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NBT 1396
NBT 1396
조항
Yasushi Sato1,2, Kazuyuki Murase1,2, Junji Kato1,2, Masayoshi Kobune1, Tsutomu Sato1, Yutaka Kawano1,
Rishu Takimoto1, Kouichi Takada1, Koji Miyanishi1, Takuya Matsunaga1, Tetsuji Takayama1 & Yoshiro Niitsu1
현재 간경변증에 대해 승인된 항섬유화 요법은 없습니다. 우리는 인간 열충격 단백질 47의 쥐 상동체인 gp46에 대한 작은 간섭 RNA(siRNA)를 간 성상 세포에 전달
하기 위해 비타민 A 결합 리포솜을 사용했습니다.
우리의 접근 방식은 비타민 A의 흡수 및 저장뿐만 아니라 섬유화에서 이들 세포의 주요 역할을 이용합니다. siRNA 함유 비타민 A 결합 리포솜을 사용한 5가지 처
리는 간 섬유증을 거의 완전히 해결했고 그렇지 않으면 치명적인 디메틸니트로사민에 의해 유도된 쥐의 생존 기간을 연장했습니다. 용량 및 기간 의존 방식으로 간경
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변.
구조는 오프 타겟 효과와 관련이 없거나 선천적 면역 모집과 관련이 없습니다. 수용체 특정 siRNA 전달은 콜라겐 분비를 억제하고 CCl4 또는 담관 결찰에 의해 유도된 섬유증
을 치료하는 데 유사하게 효과적이었습니다. 간 섬유증의 급성 및 만성 모델을 모두 사용하는 접근법의 효능은 인간 간경변증을 역전시킬 수 있는 치료 가능성을 시사합니다.
모든 형태의 만성 간 손상의 궁극적인 병리학적 특징인 간경화 또는 섬유증은 전 세계적 레티놀 결합 단백질(RBP)에 대한 수용체를 통해 비타민 A 섭취에 대한 놀라운 능력을
으로 많은 이환율과 사망률의 원인이 됩니다. 간 섬유화를 담당하는 주요 세포 유형은 가진 HS 세포에 우선적으로 있습니다.
순환에서 비타민 A를 흡수하고 저장하는 상주 perisinusoidal 세포인 간 성상(HS)
세포입니다. 활성산소 중간체 또는 사이토카인에 의해 자극을 받으면 HS 세포가 활성 디메틸니트로사민(DMN), CCl4 또는 담관 결찰에 의한 유도를 포함하는 세 가지
화되고 증식성, 섬유화성 및 수축성 근섬유아세포1로 변형되어 프로콜라겐을 합성하고 간경변증 동물 모델을 사용하여 우리의 조직학적 분석은 HSP47의 상동체인 래트
분비합니다. 프로콜라겐은 말단 도메인이 프로콜라겐 펩타이드에 의해 절단된 후 불용 gp46을 인코딩하는 mRNA에 대한 siRNA를 운반하는 비타민 A 결합 리포솜의 정맥
성 콜라겐으로 축적되어 섬유증을 유발합니다. 콜라겐 특이적 샤페론인 열 충격 단백 (iv) 주사를 보여줍니다 . , (VA‑lip‑siRNAgp46)은 간 섬유증을 빠르게 해결합니다.
질 47(HSP47)은 소포체에서 프로콜라겐의 적절한 삼중 나선 형성을 보장하여 콜라 HS 세포와 유사한 세포가 만성 췌장염10 및 후두 섬유증11 과 관련된 섬유증을 유발
겐 분비를 촉진하고 프로콜라겐 합성의 변환 조절에도 관여합니다2,3. 하는 데 필수적인 역할을 하기 때문에 우리의 접근 방식은 간 이외의 기관에서 섬유증
상태를 치료하는 데 가치를 찾을 수 있습니다.
결과
콜라겐 합성이 억제될 때 동물4 및 인간5 의 간 섬유증이 퇴행할 수 있다는 실증은 siRNAgp46은 gp46 발현과 콜라겐 분비를 억제합니다 우리는 먼저 정상 쥐 신장
섬유증이 역전될 수 있으며, 아마도 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활동에 의해 가장 (NRK) 세포에서 풍부한 gp46 전사체(그림 1a 및 보충 그림 1 온라인)에 대한 3개의
가능성이 높다는 것을 시사합니다. siRNA(유형 A, B, C)의 효과를 설명했습니다. 이전에 콜라겐 생산12을 연구하는 데
콜라겐 합성을 억제하거나 매트릭스 메탈로프로테이나제를 활성화하기 위한 다양한 사용되었습니다. 세 가지 siRNA 모두 gp46 mRNA(보충 그림 1b)와 gp46 단백질(그
치료법이 동물 모델에서 조사되었습니다6,7. 그러나 특정 분자 및/또는 세포를 특이적 림 1a)의 축적을 억제했지만 A형 siRNA(siRNAgp46A)를 사용하여 관찰된 가장 큰
으로 표적화할 수 없기 때문에 주로 부작용이 있기 때문에 아직 임상적으로 적용되지 효능으로 후속 실험을 위해 선택했습니다. 다양한 투여량의 siRNAgp46A로 NRK 세
않았습니다. 포를 형질도입한 결과 50 nM에서 거의 완전한 억제와 함께 gp46 발현의 명백한 투여
량 의존적 억제가 나타났습니다(그림 1b). 그런 다음 siRNAgp46A가 콜라겐 분비를
다양한 범위의 콜라겐 유형3,8,9 과 HSP47의 특정 연관성 은 siRNA를 사용하여 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 프롤린 통합 분석을 사용했습니다. NRK 세
HS 세포 매개 콜라겐 분비를 표적화하기 위한 탁월한 후보가 됩니다. 이러한 전략의 특 포 배양액에서 새로 합성된 콜라겐의 농도
이성을 강화하기 위해 우리는 비타민 A 결합 리포솜에 siRNA를 캡슐화하는 것이 이를
표적으로 삼아야 한다고 추론했습니다.
1삿포로의과대학교 의과대학 내과4부, 삿포로, 060‑8543, 일본. 2이 저자들은 이 작업에 동등하게 기여했습니다.
서신은 YN(niitsu@sapmed.ac.jp)으로 보내주십시오.
siRNAgp46A로 형질도입된 세포는 부모 세포 및 무작위로 선택된 결합 및 분광광도법13. 처리되지 않은 NRK 또는 siRNArandom으로 처리된 NRK
siRNA(siRNArandom)로 형질감염된 세포에 비해 유의하게 감소했습니다(P<0.01) 세포보다 siRNAgp46A 처리된 NRK 세포에서 훨씬 적은 콜라겐이 분비되었습니다
(그림 1c). 배양된 NRK 세포의 콜라겐 분비량을 Sirius red 염료로 측정 (P < 0.01).
(그림 1d).
ㅏ cd e [ 3H]프롤린 혼입
80 80
Lip‑siRNA‑FAM 66.42
비 Lip‑siRNA‑FAM 0.7 93.76
+RBP 0.7µg/ml
60 60
gp46
0 80 0 80
40 40 Lip‑siRNA‑FAM
β‑액틴 0 88.91 +RBP 0.7µg/ml 63.94
20 20 +RBPAb
1nM 5nM 50nM 0 80 0 80
0 80 0 80
Lip‑siRNA‑FAM LI90
0 34.21 +RBP 0.7µg/ml 38.63 g 80
시간
+RBPAb 5.24
치료 없음
0 80 0 80 VA‑lipsiRNAgp46‑FAM Lip‑siRNAgp46‑FAM
10% FBS
VA‑lip‑siRNA‑FAM 0
0.07 32.95 37.22
+RBP 0.7µg/ml 100 101 102 103 104
0 80 0 80 80
VA‑lip‑siRNA‑FAM 37.67
0.14 32.57 35.59 Lip‑siRNA‑FAM
+RBP 0.7µg/ml
10% FBS
30
분
+RBPAb
VA‑립‑siRNA‑FAM 0 80 0 80
VA‑lip‑siRNA‑FAM 0 100 101 102 103 104
0.28 30.44 31.01
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+RBP 0.7µg/ml +대
조군 Ab
0 80 80
0 100 101 102 103 104 72.5
VA‑립‑siRNA‑FAM
0.7 31.55 10% FBS
1.4 31.79
조직 배양 플레이트에 콜라
나
0 겐 침착
100 101 102 103 104
NS
*
100 *
HS 세포에 의한 VA‑lip siRNAgp46‑FAM의 gp46 발현 및 콜라겐 합성 및 어
제
%
간
시
2
리포좀에 대한 비타민 A의 최적 비율 siRNAgp46 형광 현미경을 사용하여 (그림 1h). VA‑lip siRNAgp46‑FAM을 처리한 세포에서 형
을 HS 세포로 전달하기 위한 최적의 비타민 A/리포좀 비율을 결정하기 위해 우리는 광은 30분에 세포질에서 희미한 과립형 패턴으로 나타났고, 2시간에 핵주위 영역에서
carboxyfluorescein(FAM)(lip‑siRNAgp46‑FAM)에 결합된 siRNAgp46을 운반 더 조밀한 과립형 패턴으로 나타났다. 대조적으로, lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리된
하는 리포좀을 비타민 A와 함께 인큐베이션했습니다. 1:2에서 16:1까지. 한외여과로 세포의 세포질에서는 30분 후에 녹색 형광이 관찰되지 않았다. 더욱이, 2시간에서의
자유 비타민 A를 제거한 후, FACS(형광 관련 세포 분류)를 사용하여 쥐의 일차 조혈 핵주위 형광은 매우 희미하였다.
모세포(pHS 세포)의 비타민 A 결합 lip‑siRNAgp46‑FAM(VA‑lip siRNAgp46‑
FAM)에 의한 형질도입 효율을 조사했습니다. 가장 높은 평균 형광 강도(MFI) 수준
은 인큐베이션 용액에서 2:1의 몰비타민 A/리포좀 비율에서 관찰되었습니다(보충 그 VA‑lip‑siRNAgp46은 pHS 세포의 콜라겐 분비를 억제합니다 처리되지 않은 세
림 2 온라인). 우리는 모든 후속 실험에서 리포솜의 양이온성 지질 몰당 0.65몰 비타 포와 VA‑lip siRNA 무작위 처리된 세포보다 현저히 낮습니다(P < 0.01)(그림 1i).
민 A에 해당하는 이 인큐베이션 몰비에서 복합체를 사용했습니다.
lip‑siRNAgp46‑FAM에 비해 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 우선적 섭취는 정상 쥐의 VA‑lip‑siRNAgp46의 약력학 및 조직 분포를 더 자세히 밝히기 위해 [3H]비타민
일차 피부 섬유아세포를 사용하여 관찰되지 않았습니다(그림 1f). 우리는 LI90 세포 A와 함께 siRNAgp46을 운반하는 방사성 표지된 리포솜을 꼬리 정맥을 통해 정상적
(활성화된 인간 HS 세포주)14를 사용하여 pHS 세포와 관련된 실험과 유사한 실험을 인 쥐와 DMN에 의한 급성 간경변 유도 개시 24일 후 쥐에 주입했습니다. (24일 쥐;
수행했으며 본질적으로 동일한 결과를 발견했습니다(그림 1g). 그림 2d). [3H]VA‑lip‑siRNAgp46 의 순환 반감기는 DMN 처리된 쥐와 정상 쥐에서
각각 19분과 61분이었는데, 간경변에서 [3H]비타민 A(그림 2d, 삽입) 의 경우 13분이
었습니다. 쥐. 방사능은 주사 24시간 후 간경변 간에서 거의 독점적으로 발견되었습니
쥐 pHS 세포에서 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 세포내 수송 다(그림 2d). 동량의 방사성 표지된 비타민 A 결합 리포좀
RBP 수용체에 의한 흡수 후 siRNAgp46‑FAM의 세포 내 위치를 밝히기 위해 VA‑lip‑
siRNAgp46‑FAM 처리된 쥐 pHS 세포와 lip‑siRNAgp46‑FAM 처리된 쥐 pHS 세
포를 모니터링했습니다.
103 103
102 102
100 100
siRNA‑
Cy5
100 101 102 103 104 100 101 α 102 103 104
α SMA‑Cy3 병합 α SMA‑Cy3 병합 SMA‑FITC
104 104
나
나 ii ⅲ iv
100 100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
CD163‑FITC 104
V
104
0% 0.21% 0% 0.15%
103 103
100 100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
장백의‑FITC
리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM 망막
씨
리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM VA‑립‑siRNAgp46‑FAM
병합
VA‑립‑siRNAgp46‑FAM
CD68 병합
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디
100
삼
35 × 106 90 [ H]VA‑lip‑siRNAgp46(정상 래트) 3 [
는
있
아
남
에
액
혈%
80 H]VA‑lip‑siRNAgp46(간경변 쥐) 3 [
30 × 106 70
리포좀 Lip‑siRNAgp46‑FAM H]VA(간경변 쥐)
60
50
25 × 106
40
30
cpm/
직
(조
능
사
방 )
20 × 106 20
10
비장
0
15 × 106
0 4 8 12 16 20 24
시간(시간)
VA‑립‑siRNAgp46‑FAM 10 × 106
간경변 쥐
CD68 병합
일반 쥐
5 × 106
간 폐 신장 비장 마음
눈 뇌
장
그림 2 간경변 쥐의 HS 세포에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 특정 전달. ( a ) DMN 처리 된 간경변 쥐의 간 표본에서 DAPI (청색) 및 siRNAgp46‑FAM (녹색)으로 대조 염색
된 Cy3‑ 접합 항 ‑α‑SMA 항체 (적색), 핵에 의해 시각화 된 α‑SMA의 대표적인 형광 이미지 (일 24 쥐) 격일로 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM 또는 lip‑siRNAgp46‑FAM을 주사
(총 3회 주사). 간 표본은 마지막 주입 후 24시간에 수확되었습니다. 원래 배율(200)로 촬영한 사진과 상자로 둘러싸인 영역에 해당하는 확대 이미지는 i, ii 및 iii, iv에 표시됩니다.
이미지 v: 세포질에서 형광 염색을 보여주는 i의 고배율 이미지. 축척 막대, 100mm. (b) VA‑lip‑siRNAgp46‑Cy5 또는 lip‑siRNAgp46‑Cy5의 3회 주사 후 24시간에 수확된
래트 HS 세포, 쿠퍼 세포 및 간세포 풍부 분획을 항 α‑SMA‑FITC, 항‑랫트 CD168‑FITC 및 항‑알부민‑FITC(alb‑FITC) 각각, 유세포 분석기로 분석하였다. (c) 폐, 비장 및 망
막에서 Alexa 568‑표지된 항‑CD68 항체(적색) 및 siRNAgp46‑FAM(녹색)을 사용한 대식세포의 대표적인 면역형광 염색. VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM, lip‑siRNAgp46‑FAM 또
는 리포솜의 정맥주사 24시간 후 이들 기관의 조직학적 절편을 수집했습니다. 이 섹션의 형광 이미지는 공초점 레이저 현미경을 사용하여 얻었습니다. 축척 막대, 100mm. (a–c) 5
개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌습니다. (d) 래트에서 [3H]VA‑lip‑siRNAgp46의 대표적인 조직 생체분포 및 약동학 . DMN 처리 간경변 쥐(쥐 24일) 또는 정상 쥐
(그룹당 n=3) 에 꼬리 정맥을 통해 200mCi [3H]VA‑lip‑siRNAgp46을 단일 정맥 주사했습니다 . 조직 생체 분포는 24시간 후에 분석되었습니다. 데이터는 평균 ± sd(n =
3)를 나타냅니다. 삽입된 그림은 감염 후 지정된 시간에 혈액에 남아 있는 주입된 용량의 백분율을 보여줍니다. 각 점은 평균 ± sd(n = 3)를 나타냅니다.
gp46
0.8 0.8 **
β‑액틴 0.6 0.6
0.4 0.4
비 입술‑siRNAgp46
0.2 * 0.2
치료 후 일
0 0
012345 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
낮 낮
gp46
조직학적 분석
β‑액틴
0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w 0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w
SD 쥐 SD 쥐
DMN DMN
씨 주사 후 일
0.5 mg/kg ×2 /주,iv 1.0 0.75 mg/kg ×3 /주,iv 1.0
0 2345 7 률
존
생 률
존
생 **
gp46
0.8 0.8
**
β‑액틴 0.6 0.6
0.4 0.4
1.2
0.2 0.2
GAPDH
gp46/
1.0
0.8 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
0.6 낮 낮
0.4 VA‑립‑siRNAgp46 VA
0.2 입술‑siRNAgp46 siRNA
VA‑립‑siRNA무작위 PBS
0 VA 리포좀
0일 2일차3일차4일차5일차7일차
그림 3 간경변 쥐 생존에 대한 iv 주사된 VA‑lip‑siRNAgp46의 효과. ( a, b ) HS 세포에서 gp46 발현에 대한 siRNAgp46의 억제 효과 기간.
래트 pHS 세포를 VA‑lip‑siRNAgp46(a) 또는 lip‑siRNAgp46(b)으로 처리하였다. 30분에 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 지시된 시간에 gp46 및 b‑액틴(표준화 대조군)의 발현을 웨스턴
블롯팅으로 분석하였다. 3개의 독립적인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. ( c ) VA‑lip‑siRNAgp46 (siRNA 0.75 mg / kg, 24 일에 1 회 주사, n = 3)으로 처리 한 DMN‑ 간경변 쥐에서 gp46 발현의 시간
경과. 표시된 시간에 gp46의 발현을 분석하기 위해 western blot 분석(상단)과 정량적 실시간 PCR(하단)을 사용하였다. 간 gp46 mRNA 수준은 GAPDH mRNA에 비해 정량화되었습니다. 데이터는
3마리 쥐를 대표하는 분석에서 얻은 평균 ± sd입니다. (d) VA‑lip‑siRNAgp46을 0.1, 0.5 또는 0.75 mg/kg의 siRNA 용량으로 주 2회(n = 6/그룹) 또는 0.75 mg/kg을 3회 정맥 주사한 DMN 처리된 쥐
의 생존 주(그룹당 n=12). 대조군에서는 DMN 처리된 쥐에게 lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom, 비타민 A 결합 리포솜, 비타민 A, PBS(각 그룹에 대해 n = 6, 0.1, 0.5 또는 0.75 mg/kg을 1회 2회
주사했습니다. 주 3회 0.75 mg/kg의 각 그룹에 대해 n = 12) 또는 siRNAgp46(0.75 mg/kg siRNA의 그룹에 대해 n = 12, 주 3회). 수명표 분석은 Kaplan‑Meyer 플롯으로 표시됩니다. (*P o 0.05; **P
o 0.0001 대조군 쥐와 비교).
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siRNAgp46을 같은 나이의 비간경변성 쥐에게 주사하면 모든 장기에서 방사능 축적 표시되지 않음). 대조적으로, 매주 2회 VA‑lip‑siRNAgp46으로 처리된 쥐는 생존 시
이 상당히 감소했습니다. 이것은 VA‑lip‑siRNAgp46을 특이적으로 흡수한 HS 세포 간의 용량 의존적(0.1, 0.5, 0.75 mg/kg) 연장과 0.75 mg에서 훨씬 더 높은 생존
가 간경변증 간에서와 같이 정상 간에서 같은 정도로 증식하지 않았음을 나타냅니다. 율(83.3%; 5/6 쥐)을 보였습니다. /킬로그램. 0.75mg/kg 용량을 주당 3회 투여했
을 때 생존율은 100%(12/12)였습니다(그림 3d). 이는 gp46 발현이 72시간 동안
억제되었지만 siRNAgp46 처리 후 4일 이내에 회복되었다는 관찰과 일치하는 결과
VA‑lip‑siRNAgp46에 의한 gp46 억제 기간 24일에 DMN 쥐에 입니다. (그림 3a,c).
VA‑lip‑siRNAgp46을 정맥 주사했습니다(그림 3c). 랫트 pHS 세포와 DMN 랫트
의 간 모두 적어도 3일 동안 gp46 발현이 억제된 반면(도 3a, c), pHS 세포를 립
siRNAgp46으로 처리하면 gp46 발현이 억제되지 않았다(도 3b). DMN 처리된 쥐에서 siRNAgp46에 의한 간 섬유증의 해결 VA‑lip siRNAgp46(0.75
mg/kg)을 5회 투여한 DMN 처리된 쥐(33일)의 간 섬유증을 Azan‑Mallory(그림
4a) 및 콜라겐 I을 사용하여 검사했습니다. 염색(그림 4b). 콜라겐 염색을 위한 전산
화된 이미지 분석 스코어링에 의해 검출된 섬유화 영역은 대조군 표본보다 VA‑lip‑
siRNAgp46‑처리된 래트로부터의 표본에서 상당히 더 작았다(P < 0.001)(도 4c);
이러한 결과는 프로콜라겐 I형 및 TIMP‑1 mRNA에 대한 정량적 RT‑PCR 데이터와
VA‑lip‑siRNAgp46으로 iv 치료에 의한 DMN 쥐의 생존 우리는 일반적으로 치 일치하며, 이는 VA‑lip‑siRNAgp46 처리에 의해 mRNA 발현이 실질적으로 억제됨
명적인 DMN 치료에 노출된 쥐의 생존에 대한 siRNAgp46의 효과를 조사했습니다 을 보여주었다(도 4d). 마찬가지로, VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐의 히드록시프롤
(그림 3d). 이 일련의 실험에서 치료는 DMN의 12회 투여에 의해 간경화(24일) 유 린 수치는 대조군 쥐보다 현저히 낮았습니다(P<0.001)(그림 4e). VA‑lip‑
도 후 시작되었습니다(보충 그림 4). 매주 2회 PBS, 비타민 A, 비타민 A 결합 리포 siRNAgp46 처리된 쥐에서도 병리학적 병기, 즉 섬유증 및 구조적 변화가 명확하게
솜, VA‑lip siRNArandom 또는 lip‑siRNAgp46으로 처리된 대조군은 모두 DMN 억제되었습니다(그림 4f).
처리 후 52일 이내에 사망했습니다.
DMN 처리된 쥐는 복수, 위장 출혈 및 타르 배설물이 발생했기 때문에 간부전으 간 gp46 발현에 대한 siRNAgp46의 효과는 주입된 쥐의 간 표본에서 gp46에
로 사망한 것으로 보입니다(데이터 대한 염색에 의해 조사되었습니다.
VA‑lip‑siRNAgp46 및 VA‑lip‑siRNArandom으로 5회(33일). 다른 날), PBS, 비타민 A 단독, 비타민 A 결합 리포좀, VA lip‑siRNArandom 또
양성으로 염색된 영역(빨간색)은 전자에서 상당히 작았습니다(그림 4g). 웨스턴 블 는 lip‑siRNAgp46; (그룹당 n = 3). HS 세포와 겹치는 영역의 TUNEL 양성 세포
롯 분석 결과는 이 면역조직학적 관찰과 일치했습니다. gp46 밴드의 강도는 대조군 (a‑SMA 양성)는 VA‑lip‑siRNAgp46 대 VA lip‑siRNArandom으로 처리한 쥐에
보다 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐에서 더 약했습니다(그림 4h). 서 분명히 증가했습니다(보충 그림 5a 온라인). a‑SMA 양성 영역의 TUNEL 양성
세포(보충 그림 5b)는 대조군에 비해 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 쥐에서 유의하게
증가했습니다(P < 0.01).
간경변의 가역성은 각각 44일과 46일에 DMN 및 VA‑lip siRNAgp46 처리를 중
단한 47일 및 70일 쥐의 간 표본에서 조사되었습니다. 정상적인 간 구조의 거의 완
전한 복원이 47일 및 70일 랫트의 표본에서 관찰되었으며(그림 4i), 이는 간 조직 HS 세포 배양 실험에서 siRNAgp46에 의해 형질 감염된 쥐 pHS 세포의 세포
의 재생 능력을 나타냅니다. 사멸 핵에서 TUNEL 염색은 대조군 HS 세포보다 3 일 후에 더 컸습니다 (보충 그림
5c).
siRNAgp46으로 형질 감염된 HS 세포의 모든 핵의 약 절반 (48 ± 12 %)이 세포
사멸을 나타 냈습니다. 대조군 (P <0.01)에 비해 상당한 증가입니다 (보충 그림
siRNAgp46에 의한 래트 HS 세포에서의 세포사멸 유도 이러한 관 5d). 이러한 결과는 siRNAgp46이 HS 세포로부터 콜라겐의 분비를 억제할 뿐만 아
찰은 siRNAgp46 처리가 HS 세포의 세포사멸사를 유도할 수 있다는 추측을 하게 니라 세포사멸을 통해 섬유화 조직에서 HS 세포를 제거하여 조직에서 추가 콜라겐
하였다. Apoptosis는 VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 mg/kg을 매일 5회 주사한 축적을 차단함을 시사합니다.
DMN 처리된 쥐의 간 표본 33일에 TUNEL 염색으로 결정되었습니다.
PBS _ 버지니아
VA‑리포솜 씨 (%) 디 이자형
25 * * 일반 쥐
* * PBS 주입 DMN 래트(29일)
1,500 **
*
*
겐
라
콜
I
20 *
VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 DMN 쥐(3회 주입, *
29일) 1,250
15
VA‑lip‑siRNAgp46 처리된 DMN 쥐(5회 주입,
백
의
적
면
진
룩
얼율
분
1,000
33일) 린
롤
프
시
록
드
이
하 mg/
간)
(g
10 750
10
VA‑lip‑siRNA 랜덤 입술‑siRNAgp46 VA‑립‑siRNAgp46 9
5 500
8
**
PBS GAPDH
mRNA
율
비 /
7 250 *
0
6
0 PBS
5
VA VA ‑ 리포솜
4
Lip‑siRNAgp46 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐
3
VA‑립‑siRNA무작위
VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐
2
VA VA ‑ 리포좀 VA‑lip‑siRNA무작위 Lip‑siRNAgp46
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b PBS 버지니아
VA‑리포솜
10
6 * * * 프로콜라겐 I TIMP‑1
수
점
기
병
적
학
직
조 **
에프
5
4 VA‑립‑siRNA gp46
g VA‑립 siRNA무작위
삼
2
1
VA‑lip‑siRNA 랜덤 입술‑siRNAgp46 VA‑립‑siRNAgp46
0
PBS 버지니아
입술‑siRNAgp46
VA‑립‑siRNAgp46
VA ‑ 리포솜 VA‑lip‑siRNA무작위
시간 나
gp46 47일차 70일
그림 4 간경변 쥐의 간 조직학에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과. (a,b) VA‑lip‑siRNA
gp46(0.75 mg/kg의 siRNA 용량, 3회 주사)을 5회 주사한 간경변 쥐에서 얻은 Azan‑Mallory(a) β‑액틴
PBS
버지니아
0 1w 2w 3w 4w 5w 6w 7w 8w 9w 10w 11w
PBS
비 VA‑립‑siRNAgp46 씨
ㅏ 잔
아
SD 쥐 (%)
40
* *
CCI4 × 2/주 30
25
VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 백
의
역
영
된
색
염
I로
겐
라
콜 율
분
20 NS
mg/kg) × 2/주
15
조직학적/생화학적 분석
10
디 이자형 PBS VA‑립‑siRNAgp46 5
* * 겐
라
콜
I
0
1,500
(µg/
간)
g
린
롤
프
시
록
드
이
하 1,250
1,000
750
NS 일반 쥐
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
500
250
0
에프 세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈 mg/
µg/ dl
*
일반 쥐 l 1,200 *
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
1,000 1.0
800
600
그림 5 CCl4 처리된 간경변 쥐 에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과 . ( a ) CCl4 유발 간경변증이있는 쥐의 VA‑lip siRNAgp46 치 0.5
료 일정 . 간 및 혈액 샘플은 VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom(siRNA 용량 0.75mg/kg, 주 2회) 또는 PBS 단독(그룹당 n=6)의 400
6회 주사로 처리된 CCl4 쥐로부터 채취되었습니다 . ( b ) Azan‑Mallory 및 콜라겐 I 염색 간 섹션의 대표적인 현미경 사진. 축척 막대, 200 *
100mm. (c) 전산화된 이미지 분석에 의해 평가된 콜라겐 I 염색 양성 영역. 데이터는 각 그룹의 6마리 쥐(VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑
0 0
siRNA무작위, PBS 처리 및 정상 쥐)의 간 표본의 무작위로 선택된 6개의 저전력 필드에서 얻었으며 평균 ± sd(d) 하이드록시프롤린
함량을 나타냅니다. 간. 그룹당 6마리의 평균 ± sd.
일반 쥐 일반 쥐
PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
*P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46 처리된‑CCl4 쥐. NS, 중요하지 않음. (e) 공초점 레이저 현미경을 사용하여 Alexa 568‑
표지된 항‑gp46 항체(빨간색)로 염색된 gp46 및 DAPI(파란색)로 대조염색된 핵의 대표적인 면역형광 이미지를 얻었다. 축척 막대, 100mm. 3마리 쥐로 구성된 각 그룹의 결과는 본질적으로 비슷했습니
다. (f) 쥐의 혈청에서 총 빌리루빈 및 히알루로네이트 수준. 값은 각 그룹에 대한 평균 ± sd입니다(그룹당 n = 6). *P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46 처리‑CCl4 쥐.
siRNAgp46 처리가 간 기능에 미치는 영향 VA‑lip‑ siRNAgp46 처리된 간경변 쥐의 간에서의 콜라게나아제 활성 간경변 간에서의 콜
siRNAgp46(0.75 mg/kg, 격일로 5회)은 대조군 간경변 쥐에 비해 VA‑lip‑ 라게나아제 활성을 평가하기 위해, 우리는 DMN 쥐의 간 균질액에서 콜라게나아제
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siRNAgp46 처리 간경변 쥐에서 혈청 빌리루빈 및 히알루로네이트의 상승을 유의 활성을 측정했습니다. PBS 또는 VA‑lip‑siRNAgp46을 3회(29일) 주입한 DMN 처
하게 약화시켰습니다. 33일째, DMN 노출 동안(P < 0.01). 70일째에 DMN 쥐의 빌 리된 쥐의 콜라게나제 활성은 정상 간에서와 같이 높았고 VA‑lip‑siRNAgp46으로
리루빈, 히알루로네이트, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 알부민 수치는 VA‑ 5회 처리(33일) 후에도 높은 상태를 유지했습니다(보충 표 3 및 보충 방법).
lip siRNAgp46 처리로 거의 또는 완전히 정상화되었습니다(보충 그림 6 온라인).
67일
ㅏ 씨 디 에프
25 린
롤
프
시
록
드
이
하
1,000 NS
겐
라
콜역
영
된
색
염
해
대
I에율
분
백
의
20 NS 750
15 500
BDL
10 250
5 0
VA‑립‑siRNAgp46(0.75mg/kg) 0
PBS
일반 쥐
VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
조직학적/생화학적 분석 VA‑립‑siRNA무작위 겐
라
콜
I
비 45일차
VA‑lip‑siRNA 랜덤 VA‑립‑siRNAgp46 e
세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈
잔
아 µg/l mg/dl
3,500 14
**
3,000 12
2,500 10 g (%)
40 **
시간
**
1,500
2,000 * * 8
30 (µg/
간)
g
1,250
1,500 NS 6 25 린
롤
프
시
록
드
이
하
1,000 NS
20 750
1,000 4 겐
라
콜역
영
된
색
염
해
대
I에율
분
백
의
15 500
500 2 * 10 * 250
0 0 5 0
겐
라
콜
I PBS PBS 0
PBS
VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 일반 쥐
VA‑립‑siRNA무작위 VA‑립‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46 정상 쥐 PBS VA‑lip‑siRNA무작위 VA‑lip‑siRNAgp46
VA‑립‑siRNA무작위
나 세럼 히알루로네이트 혈청 빌리루빈
µg/ mg/dl
l 3,500 * * 14 **
3,000 12
2,500 10
그림 6 BDL 유발 간경변 쥐에 대한 VA‑lip‑siRNAgp46의 iv 주사 효과. ( a ) BDL 유발 간경변증이있는 쥐의 VA‑lip‑siRNAgp46 치 2,000 8
료 일정. BDL 36일째에 쥐를 VA‑lip‑siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom 또는 PBS(그룹당 n=10)로 처리했습니다. 주사는 1,500 6
*P<0.05 대 VA‑lip‑siRNAgp46‑처리된‑BDL 쥐.
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PBS‑ 또는 VA‑lip‑siRNA무작위 처리 그룹에서 섬유증과 동반된 현저한 담관 증 IFN‑a 유도와 같은 면역 반응을 피하기 위해 전사 인자 IRF3의 활성화를 손상시키는 것으
식에 의해 입증된 바와 같이 지속되었습니다. 로 나타난 2‑뉴클레오티드 3¢ 오버행이 있는 siRNA를 사용했습니다(참조 19). 또한, 우
리의 siRNA에는 IFN 유도에 역할을 하는 것으로 알려진 T7‑transcript(제조업체 정보)
논의 의 5¢ 삼인산이 포함되어 있지 않습니다20. 사실, VA‑lip siRNAgp46으로 처리된 쥐의
간 섬유증을 치료하기 위한 대부분의 접근법의 부적절한 표적 특이성으로 인해 임상적 사 순환계에서 간에서 IFN‑α mRNA 또는 TNF‑α 및 IL‑12의 상승은 없었습니다. 그러나 위
용에 대한 적합성이 제한되었습니다17. 특이성을 보장하기 위한 우리의 두 갈래 전략은 첫 에서 설명한 siRNA의 변형이 모든 면역 반응의 유발을 막지 못할 수 있으므로 본 연구에
째, siRNA로 콜라겐 특정 샤페론 분자(gp46)를 표적으로 삼고, 둘째, 비타민 A 결합 리 서 낮은 면역 활성화가 siRNA의 변형 외에도 RBP 수용체 매개 siRNA 흡수와 관련이
포솜을 사용하여 특히 콜라겐 생성 간 세포에 siRNA를 전달하는 것입니다. 이를 통해 있을 가능성이 있습니다. 구조.
DMN 또는 CCl4 치료 또는 담관 결찰 에 의한 간경변 유도와 관련된 쥐 모델에서 간 콜라
겐 침착을 해결할 수 있었습니다 . DMN 처리된 쥐의 생존은 용량 및 기간 의존 방식으로
연장되었으며, 이는 siRNAgp46 처리의 생물학적으로 특정한 효과를 나타냅니다.
siRNA로 처리된 HS 세포에서 in vitro 및 in vivo에서 최소 72시간 동안 억제 쥐) 단일 볼루스 주입을 위해 siRNA를 포함하는 리포솜을 용해합니다. 그러나 우리
된 상태를 유지했으며 생체 내 효능을 입증하기 위해 siRNA 주입 간격으로 는 200g 쥐(1:100 혈액량)에 대해 주사당 200ml만 사용했습니다. 이것은 우리 연
48‑72시간을 사용했습니다. 구에서 유체 역학적 압력이 siRNA의 생체 내 전달에 기여하지 않았지만 이전 연구에
우리 연구에서 사용된 생체 내 siRNA 용량(단일 주사당 0.75mg/kg)은 이전에 서는 siRNA가 적어도 어느 정도 유체 역학적 압력에 의해 강제로 변환되었을 수 있
생체 내 치료 효과가 있는 것으로 나타난 용량보다 적었습니다23‑25. 이것은 음을 시사합니다. 이것은 FAM에 대한 배경 형광이 약하고 간 이외의 조직에 대한 방
siRNAgp46을 HS 세포에 우선적으로 전달하기 위해 비타민 A 결합 리포좀을 사용 사성 비타민 A 결합 리포좀의 비특이적 분포가 낮은 이유를 설명할 수 있습니다.
하는 것과 관련이 있을 수 있습니다.
HS 세포에서 혈장 RBP/레티놀 복합체에서 세포 RBP로의 레티놀 전달이 수용체 구
동인지 또는 수동 확산26에 의해 진행되는지에 대해 오랫동안 논의되어 왔습니다. 가
장 최근의 연구 결과는 HS 세포 에 의한 레티놀의 수용체 유도 흡수와 일치 하지만 간 섬유증의 다양한 동물 모델이 연구되었습니다4,6,16,38,39.
세포막의 소수성 부분으로의 직접적인 위치 지정과 수용체 매개 흡수가 완전히 배제 우리는 DMN 모델이 진행성 및 치명적인 섬유증을 유발하기 때문에 주로 DMN 모델
되지는 않았습니다 . 에 초점을 맞추기로 결정했으며, 이를 통해 섬유증의 장기간 생존 해상도를 입증할
수 있었습니다. 이러한 결과 는 DMN 모델보다 경미한 비살상 CCl4 모델과 담즙 역
류를 지속적으로 자극하여 만성 간경변증을 유발하는 담관 결찰 모델을 모두 사용
수용체 기반 이론과 일관되게 혈장 RBP에 결합한 후 HS 세포에 의한 비타민 A 결 하여 이러한 결과를 확인하였다 . 세 가지 모델 모두에서 결과의 일관성은 다양한 유
합 리포솜의 특이적인 섭취는 RBP 농도 의존성, RBP 항체의 효과(그림 1e,f) 및 세 형의 간경변에 대한 접근 방식의 적용 가능성을 나타냅니다.
포 내 국소화 (그림 1h). 특히, 비타민 A 결합 리포솜을 정맥 주사한 쥐의 간경변 간
에서 siRNA‑FAM 형광은 주로 HS 세포(a‑SMA 염색으로 식별)가 있는 영역에서 관
찰되었지만 실질 영역에서는 관찰되지 않았습니다. FAM‑florescence와 HS 세포 이 모델에서, 섬유증의 퇴행은 siRNAgp46의 5회 주사 후 발생했지만, 동물은 여
가 병합된 영역이 비타민 A가 없는 리포좀으로 처리된 쥐보다 현저하게 더 크다는 발 전히 DMN, CCl4 또는 BDL 자극에 노출되었습니다 . 치료 효과의 기본 메커니즘은
견과 함께, 이는 비타민 A 결합 리포좀이 HS 세포에 특이적으로 흡수된다는 개념과 siRNAgp46(그림 1c,d,i)에 의한 콜라겐 분비의 억제와 콜라게나제 활성에 의한 미
도 양립할 수 있습니다. RBP 수용체에 의해 리 축적된 콜라겐의 부수적인 분해로 추측되며, 이는 섬유화가 거의 완전히 사라질
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NT 1626, 5¢‑P에서. CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGCAG‑3¢(센스), 5¢‑ 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 포함합니다. 2일 후, 세포
GCUAGAUUGGAAUAUAAAACUUGUGGAU‑3¢(안티센스); gp46(시퀀스 C), nt 1909에 찌꺼기 및 부착되지 않은 세포를 세척하여 제거하고 이후 매 2 또는 3일마다 배지를 교체하였
서 시작, 5¢‑CUAGAGCCAUUACAUUACAUUGACAAG‑3¢(센스); 5¢‑ 다. 순도는 현미경, 내인성 비타민 A 자가형광 및 데스민에 대한 단클론 항체를 사용한 면역세
UGUCAAUGUAAUGUAAUGGCUCUAGAU‑3¢(안티센스). siR NA‑랜덤, 5¢‑ 포화학 검사(1:25, Dako)로 평가했습니다. 세포 생존력은 트리판 블루 배제에 의해 검사되었
CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG‑3¢(센스) 및 5¢‑ 습니다. 세포 순도와 생존율 모두 95%를 초과했습니다. 분리 후 10일 동안 배양된 세포를 활
GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU‑3¢(안티센스). 성화된 HS 세포로 간주하였다33. 이전에 설명한 방법에 따라 쥐 피부 섬유아세포를 얻었다.
일부 실험의 경우, 센스 가닥의 5¢ 말단에 결합된 6¢‑카르복시플루오레세인(6‑FAM) 또는
시아닌 5(Cy‑5)가 있는 gp46 siRNA(서열 A)를 사용했습니다. 이러한 모든 서열은 BLAST 검
색에 의해 알려진 래트 mRNA와 서열 상동성을 공유하지 않는 것으로 나타났습니다. 인터페
론 반응 실험을 위해 Dharmacon, Inc.에서 구입한 인터페론 생성 유도 모티프를 포함하는 b‑
갈락토시다아제를 표적으로 하는 siRNA(siRNAbgal728)를 사용하였다15. 콜라겐 생산의 정량화. 래트 pHS 세포 또는 NRK 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에서
웰당 1×105의 밀도로 6‑웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다 . 24시간 배양(0일) 후,
NRK 세포를 Lipotrust를 사용하여 50nM의 siRNA로 형질감염시키고, 래트 pHS 세포를
siRNA의 형질감염. 제조사의 프로토콜에 따라 Lipotrust(Hokkaido System Science)를 VA‑lip‑siRNAgp46(50nM의 siRNA) 또는 VA‑lip‑siRNArandom(50nM의 siRNA)으로
사용하여 siRNA를 NRK 세포에 도입하였다. 처리하였다. . 1일째에 세포를 세척하고 웰에 침착된 콜라겐을 이전에 설명한 바와 같이 Sirius
red 염료(Biocolor)로 염색했습니다. 결합되지 않은 염료를 세척하여 제거하고 결합된 복합체
웨스턴 블롯 분석. 세포 또는 간 표본의 단백질 추출물을 4/20 SDS‑폴리아크릴아미드 겔로 분 를 0.5% 수산화나트륨에 용해시켰다. 콜라겐은 540nm에서 분광광도법으로 정량화되었고
해하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, HSP47(gp46)(Stressgen) 또는 b‑액틴(Cell 결과는 처리되지 않은 대조군의 백분율로 표시되었습니다.
Signaling)에 대한 항체로 조사한 다음, 퍼옥시다제 결합 항체를 다음과 같이 조사했습니다.
2차 항체(Oncogene Research Product). 마지막으로 ECL(Amer sham Life Science)
로 시각화했습니다.
VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM의 FACS 분석. 쥐 pHS 세포 또는 1차 피부 105 세포)를 다양한 농
siRNAgp46‑ 도의 RBP(0.07–1.4 mg/ml, 105 세포 SCIPAC)의 존재 하에 VA‑lip‑
콜라겐 합성 분석. NRK 세포의 콜라겐 합성은 프롤린 혼입 분석으로 평가되었습니다42. 간략 FAM(50 nM의 섬유아세포(1 siRNA))로 처리 하고 차단 분석을 위해, VA lip‑siRNAgp46을
하게, 10% FBS를 함유하는 배양 배지로 6‑웰 플레이트에 1×105개의 NRK 세포를 시딩하였 전에 1마리를 마우스 항‑RBP 항체(10 mg/ml, BD Pharmingen) 또는 음성 첨가하기
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다. 24시간 후, 세포를 Lipotrust를 사용하여 50 nM의 siRNAgp46으로 형질감염시키고 24 대조군 마우스 IgG1(10 mg/ml, Dako)로 30분 동안 처리하였다. ‑FAM.LI90 세포를 10%
시간 동안 배양하였다. FBS 존재 하에서 VA‑lip‑siRNAgp46‑FAM으로 처리하고 30분 동안 배양했습니다. 벡튼 디
그 후, 배지를 [2,3‑3 H]‑lL 프롤린(5 mCi/ml, NEN)을 포함하는 OPTI‑MEM으로 변경하였 킨슨).
다. 24시간 후, 배양 상등액의 200ml 분취량 2개를 각 웰에서 제거했습니다.
래트 HS 세포 및 피부 섬유아세포의 분리. 쥐 HS 세포는 pronase‑collagenase로 분해한 면역형광 연구를 위해 슬라이드에 장착된 간 절편을 단클론 항‑α‑SMA‑CY3 결합 항체
다음 Nycodenz 기울기에서 원심분리하여 분리했습니다. 그런 다음 세포를 DMEM에서 배양 (1:400, Sigma)로 처리했습니다. 다른 조직 절편은 항‑CD68 항체(1:100,
했습니다.
DAKO) Alexa Fluor 568 마우스 IgG1 라벨링 키트(Molecular Probes)로 25°C에서 2시 해당 4개의 치료 그룹으로 일정을 잡습니다. 또한, siRNAgp46(0.75 mg/kg 주 3회) 주사도
간 동안 미리 라벨링했습니다. 모든 슬라이드를 PBS로 세척하고 DAPI가 포함된 Prolong 수행했습니다(n=12).
Gold Antifade Reagent에 1분 동안 노출시켜 핵을 염색했습니다. 두 번째 실험 세트에서는 6개 그룹의 쥐(각 그룹당 n=12)를 조직학적 및 간 기능 평가에 사
Zeiss Axioskop 2 형광 현미경(Carl Zeiss MicroImaging)이 장착된 Radiance 2100 용했습니다. 각 그룹은 일주일에 세 번 PBS, 비타민 A 단독, 비타민 A 결합 리포좀, lip
Rainbow(Bio‑Rad)를 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 조직의 다색 형광 염색을 siRNAgp46, VA‑lip‑siRNArandom 또는 VA‑lip‑siRNAgp46(0.75 mg/kg siRNA)으
분석했습니다. 간 섹션의 형광 신호를 비디오 디지털화하고 임계값 설정(Photoshop 4.0; 로 처리되었습니다. 모든 주사는 1 ml/g 체중의 부피로 정상 압력 하에서 꼬리 정맥을 통해 제
Adobe)으로 총 염색 영역을 자동으로 설명하는 소프트웨어 프로그램으로 분석했습니다. 그런 공되었습니다. 쥐의 간을 10% 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀 포매 절편을 Azan‑
다음 이 영역을 NIH Image 1.62 소프트웨어로 정량화하고 각 섹션에서 병합된 노란색 영역 Mallory 염색 또는 항콜라겐 I 항체(1:100, Abcam)로 EnVision 시스템(Dako)을 사용하
과 전체 a‑SMA 염색 영역의 비율로부터 변환 효율을 계산했습니다. 영역은 각 간에서 표본당 여 제조업체의 지침에 따라 염색했습니다. , DakoLiquid DAB(diaminobenzidine) 기판‑
10개의 무작위로 선택된 고배율 필드(630)에서 평가되었습니다. Chromagen 시스템 키트가 이어집니다.
참고: 추가 정보는 Nature Biotechnology 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 22. Bartlett, DW & Davis, ME 살아있는 세포 및 살아있는 동물 생물 발광 영상에서 siRNA 매개 유전자 침묵의 동역
학에 대한 통찰력. 핵산 Res. 34, 322–333(2006).
감사의 말
23. Zimmermann, TS 외. 비인간 영장류에서 RNAi 매개 유전자 침묵. Nature 441, 111–114(2006).
이 작업은 YS에 과학 진흥을 위한 일본 협회의 원조 보조금에 의해 지원되
었습니다.
24. Yano, J. 외. 암 마우스 모델에서 small interfering RNA/cationic liposome complex의 항종양 활성. 클
린. 암 해상도 10, 7721–7726 (2004).
저자 기여 YS, K. Murase 및 JK는 25. Song, E. et al. Fas를 표적으로 하는 RNA 간섭은 전격성 간염으로부터 마우스를 보호합니다.
연구를 설계하고 실험을 수행하고 논문을 작성했습니다. MK, TS, YK, RT, KT, K. Miyanishi, Nat. 중간 9, 347–351(2003).
TM 및 TT가 실험을 수행하였다. YN은 연구를 설계하고 논문을 작성했으며 전체 프로젝트를 26. 꽃, DR 수퍼패밀리 너머: 리포칼린 수용체. 바이오킴. Biophys. Acta 1482, 327–336(2000).
http://www.nature.com/naturebiotechnology/에 온라인 게시됨 재인쇄 및 28. Senoo, H. et al. 쥐 간 실질 및 별 모양 세포에서 레티놀 결합 단백질의 내재화. J. Lipid Res. 31, 1229–1239
허가 정보는 http://npg.nature.com/reprintsandpermissions에서 온라인으로 제공됩니다. (1990).
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