

47

Tipovi jajnih stanica Ovisno o koliini umanjka, jajne stanice moemo podijeliti na (Slika 4.12): Izolecitelna jajna stanica jednolian raspored i malo vitelusa (bodljikai i sisavci) Telolecitelna velika koliina vitelusa u stanici (ptice). Vitelus je koncentriran na vegetativnom polu (ribe, gmazovi) Centrolecitelna vitelus u sredini jajeta (kukci) Mezolecitelna srednja koliina vitelusa (vodozemci). Vitelus je koncentriran na vegetativnom polu

c. Centhrolecithal Slika 4.12 Podjela jajnih stanica ovisno o koliini umanjka. Opne koje se nalaze oko jajnih stanica (ovisno o ivotinjskoj skupini) su: Primarne sloj citoplazme koja sadri vitelus koji je po svom sastavu smjesa proteina, glikogena i masti vitelina membrana. Kod kraljenjaka vitelina ovojnica je izvanstanini matriks koji se naziva zona pelucida. Sekundarne nastaju od folikularnih (granuloza) stanica koje pomau prijenos nutrijenata do embrija. Kod veine kraljenjaka folikularne stanice se odvajaju od jajeta kod izlaska iz jajnika. Kod placentalnih sisavaca dio folikularnih stanica ostaje oko jaje ta corona radiata , a stvaraju i nakupinu stanica cumulus oophorus (breuljak) na kojoj jajna stanica stri u antrum foliculi (upljina folikula ispunjena hormonima). Kod sisavaca, da bi spermij bio uspjean mora proi kroz folikularni sloj, zonu pelucidu i membranu jajne stanice. Tercijarne - formiraju se u jajovodu nakon oplodnje, a nastaju od sekreta maternice, jajovoda i lijezda. Ptice, gmazovi i monotremata imaju ljusku, membranu vitelinu i
48

albuminsku ovojnicu bjelanjak (Slika 4.13). Struktura jajeta u gmazova i ptica Vitelina membrana pokriva povrinu jajne stanice. Nakon oplodnje, oko jajne stanice, ija je citoplazma ispunjena velikom koliinom umanjka, stvaraju se tercijarne opne. Bjelanjak u jajetu se sastoji od vode i proteina albumina. Ta tekuina titi jaje od mehanikih oteenja i isuenja. Albumin je izvor nutrijenata i postepeno se troi tijekom razvoja. Halaze su dvije opne od albumina privrene na unutranju stranu ljuske, tako da dre utanjak i embrio u sredini tekuine koja ga titi. Ljuska se sastoji od kalcijevog karbonata impregniranog proteinima. Male pore u ljuski (40-50 mikrometara) omoguuju izmjenu plinova izmeu jajeta i okolia. Na unutranjoj strani ljuske nalaze se dvije membrane, a izmeu njih je zrani dep koji se moe vidjeti na okruglastom kraju jajeta. Zrani dep se poveava tijekom razvoja, kako se zrak pomie zamjenjujui vodu koja je ishlapila.

Slika 4.13 Struktura jajeta i izvanembrionalnih membrana u razliitih skupina ivotinja.

Mnoga jaja imaju elatinoznu ovojnicu na povrini koja najee slui za privlaenje spermija u sluaju vanjske oplodnje. Ovojnica jajeta je esto odgovorna za prepoznavanje spermija i jajeta iste vrste. Ispod membrane jajne stanice nalazi se gusti sloj citoplazme kora koji sadrava mikrovile i kortikalne granule. Kada doe do prvog kontakta spermija i jajeta mikrovili se obaviju oko spermija i uvlae ga u jaje. Kortikalne granule sadravaju proteolitike enzime i mukopolisaharide koji spreavaju ulazak drugih spermija dok hijalini i adhezivni glikoproteini okruuju embrij i podupiru rana brazdanja.
49

Oplodnja
Interakcija spermija i jajne stanice ukljuuje pet osnovnih koraka: 1. 2. 3. 4. 5. Kemijsko privlaenje spermija od strane jajne stanice, jer ona izluuje topive molekule Egzocitoza akrosomskih vezikula (mjehuria) da izbace enzime Vezanje spermija na ovojnice jajne stanice (membrana vitelina ili zona pelucida) Prolaz spermija kroz izvanstanine omotae jajne stanice Stapanje membrana spermija i jajne stanice

Interakcije spermija i jajeta obino poinju s kemijskim privlaenjem spermija makromolekulama koje proizvodi jaje. Kada je u pitanju vanjska oplodnja (u vodi), moraju postojati dodatni mehanizmi kako bi se spermiji i jaja susreli. arnjaci, mekuci, bodljikai i svitkovci koriste se kemotaksijom. Izolirane su molekule koje proizvodi jaje, specifine za pojedine vrste, koje se nalaze u vrlo malim koncentracijama i djeluju kao aktivatori spermija. Kada su jaja spremna za oplodnju, proizvode kemijske signale za spermije koji se poinju bre i usmjerenije kretati. Oplodnja je proces u kojem se dvije spolne stanice, gamete spajaju stvarajui novu jedinku s genomom koji potjee od obaju roditelja, znai postiu se dvije stvari: spol, tj. kombinacija gena dobivena od roditelja i stvaranje novog organizma, tj. oplodnjom se prenose geni, a u citoplazmi jajne stanice potiu oni procesi koji e omoguiti daljnji razvoj. Iako se detalji u samom procesu oplodnje razlikuju od vrste do vrste, ipak se oplodnja openito sastoji od etiri osnovna dogaanja (Slika 4.14): 1. Kontakt i prepoznavanje izmeu spermija i jajne stanice. U veini sluajeva, to osigurava da spermij moe oploditi jajnu stanicu samo iste vrste. 2. Regulacija ulaska spermija u jajnu stanicu. Samo jedan spermij, konano, moe oploditi jajnu stanicu. To se uglavnom postie time to jajna stanica dozvoljava da samo jedan spermij ue, a inhibira sve druge 3. Spajanje genetikog materijala jajne stanice i spermija 4. Aktivacija metabolikih puteva u jajnoj stanici koji zapoinju razvoj nove jedinke

50

Slika 4.14 Spajanje spermija i jajne stanice: A) jeinac, B) mi.. A - oplodnja kod jeinca je vanjska. (1) Jaje aktivira i kemotaksijom privlai spermije. (2,3) dodir spermija i jajeta pokree akrosomsku reakciju i otputanje proteolitikih enzima. (4) spermij se privrsti za vitelinu membranu i stvara rupu u njoj. (5) spermij se stapa s plazmatskom membranom i jezgra spermija ulazi u jaje. B oplodnja kod sisavaca je unutranja. (1) enski reproduktivni trakt priprema, privlai i aktivira spermije. (2) spermij se akrosomom vee na zonu pelucidu, koja je tanja od viteline ovojnice. (3) akrosomska reakcija se odvija na zoni pelucidi. (4) spermij radi rupu u zoni pelucidi. (5) spermij se privrsti i plazmatske membrane se stapaju. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Reproduktivni trakt enke ima vrlo aktivnu ulogu u oplodnji sisavaca. Pokretljivost spermija nuna je za susret s jajnom stanicom, ali da se spermiji nau u jajovodu vjerojatno su vie zasluni pokreti spolnih organa enke. Spermiji su naeni u jajovodima mia, hrka zamoria, krave i ene 30 minuta nakon unosa u rodnicu, a to je svakako prekratko vrijeme i za najbre spermije da samo uz pomo pokretanja repovima prou put do jajovoda. U sisavaca do oplodnje dolazi unutar reproduktivnog trakta enke, ali prije toga spermiji prolaze kroz procese kapacitacije i akrosomske reakcije. Prolazak spermija kroz jajovod omoguuje kapacitaciju, ali molekularna zbivanja tog procesa jo uvijek su nepoznata. Ipak, postoji slijed dogaaja koji bi mogli biti znaajni. 1. Stanina membrana spermija mijenja se odstranjivanjem kolesterola uz pomo proteina albumina u reproduktivnom traktu enke. 2. Tijekom kapacitacije izgube se neke molekule na povrini spermija, za koje se smatra da bi mogle sluiti za blokiranje mjesta za prepoznavanje pa kada se te molekule odstrane, onda je
51

prepoznavanje mogue, tj. moe doi do akrosomske reakcije. 3. Mijenja se elektrini potencijal membrane spermija, a time se postie otvaranje proteinskih kanala za kalcij i bikarbonatne ione te se aktivira proizvodnja cAMP-a i time takoer omoguava akrosomska reakcija. 4. Dolazi do fosforilacije proteina

Tijekom kapacitacije, koja se odvija u jajovodu, uklanjaju se glikoproteinski omota i bjelanevine sjemene tekuine, mijenja se ph membrane zbog kretanja kalcija kroz ionske kanale i omoguuje fuzija spermija i jajeta. Taj niz reakcija ne uspiju proi svi spermiji, tako da se po nekim procjenama kod ovjeka samo 1 od 10,000 spermija uspije pribliiti jajetu. Akrosomska reakcija zapoinje stapanjem akrosomskih vezikula s membranom spermija i otputanjem proteolitikih enzima koji omoguuju prolaz kroz vanjsku ovojnicu jajeta (zona pelucida ili vitelina ovojnica). Postoje specifini receptori na jajetu i spermiju koji se veu i otvaraju kanale za Ca2+ ione te tako pokreu reakciju i omoguuju da do fertilizacije dolazi samo unutar vrste. U nastavku procesa akrosom se izduuje i prodire kroz ovojnicu. Kod jeinaca, svaki dio membrane jajeta moe se stopiti sa spermijem dok kod nekih vrsta samo odreena mjesta na membrani se mogu fuzionirati s glavom spermija. im se spermij spoji s membranom jajeta dolazi do kemijskih promjena na povrini jajeta pa se stvara fertilizacijska membrana koja onemoguuje prolaz drugih spermija (Slika 4.15). Brza poetna reakcija ukljuuje promjenu u elektrinom potencijalu membrane koja se proiti na sve strane i promijeni potencijal mirovanja. Ta blokada traje dosta kratko pa se za vrijeme nje stvara dugotrajnija kemijska blokada. Nakon ulaska spermija kortikalne granule koje se nalaze u kori jajeta stapaju se s membranom i isputaju svoj sadraj. Poticaj za egzocitozu daju ioni kalcija na mjestu ulaska spermija koji se ire po membrani. Usisavaca i jeinaca ioni kalcija, odgovorni za reakciju, skladite se u jajetu u endoplazmatskom retikulumu. Mukopolisaharidi iz granula proizvode osmotski gradijent koji povlai vodu ispod viteline ovojnice kako bi se ona proirila i prela u fertilizacijsku. Peroksidaza iz granula je enzim koji dodatno uvruje ovojnicu. U sisavaca kortikalne granule ne stvaraju posebnu ovojnicu nego modificiraju zonu pelucidu da se spermiji vie ne mogu vezati na nju.

52

Slika 4.15 Egzocitoza kortikalnih granula i stvaranje fertilizacijske membrane. Shematski prikaz stvaranja fertilizacijske membrane i hijalinog sloja. Egzocitozom kortokalne granule oslobaaju proteaze koje djeluju na proteine vezane uz vitelinu ovojnicu. Stvara se osmotski gradijent, voda ulazi i puni prostor izmeu viteline ovojnice i plazmatske membrane. Drugi enzimi otputeni iz kortikalnih granula ovrsnu vitelinu ovojnicu - sada fertilizacijsku membranu. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

Za prepoznavanje spermija i jajne stanice odgovorne su odreene molekule koje se oslobaaju tijekom akrosomske reakcije. U morskih jeinaca jedna takva molekula nazvana je bindin (Slika 4.16). Jajne stanice morskog jeinca, ili riba npr. sadre i elatinozni omota oko viteline membrane.

53

Slika 4.16 Vezanje akrosoma na povrini jajne stanice u morskih jeinaca. A stvarni dodir akrosoma s mikrovilima jajeta. B In vitro model vezanja bindina specifinog za svaku vrstu. Mjerena je aglutinacija jajeta i bindina tako da se dodavao bindin u plastinu posudu koja je sadravala jaja. Nakon 2-5 minuta protresanja posude suspenzija je fotografirana. Svaki bindin se vezao samo na jaja od svoje vrste. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

U sisavaca zona pelucida ima istu ulogu kao membrana vitelina u beskraljenjaka. Osnovni dio tih glikoproteina stvara jajna stanica tijekom sazrijevanja, a imaju presudnu ulogu za vrijeme oplodnje, jer omoguuju vezanje spermija i pokreu akrosomsku reakciju (Slika 4.17). Zona pelucida mia sastavljena je od tri glavna glikoproteina, ZP1, ZP2 i ZP3. ZP3 je specifini glikoprotein za koji se vee spermij i koji potakne akrosomsku rekciju. Vezanje spermija na zonu pelucidu uzrokuje kortikalnu reakciju, tj. kortikalna granula ispod membrane jajne stanice pucaju pa njihov sadraj odstranjuje ugljikohidrate sa ZP3, cijepa se ZP2, a zona pelucida se stvrdnjava i blokira plospermiju. U dodiru sa ZP3 glikoproteinima zone pelucide spermiji mia mogu koncentrirati proteolitike enzime akrosoma i doslovno na mjestu kontakta nainiti rupu kroz izvanstanine omotae jajne stanice. Na mjestu akrosomske reakcije dolazi do krinog povezivanja izmeu podjedinica ugljikohidrata (koji stre na proteinskim dijelovima glikoproteina ZP3) i intramembranskog proteina spermija, a to je galaktoziltransferaza I (ija aktivna mjesta stre prema van) te se tako uspostavlja kontakt. Tada se u membrani spermija aktivira G-protein, zapoinje kaskada reakcija koje otvaraju kalcijeve kanale u membrani, to omoguuje izlaenje, egzocitozu vezikula iz akrosoma. Egzocitoza akrosomskih vezikula oslobaa niz proteaza koje liziraju zonu pelucidu. Meutim, za uspjeno prodiranje glave spermija, tj. jezgre u citoplazmu jajne stanice, mora doi do sekundarnog vezanja to omoguuje ZP2 glikoprotein zone pelucide. Normalna monospermija, u kojoj u jajnu stanicu ulazi samo jedan spermij, omoguuje da se haploidna jezgra spermija sada kombinira sa haploidnom jezgrom jajne stanice, da se uspostavi diploidni broj kromosoma, a centriol koji je uao u citoplazmu jajne stanice zajedno sa spermijem omoguuje stvaranje diobenog vretena za poetak brazdanja.

54

Slika 4.17. Vezanje i prodiranje spermija u jajnu stanicu mia Muki i enski pronukleus migriraju jedan prema drugome. Kod nekih vrsta, DNA se replicira dok se kreu. Membrane nukleusa se dezintegriraju i kromosomi se skupljaju oko metafazne ploe. Stapanjem spermija i jajeta nastaje diploidna zigota koja nosi genetiku uputu oba roditelja, ali cijela citoplazma i organeli iz nje potjeu samo iz citoplazme jajeta, tj. od majke. Odmah nakon oplodnje dolazi do premjetanja citoplazme unutar jajeta (Slika 4.18). Ti pokreti su posebno vidljivi kod platenjaka i vodozemaca. Telolecitelna jajna stanica vodozemaca sadri jako pigmentirani animalni
55

pol, ispod njega se nalazi slabije pigmentirani sloj citoplazme (sivi), a vegetativni pol je proziran. Pri oplodnji, spermij u jajnu stanicu ulazi uvijek na animalnom polu i tadaj se vanjski crni sloj citoplazme zakree za 30, sivi sloj ostaje na mjestu, koji se tada na blastuli vodozemca vidi kao sivi polumjesec, struktura koja se stvara na suprotnoj strani od mjesta ulaska spermija. Neke od tih stanica sive boje se grupiraju te oznaavaju mjesto gdje e zapoeti gastrulacija. Pokretai citoplazme su niz paralelnih mikrotubula koji potjeu od oba roditelja, a stvaraju se samo za vrijeme kretanja citoplazme. Vidljivo je da je preraspodjela citoplazme bitna za daljnju diferencijaciju stanica. Centrioli koji se nasljeuju iz spermija organiziraju mikrotubule i uzrokuju pokretanje citoplazme u prvom ciklusu diobe.

Slika 4.18 Premjetanje citoplazme u oploenom jajetu abe. A - shematski prikaz poprenog presjeka kroz jaje za vrijeme prvog brazdanja. Spermij je uao na jednoj strani jajeta i sada jezga iz spermija migrira prema unutranjosti jajeta. Vidljiv je pigmentirani dio kore na animalnom polu i nepigmentirani vegetativni pol. B u oko 80% sluajeva se kortikalna citoplazma rotira za 30% u odnosu na unutranju citoplazmu. Gastrulacija zapoinje na podruju sivog polumjeseca, nasuprot mjesta ulaska spermija, gdje dolazi do najveeg premjetanja citoplazme. C odmah nakon kortikalne rotacije na podruju sivog polumjeseca kod vrste R. pipiens se javlja drukija pigmentacija. D prvo brazdanje dijeli sivi polumjesec po pola. (Preuzeto iz: Gilbert, 2003).

56

U razliitih vrsta postoje razliiti naini spreavanja polispermije. U morskog jeinca pokazano je ve 1902. godine da e ulazak dva spermija rezultirati smru ili abnormalnim razvitkom embrija. Najzastupljeniji nain jest sprijeiti ulazak vie spermija u jajnu stanicu. U jeinca su razvijena dva mehanizma da se sprijei polispermija: brza reakcija, koja se postie promjenom elektrinog potencijala stanine membrane oocite i spora rekcija, koja se postie egzocitozom kortikalnih granula, izlaenjem sadraja iz granula u prostor izmeu stanine membrane i proteina viteline membrane, ime se zapravo stvori fertilizacijska membrana i onemogui ulazak drugih spermija.

57