Microbiota from Litopenaeus vannamei: digestive tract microbial community of

Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)

Abstract
Bacteria capable of producing different extracellular enzymes of potential
relevance in digestive processes were isolated from the stomach,
hepatopancreas and intestine of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. A
total of 64 strains with proteolytic activity were isolated and grouped into 16
clusters based on morphological characteristics: 4 groups were isolated from
the intestine; 5 from the hepatopancreas; and 7 from the stomach. Molecular
methods (16S rRNA gene amplification and sequencing) and phenotypic criteria
(Gram stain, catalase and oxidase tests, cell and colony morphology) were
used to identify strains, which corresponded
to Pseudoalteromonas and Vibrio genera. These genera are reported to form
part of the digestive tract microbial community in shrimp. Both genera were
isolated from all three tested tissues. One member of each morphologic group
was selected for analysis of the presence of amylases, lipases/esterases and
chitinases. Most of the strains had all the tested enzymes, indicating that the L.
vannamei digestive tract microbiotic flora includes groups which have the
potential to contribute to the degradation of dietary components.
Keywords: Shrimp, Microbiota, Digestion, Enzymatic activity, 16S

Draft Genome Sequence of Bacillus licheniformis CG-B52, a Highly Virulent

Bacterium of Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei), Isolated from a
Colombian Caribbean Aquaculture Outbreak

Abstract
Bacillus licheniformis strain CG-B52 was isolated as the etiological agent
producing a self-limited outbreak of high mortalities in commercial Litopenaeus
vannamei culture ponds on the Colombian Caribbean coast in 2005. Here, we
report its draft genome and three novel extrachromosomal elements that it
harbors.

Enhancing Ecoefficiency in Shrimp Farming through Interconnected Ponds

Abstract
The future development of shrimp farming needs to improve its ecoefficiency.
The purpose of this study was to evaluate water quality, flows, and nitrogen
balance and production parameters on a farm with interconnected pond design
to improve the efficiency of the semi-intensive culture of Litopenaeus
vannamei ponds. The study was conducted in 21 commercial culture ponds
during 180 days at densities of 30–35 ind m−2 and daily water exchange <2%.
Our study provides evidence that by interconnecting ponds nutrient recycling is
favored by promoting the growth of primary producers of the pond as
chlorophyll a. Based on the mass balance and flow of nutrients this culture
system reduces the flow of solid, particulate organic matter, and nitrogen
compounds to the environment and significantly increases the efficiency of
water (5 to 6.5 m3 kg−1 cycle−1), when compared with traditional culture systems.
With this culture system it is possible to recover up to 34% of the total nitrogen
entering the system, with production in excess of 4,000 kg ha −1 shrimp. We
believe that the production system with interconnected ponds is a technically
feasible model to improve ecoefficiency production of shrimp farming.

Microbiota de Litopenaeus vannamei: comunidad microbiana del tracto

digestivo de camarones blancos del Pacífico (Litopenaeus vannamei)
Resumen
Las bacterias capaces de producir diferentes enzimas extracelulares de
relevancia potencial en los procesos digestivos se aislaron del estómago, el
hepatopáncreas y el intestino del camarón blanco del Pacífico Litopenaeus
vannamei. Se aislaron un total de 64 cepas con actividad proteolítica y se
agruparon en 16 grupos según las características morfológicas: se aislaron 4
grupos del intestino; 5 del hepatopáncreas; y 7 del estómago. Se utilizaron
métodos moleculares (amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA) y
criterios fenotípicos (tinción de Gram, pruebas de catalasa y oxidasa,
morfología de células y colonias) para identificar cepas, que correspondían a
los géneros Pseudoalteromonas y Vibrio. Se informa que estos géneros forman
parte de la comunidad microbiana del tracto digestivo en camarones. Ambos
géneros fueron aislados de los tres tejidos probados. Se seleccionó un
miembro de cada grupo morfológico para el análisis de la presencia de
amilasas, lipasas / esterasas y quitinasas. La mayoría de las cepas tenían
todas las enzimas probadas, lo que indica que la flora microbiótica del tracto
digestivo de L. vannamei incluye grupos que tienen el potencial de contribuir a
la degradación de los componentes de la dieta.
Palabras clave: camarones, microbiota, digestión, actividad enzimática, 16S

Proyecto de secuencia del genoma de Bacillus licheniformis CG-B52, una

bacteria altamente virulenta del camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus
vannamei), aislada de un brote de acuicultura en el Caribe colombiano
Resumen
La cepa de Bacillus licheniformis CG-B52 se aisló como el agente etiológico
que produce un brote autolimitado de altas mortalidades en estanques
comerciales de cultivo de Litopenaeus vannamei en la costa caribe colombiana
en 2005. Aquí, presentamos su borrador del genoma y tres nuevos elementos
extracromosómicos que alberga .
Mejora de la ecoeficiencia en el cultivo de camarones a través de estanques
interconectados

Resumen
El desarrollo futuro de la camaronicultura necesita mejorar su ecoeficiencia. El
propósito de este estudio fue evaluar la calidad del agua, los flujos y el
equilibrio de nitrógeno y los parámetros de producción en una granja con
diseño de estanques interconectados para mejorar la eficiencia del cultivo
semiintensivo de los estanques Litopenaeus vannamei. El estudio se realizó en
21 estanques de cultivo comerciales durante 180 días a densidades de 30–35
ind m − 2 e intercambio diario de agua <2%. Nuestro estudio proporciona
evidencia de que al interconectar los estanques, el reciclaje de nutrientes se ve
favorecido al promover el crecimiento de los productores primarios del
estanque como clorofila a. Basado en el balance de masa y el flujo de
nutrientes, este sistema de cultivo reduce el flujo de sólidos, partículas
orgánicas y compuestos de nitrógeno al medio ambiente y aumenta
significativamente la eficiencia del agua (5 a 6.5 m3 kg − 1 ciclo − 1), en
comparación con sistemas culturales tradicionales. Con este sistema de cultivo
es posible recuperar hasta el 34% del nitrógeno total que ingresa al sistema,
con una producción de más de 4.000 kg ha − 1 de camarones. Creemos que el
sistema de producción con estanques interconectados es un modelo
técnicamente factible para mejorar la producción ecoeficiente de la
camaronicultura.

Abstract
Bacillus aquimaris SH6 spores produce carotenoids that are beneficial to white-
leg shrimp (Litopenaeus vannamei) health. However, the optimal dose and
mechanisms behind these effects are not well understood. We investigated the
fate of SH6 spores in the gut of L. vannamei. Shrimp were divided into six
groups administrated with either feed only (negative control) or SH6 spores at 5
× 106 CFU/g pellet (high dose, SH6 spore-H group), 1 × 10 6 CFU/g pellet
(medium dose, SH6 spore-M group), 2 × 105 CFU/g pellet (low dose, SH6
spore-L group), astaxanthin at 0.5 mg/g pellet (Carophyll group), or carotenoids
from SH6 vegetative cells at 5 μg/g pellet (SH6 carotenoid group). The growth
rate was highest in SH6 spore-H (3.38%/day), followed by SH6 spore-M
(2.84%/day) and SH6 spore-L (2.25%/day), which was significantly higher than
the control (1.45%/day), Carophyll (1.53%/day) or SH6 carotenoid (1.57%/day)
groups. The astaxanthin levels (1.9–2.0 μg/g shrimp) and red-colour scores
(21–22) in SH6 spore-H/M were higher than the control (astaxanthin: 1.2 μg/g
shrimp; red score: 20) or SH6 spore-L, but lower than the Carophyll and SH6
carotenoids. Feeding with medium and high doses of SH6 spores after 28 days
resulted in respective 1.3-2-fold increases in phenol oxidase activity and 8–9
fold increases in Rho mRNA expression compared to the control and low dose
group. The live-counts of SH6 in the gut gradually increased during the 28-day
feeding period with SH6 spores at different concentrations, starting from 4.1,
8.2, and 5.4 × 104 CFU/g gut at day 1 and reaching 5.3, 5.1, and 4.4 ×
105 CFU/g gut in the SH6-H/M/L groups, respectively, at day 28. Gut microbiota
became more diversified, resulting in a 2-8-fold increase in total bacterial live-
counts compared to the controls. SH6 spore germination was detected by
measuring the mRNA expression of a specific sequence coding for SH6
amylase at 4 h, reaching saturation at 24 h. Our results confirm that SH6 spores
colonize and germinate in the gut to improve the microbial diversity and boost
the immune system of shrimp, exhibiting beneficial effects at >1 × 10 6 CFU/g
pellet.
Resumen
Las esporas de Bacillus aquimaris SH6 producen carotenoides que son
beneficiosos para la salud del camarón de patas blancas (Litopenaeus
vannamei). Sin embargo, la dosis óptima y los mecanismos detrás de estos
efectos no se conocen bien. Investigamos el destino de las esporas SH6 en el
intestino de L. vannamei. Los camarones se dividieron en seis grupos
administrados con alimento solo (control negativo) o esporas SH6 a 5 × 106
UFC / g de pellets (dosis alta, grupo de esporas SH6-H), 1 × 106 UFC / g de
pellets (dosis media, esporas SH6 -M grupo), 2 × 105 UFC / g de pellets (dosis
baja, grupo de esporas L-SH6), astaxantina a 0.5 mg / g de pellets (grupo
Carophyll), o carotenoides de células vegetativas SH6 a 5 μg / g de pellets
(SH6 carotenoide grupo). La tasa de crecimiento fue más alta en SH6 espora-H
(3.38% / día), seguido de SH6 espora-M (2.84% / día) y SH6 espora-L (2.25% /
día), que fue significativamente mayor que el control (1.45 % / día), grupos de
carofilo (1.53% / día) o carotenoide SH6 (1.57% / día). Los niveles de
astaxantina (1.9–2.0 μg / g de camarones) y los puntajes de color rojo (21–22)
en SH6 spore-H / M fueron más altos que el control (astaxantina: 1.2 μg / g de
camarones; puntaje rojo: 20) o SH6 espora-L, pero inferior a los carotenoides
Carophyll y SH6. La alimentación con dosis medias y altas de esporas SH6
después de 28 días dio como resultado aumentos respectivos de 1.3-2 veces
en la actividad de la fenol oxidasa y aumentos de 8-9 veces en la expresión de
ARNm de Rho en comparación con el grupo control y de dosis baja. Los
recuentos vivos de SH6 en el intestino aumentaron gradualmente durante el
período de alimentación de 28 días con esporas de SH6 a diferentes
concentraciones, comenzando desde 4.1, 8.2 y 5.4 × 104 UFC / g en el día 1 y
llegando a 5.3, 5.1 y 4.4 × 105 UFC / g intestino en los grupos SH6-H / M / L,
respectivamente, en el día 28. La microbiota intestinal se diversificó más, lo que
resultó en un aumento de 2-8 veces en el recuento total de bacterias en
comparación con los controles. La germinación de esporas SH6 se detectó
midiendo la expresión de ARNm de una secuencia específica que codifica la
amilasa SH6 a las 4 h, alcanzando la saturación a las 24 h. Nuestros resultados
confirman que las esporas SH6 colonizan y germinan en el intestino para
mejorar la diversidad microbiana y estimular el sistema inmunológico de los
camarones, exhibiendo efectos beneficiosos a> 1 × 106 UFC / g de pellets.
Abstract
In this study, potential probiotic strains were isolated from fermented pickles
based on antagonistic activity against two shrimp pathogens (Vibrio
harveyi and Vibrio parahaemolyticus). Two strains L10 and G1 were identified
by biochemical tests, followed by16S ribosomal RNA gene sequence analysis
as Bacillus subtilis, and characterized by PCR amplification of repetitive
bacterial DNA elements (Rep-PCR). Subsequently, B. subtilis L10 and G1
strains were tested for antibacterial activity under different physical conditions,
including culture medium, salinity, pH and temperature using the agar well
diffusion assay. Among the different culture media, LB broth was the most
suitable medium for antibacterial production. Both strains showed the highest
level of antibacterial activity against two pathogens at 30 °C and 1.0% NaCl.
Under the pH conditions, strain G1 showed the greatest activity against V.
harveyi at pH 7.3–8.0 and against V. parahaemolyticus at pH 6.0–8.0, whereas
strain L10 showed the greatest activity against two pathogens at pH 7.3. The
cell-free supernatants of both strains were treated with four different enzymes in
order to characterize the antibacterial substances against V. harveyi. The result
showed considerable reduction of antibacterial activity for both strains,
indicating the proteinaceous nature of the antibacterial substances. A wide
range of tolerance to NaCl, pH and temperature was also recorded for both
strains. In addition, both strains showed no virulence effect in juvenile
shrimp Litopenaeus vannamei. On the basis of these results and safety of
strains to L. vannamei, they may be considered for future challenge
experiments in shrimp as a very promising alternative to the use of antibiotics.
Keywords: antibacterial activity, aquaculture, Bacillus subtilis, probiotics,
shrimp, vibriosis

Resumen

En este estudio, se aislaron cepas probióticas potenciales de encurtidos

fermentados en función de la actividad antagonista contra dos patógenos de

camarones (Vibrio harveyi y Vibrio parahaemolyticus). Se identificaron dos

cepas L10 y G1 mediante pruebas bioquímicas, seguidas por análisis de

secuencia del gen de ARN ribosómico 16S como Bacillus subtilis, y

caracterizadas por amplificación por PCR de elementos de ADN bacterianos

repetitivos (Rep-PCR). Posteriormente, se analizaron las cepas de B. subtilis

L10 y G1 para determinar la actividad antibacteriana en diferentes condiciones

físicas, incluyendo medio de cultivo, salinidad, pH y temperatura utilizando el

ensayo de difusión en pocillos de agar. Entre los diferentes medios de cultivo,

el caldo LB fue el medio más adecuado para la producción antibacteriana.

Ambas cepas mostraron el mayor nivel de actividad antibacteriana contra dos

patógenos a 30 ° C y NaCl al 1,0%. En condiciones de pH, la cepa G1 mostró

la mayor actividad contra V. harveyi a pH 7.3–8.0 y contra V. parahaemolyticus

a pH 6.0–8.0, mientras que la cepa L10 mostró la mayor actividad contra dos

patógenos a pH 7.3. Los sobrenadantes libres de células de ambas cepas se

trataron con cuatro enzimas diferentes para caracterizar las sustancias

antibacterianas contra V. harveyi. El resultado mostró una reducción

considerable de la actividad antibacteriana para ambas cepas, lo que indica la

naturaleza proteica de las sustancias antibacterianas. También se registró un

amplio rango de tolerancia al NaCl, pH y temperatura para ambas cepas.

Además, ambas cepas no mostraron efecto de virulencia en camarones

juveniles Litopenaeus vannamei. Sobre la base de estos resultados y la

seguridad de las cepas de L. vannamei, pueden considerarse para futuros

experimentos de desafío en camarones como una alternativa muy prometedora

para el uso de antibióticos.

Palabras clave: actividad antibacteriana, acuicultura, Bacillus subtilis,

probióticos, camarones, vibriosis.