Thực Hành VI Sinh - Chỉnh Sửa

Trường Đại học Nam Cần Thơ Khoa Dược
MỤC LỤC
BÀI 1. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP
NHUỘM VI KHUẨN......................................................................................................2
BÀI 2. PHƯƠNG PHÁP LẤY BỆNH PHẨM, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN BỆNH
PHẨM CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH...........................................................8
BÀI 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN....................13
BÀI 4. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA VI KHUẨN.........................22
BÀI 5. KHÁNG SINH ĐỒ...............................................................................................30
BÀI 6. CHUẨN ĐOÁN TỤ CẦU KHUẨN....................................................................34
BÀI 7. CHUẨN ĐOÁN LIÊN CẦU KHUẨN VÀ PHẨY KHUẨN TẢ........................36
BÀI 8. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP
CHẨN ĐOÁN VIRUS.....................................................................................................40
Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 1

BÀI 1
PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT VÀ CÁC
PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN
MỤC TIÊU
1. Sinh viên nắm được các phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật.
2. Sinh viên nắm được nguyên tắc nhuộm vi khuẩn.
3. Sinh viên thực hiện làm tiêu bản và nhuộm vi khuẩn.
NỘI DUNG
I. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN
1. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời
1.1.1. Cách làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí.
Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
1.1.2. Cách làm tiêu bản giọt treo
- Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.
-Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
1.1.3. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu
a. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được
pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi
nhuộm màu.
b. Cách nhuộm
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính.
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.

+ Đậy lamell kính lên giọt dịch.

+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) và (x 40)
2. Phương pháp làm tiêu bản cố định
2.1. Làm vết bôi
2.2. Cố định vết bôi
Các hai cách cố định:
+ Cố định bằng nhiệt
+ Cố định bằng hoá chất
Cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu
trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.
Người ta thường dùng các hoá chất là rượu và acetone để cố định vết bôi.
Cách cố định: Có thể thực hiện một trong những cách sau
+ Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 95o ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút. Với rượu
metylic ngâm khoảng 2 - 5 phút.
+ Ngâm vết bôi vào dung dịch acetone trong 5 phút.
+ Nhỏ vài giọt rượu 90 – 95 o lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy
vài lần rồi để khô.
2.3. Nhuộm màu tiêu bản cố định
a. Nguyên tắc
- Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với
thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.
- Tuỳ theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành
phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.
- Có 2 cách nhuộm chính :
+ Nhuộm đơn: Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.
+ Nhuộm kép: Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.
b. Cách nhuộm
- Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ
tinh).
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1-2 phút
- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy
nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra khôn còn màu nữa.

- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn.
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (X40) rồi chuyển sang vật kính (X100) dùng dầu
soi.
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI KHUẨN
1. Các loại phẩm nhuộm
Phản ứng dùng để nhuộm tế bào vi khuẩn thường là phẩm màu tổng hợp. Chúng
thường ở dạng muối trong đó có một ion mang màu. Dựa trên bản chất của ion mang
màu, phẩm nhuộm được chia làm 3 loại:
 Phẩm kiềm có ion mang màu có điện tích dương. Ví dụ: Xanh methylen, tím
gentian, tím tinh thể
 Phẩm màu acid có ion mang màu mang điện tích âm. Ví dụ: Eosinat natri,
nigrosin, đỏ congo…
 Phẩm màu trung hòa: là muối phức do sự kết hợp phẩm kiềm và phẩm acid. Ví
dụ: Eosinat + xanh methylen
2. Cơ chế nhuộm màu
Sự nhuộm màu có thể do tác động của phẩm nhuộm lên mặt ngoài hay bên trong
tế bào vi khuẩn.
Protein (và acid nucleic) của vi khuẩn có thể phối hợp với K+, Na+ của môi trường
cho dạng Na+VK- và sự nhuộm màu là sự trao đổi ion.
Ví dụ: BM+Cl- + VKNa+ → VKBM+ + NaCl
3. Các phương pháp nhuộm
3.1. Chuẩn bị mẫu nhuộm
- Đặt một giọt nước trên lamell, rồi dùng que cấy lấy một khóm vi khuẩn đặt vào
góc giọt nước để đưa một lượng vi khuẩn vừa đủ lên lamell. Nếu là huyền trọc vi khuẩn
thì dùng trực tiếp không cần giọt nước.
- Dùng que cấy trải vi khuẩn trên lamell cho đều. Để khô tự nhiên.
- Khi đã khô mới cố định mẫu bằng cồn hay hơ nóng nhẹ, khi đó vi khuẩn sẽ chết
và bám trên lamell để sẵn sàng cho việc nhuộm.

3.2. Phương pháp nhuộm ngược

Nhuộm ngược là nhuộm môi trường xung quanh mà không nhuộm vi khuẩn, khi
đó vi khuẩn không màu, chiết quang nổi rõ trên nền màu nhuộm. Phương pháp này giúp
nhận định rõ ràng hình dạng thực của vi khuẩn và vi khuẩn không bị biến dạng bởi tác
động nhiệt, dung môi như các phương pháp nhuộm khác.
 Nguyên tắc: tế bào vi khuẩn có điện tích âm, nếu ta dùng một thuốc nhuộm có tính
acid, ion mang màu mang điện tích âm (A -) thì màu không bám được vào vi khuẩn mà
bám vào nền.
 Mục đích: Quan sát hình dạng, cách sắp xếp
 Tiến hành: vi khuẩn được trộn trên lamell với một phẩm nhuộm acid như Nigrosin
(mực tàu) hay đỏ Congo. Sau đó hỗn hợp được tạo vết trải mỏng trên mặt lamell rồi để
cho khô tự nhiên. Quan sát vật kính 100X.
3.3. Nhuộm đơn
Nhuộm vi khuẩn bằng một loại phẩm nhuộm như: tím gentian, xanh methylen,
fuchsin,.. trong 5 phút. Rửa nước.

3.4. Nhuộm Gram

a. Nguyên tắc
Phương pháp nhuộm Gram căn cứ vào nguyên tắc: chất rượu (alcol) sẽ tẩy được
màu của hợp chất “Tím Gentian – Iod” của vi khuẩn Gram âm.
Vi khuẩn chia làm 2 nhóm: Gram dương hoặc Gram âm tùy theo sự đáp ứng của
vi khuẩn đối với phương pháp nhuộm Gram (tên của nhà phát minh ra phương pháp
nhuộm vi khuẩn). Sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram âm và Gram dương tùy thuộc vào sự
khác biệt về thành phần hóa học trong sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Trong tế bào vi
khuẩn Gram dương có 40 lớp peptidoglycan, chiếm đến 50% vật liệu cấu tạo vách, còn vi
khuẩn Gram âm chỉ có 1 hoặc 2 lớp peptidoglycan, chiếm từ 5 – 10% vật liệu cấu tạo
vách.
b. Vật liệu
- Lam sạch
- Que cấy vòng
- Bộ thuốc nhuộm Gram
- Đèn cồn
- Giấy thấm
c. Thực hiện
- Làm phết vi khuẩn
- Nhuộm với tím gentian trong trong 30 giây – rửa bằng nước
- Cố định màu bằng Lugol trong 30 giây – rửa bằng nước
- Tẩy bằng cồn 95o trong 30 giây – rửa bằng nước
- Nhuộm lại bằng đỏ Safranin trong 30 giây – rửa bằng nước, làm khô
Nhuộm Gram là một kỹ thuật quan trọng, kết quả nhuộm Gram chia vi khuẩn thành hai
loại
 Vi khuẩn Gram dương: giữ được màu của phức hợp tím gentian – iod sau khi tẩy
cồn nên giữ được màu tím.
 Vi khuẩn Gram âm: không giữ được phức hợp tím gentian – iod sau khi tẩy cồn nên
bắt màu hồng của fuchsin khi nhuộm lại.
 Cơ chế nhuộm
- Khi nhuộm với tím Gentian cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) đều bắt màu do tím
gentian và iod tạo phức hợp trong tế bào chất vi khuẩn. Tuy nhiên, vì vi khuẩn Gram
âm có nhiều lipid trong thành tế bào nên khi tẩy bằng cồn lipid sẽ bị lấy đi và để lại

các lỗ trên thành tế bào. Từ đó phức hợp màu tím gentian bị trôi ra làm vi khuẩn
gram âm mất màu nhanh hơn vi khuẩn gram dương. Khi nhuộm lại bằng fuchsin vi
khuẩn sẽ bắt màu mới nên có màu hồng. Ngược lại vi khuẩn Gram dương ít có lipid
nên giữ được màu của tím gentian do đó không bắt màu fuchsin nữa.
- Giả thuyết khác cho rằng vi khuẩn Gram dương có nhiều peptidoglycan trong thành
tế bào nên bắt giữ được phức hợp tím gentian – iod, còn vi khuẩn Gram âm thì để
mất phức hợp này khi tẩy cồn.
d. Đọc kết quả
Nhỏ một giọt dầu Cèdre lên phết nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính
dầu (100X). Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu
hồng.
3.5. Nhuộm kháng acid – cồn
Một số vi khuẩn nhất là nhóm Mycobacterium chứa nhiều lipid đặc biệt ở thành tế
bào vì vậy rất khó nhuộm màu bằng các phương pháp nhuộm thông thường. Sự nhuộm
màu sẽ dễ dàng hơn với tác nhân nhuộm màu mạnh, nồng độ cao hoặc tác động của nhiệt.
Tuy nhiên, khi vi khuẩn đã bắt màu lại khó tẩy bởi các tác nhân tẩy mạnh như cồn pha
acid loãng, trong khi các vi khuẩn khác bị mất màu nhanh chóng, do vậy nhóm vi khuẩn
này được gọi là vi khuẩn kháng acid-cồn. Phương pháp này dùng để phân biệt vi khuẩn
kháng acid – cồn với các vi khuẩn thường, ví dụ được dùng để tìm vi khuẩn lao.
a. Cách tiến hành
- Nhuộm bằng Kinyoun Carbol fuchsin (nồng độ cao gấp 10 lần nhuộm Gram) trong 3
phút – rửa bằng nước.
- Tẩy màu bằng acid – cồn trong 30 giây – rửa bằng nước – làm khô.
- Nhuộm lại bằng xanh methylen trong 3 phút – rửa bằng nước.
b. Kết quả
Vi khuẩn kháng acid – cồn bắt màu hồng còn vi khuẩn không kháng acid - cồn bắt
màu xanh.
YÊU CẦU THỰC HÀNH
Quan sát sự di động của vi khuẩn E.coli và Shigella bằng phương pháp giọt ép. Mô tả.
Nhuộm Corynebacterium diphteriae bằng phương pháp nhuộm đơn với xanh methylen
và quan sát, vẽ hình.
Nhuộm Gram và vẽ hình vi khuẩn E.coli, Shigella và Corynebacterium diphteriae.

BÀI 2
PHƯƠNG PHÁP LẤY BỆNH PHẨM, BẢO QUẢN
VÀ VẬN CHUYỂN BỆNH PHẨM CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH
MỤC TIÊU
1. Sinh viên nắm được nguyên tắc thu nhận bệnh phẩm.
2. Sinh viên biết cách thu nhận, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm.
NỘI DUNG
I. CÁC PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU BỆNH PHẨM
1. Lấy mẫu dịch não tủy
Mẫu xét nghiệm cần phải được lấy do các bác sĩ hoặc những người có kinh
nghiệm. Dịch não tủy được dùng để chẩn đoán virus, vi khuẩn, ký sinh trùng và viêm
màng não do nấm.
1.1. Chuẩn bị dụng cụ
Khay để chọc dịch, gồm:
- Dụng cụ vô khuẩn: găng tay, bông thấm nước, gạc.
- Gây tê vùng: kim và bơm tiêm.
- Sát trùng da: povidon iodin 10% hoặc cồn y tế 70%.
- 6 tuýp vô trùng loại nhỏ, có nắp xoắy và giá đựng tuýp.
- Máy đo áp lực nước.
- Kính hiển vi quang học và lam kính.
1.2. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm
Chỉ có những người có kinh nghiệm mới được tham gia lấy dịch não tủy. Dịch não
tủy được lấy và chuyển trực tiếp vào các tuýp có nắp vặn. Nếu bệnh phẩm không được
chuyển nhanh chóng thì các tuýp riêng nên được tập trung để cho quy trình xử lý virus và
vi khuẩn.
1.3. Vận chuyển mẫu
Vận chuyển tới phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt.
Mẫu dịch não tủy cho xét nghiệm vi khuẩn được vận chuyển trong điều kiện nhiệt
độ môi trường, nói chung là không cần môi trường vận chuyển. Không được để đông đá
vì rất nhiều tác nhân gây bệnh sẽ không tồn tại trong điều kiện nhiệt độ thấp.

Mẫu dịch não tủy cho phân lập virus không cần môi trường vận chuyển. Chúng có
thể vận chuyển ở điều kiện 4 - 8oC, thời gian trên 48 giờ, hoặc - 70oC cho thời gian kéo
dài hơn.
2. Lấy mẫu phân
Các mẫu phân được dùng để chẩn đoán vi sinh vật rất hiệu quả nếu được thu thập
ngay sau khi bệnh nhân bị tiêu chảy cấp (với virus ≤ 48 giờ và vi khuẩn < 4 ngày) nên lấy
trước khi điều trị kháng sinh. Có thể lấy từ 2 - 3 mẫu phân chia ra cho các ngày. Phân là
mẫu xét nghiệm ưu tiên cho nuôi cấy vi khuẩn, virus và ký sinh trùng. Tăm bông trực
tràng được dùng để lấy phân ở trẻ em và tăm bông trực tràng không khuyến cáo để lấy
phân cho chẩn đoán virus.
2.1. Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Hộp chứa phân phải sạch, khô và có nắp vặn.
- Chuẩn bị môi trường vận chuyển vi khuẩn thích hợp cho tăm bông trực tràng:
CARRY – BLAIR.
- Hộp vận chuyển phân để chán đoán ký sinh trùng: dung dịch formalin 10%,
polyvinyl alcohol (PVA).
2.2. Phương pháp lấy mẫu phân
- Lấy mẫu phân tươi (5 ml dung dịch hoặc 5 gram phân đặc) đưa vào hộp hoặc tuýp
bảo quản.
- Dán nhãn.
Phương pháp lấy mẫu phân bằng tăm bông trực tràng (ở trẻ em)
- Tăm bông phải được làm ẩm bằng nước muối vô khuẩn.
- Đưa chóp tăm bông vào qua cơ thắt hậu môn rồi xoay nhẹ nhàng.
- Lấy tăm bông ra và kiểm tra chắc chắn đầu tăm bông đã có dính phân.
- Đưa tăm bông vào tuýp vô khuẩn hoặc hộp bảo quản có chứa môi trường thích hợp
cho vận chuyển virus hoặc vi khuẩn.
- Bẻ gãy phần trên cùng của cán tăm bông không chạm vào tuýp, sau đó vặn chặt nắp
lại.
- Dán nhãn lên tuýp.
2.3. Vận chuyển mẫu xét nghiệm
Mẫu phần cần được vận chuyển ở điều kiện 4 - 8oC. Số lượng vi khuẩn có thể
giảm đáng kể nếu mẫu xét nghiệm không được xử lý trong vòng 1 - 2 ngày sau khi được
thu thập. Vi khuẩn Shigella có nhạy cảm đặc biệt khi nhiệt độ tăng lên.

Mẫu xét nghiệm để kiểm tra ký sinh trùng thì nên cho vào dung dịch formalin 10%
hoặc PVA (3 phần phân/1 phần bảo quản). Vận chuyển ở điều kiện nhiệt độ môi trường,
trong túi nilong bịt kín miệng.
2.4. Lấy mẫu xét nghiệm từ đường hô hấp
Mẫu xét nghiệm được lấy từ trên hoặc dưới bộ máy đường hô hấp là còn phụ
thuộc vào vị trí nhiễm trùng. Căn nguyên vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp trên (virus và
vi khuẩn) thường được phân lập từ bệnh phẩm họng hoặc tỵ hầu (Streptococcus,
Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae...). Và căn nguyên gây bệnh đường hô hấp
dưới thường phân lập được từ mẫu xét nghiệm đờm (Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae....)
Khi viêm thanh quản cấp, nếu chúng ta không lấy mẫu xét nghiệm hầu họng hoặc
tỵ hầu để kiểm tra thì có thể từ đó dẫn đến tiến triển làm tắc nghẽn đường hô hấp.
2.4.1. Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Môi trường vận chuyển vi khuẩn và virus.
- Tăm bông hoặc loại có cán bằng kim loại, mềm có đầu là sợi mềm đặc biệt.
- Đè lưỡi.
- Dụng cụ banh mũi.
- Máy hút dịch hoặc bơm tiêm loại 20 - 50 ml.
- Tuýp vô khuẩn có nắp vặn.
2.4.2. Mẫu xét nghiệm lấy từ đường hô hấp trên
- Dùng dụng cụ đè lưỡi để đè lưỡi xuống. Dùng đèn có nguồn sáng mạnh soi vào vị trí
có viêm hoặc xuất tiết sau tỵ hầu.
- Dùng tăm bông chà sát nhẹ mặt sau và trước của hốc amidal, sau lưỡi gà rồi kéo ra
không được chạm vào lưỡi, răng hoặc thành trong của má và đưa vào tuýp đựng môi
trường vận chuyển có nắp vặn.
- Bẻ đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và vặn chắc nắp.
- Dán nhãn trên hộp đựng mẫu xét nghiệm.
- Hoàn thành các mẫu yêu cầu của phòng thí nghiệm.
a. Lấy mẫu qua đường mũi
- Để bệnh nhân ngồi ở tư thế thật thoải mái, hơi ngả đầu ra phía sau và đưa banh mũi
vào.
- Dùng loại tăm bông có cán được làm bằng kim loại mỏng, mềm, không gỉ vào qua
banh mũi, song song với sàn mũi và không hướng đi lên. Sau đó bẻ cong dây kim loại
và đưa vào trong cổ họng, di chuyển đầu bông lên phía trên khu vực tỵ hầu.

- Xoay đầu bông trên màng tỵ hầu vài lần rồi nhẹ nhàng kéo ra đưa vào tuýp có môi
trường vận chuyển và có nắp vặn.
- Bẻ đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và vặn chắc nắp.
- Dán nhãn trên tuýp đựng mẫu xét nghiệm.
b. Bệnh phẩm đường hô hấp dưới
- Hướng dẫn cho bệnh nhân thở sâu và ho bật đờm mủ trực tiếp vào hộp vô trùng có
miệng rộng, ít nhất là 1 ml. Tránh nước bọt hoặc mũi.
- Dán nhãn trên hộp đựng mẫu xét nghiệm.
- Hoàn thành các mẫu yêu cầu của phòng thí nghiệm.
2.4.3. Vận chuyển mẫu xét nghiệm
- Tất cả mẫu xét nghiệm đường hô hấp trừ đờm đều được vận chuyển trong môi
trường thích hợp cho vi khuẩn hoặc virus.
- Chuyển nhanh chóng đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự
phát triển của vi khuẩn hội sinh ở miệng.
- Nếu để tới 24 giờ, qua trình vận chuyển mẫu xét nghiệm vi khuẩn và virus cần để
trong điều kiện nhiệt độ từ 2 - 8oC ở môi trường thích hợp.
3. Lấy mẫu xét nghiệm máu
Máu và huyết thanh là mẫu xét nghiệm thường được làm để điều tra các bệnh
truyền qua đường máu. Máu tĩnh mạch có thể dùng để phân lập và định danh căn nguyên
gây bệnh trong quá nuôi cấy, hoặc tách huyết thanh để phát hiện các gen (PCR), đặc biệt
là kháng thể, kháng nguyên hoặc độc tố (bằng phương pháp ELISA). Để xử lý các mẫu
xét nghiệm cho chẩn đoán virus thì huyết thanh thích hợp hơn là máu nguyên, trừ khi sử
dụng trực tiếp.
3.1. Chuẩn bị dụng cụ lấy máu
- Khử trùng ngoài da: cồn 70% hoặc povidon iodin 10%, bông gạc, băng sơ cứu.
- Găng tay vô khuẩn dùng 1 lần.
- Ga rô, bộ lấy máu chân không (vacutainer) hoặc bơm kim tiêm dùng 1 lần.
- Bộ lấy chứa máu chân không hoặc tuýp đựng máu có nắp vặn, chai cấy máu (50
ml/người lớn, 25 ml/trẻ em) có chứa môi trường thích hợp.
- Gắn nhãn và dùng bút không xoá ghi thông tin bệnh nhân
3.2. Phương pháp lấy máu
- Đặt ga rô phía trên vị trí chọc ven.

- Bắt mạch để xác định vị trí ven. Sát trùng tại vị trí lấy vên và rộng ra vùng xung quanh,
để bay hơi hết rồi thực hiện chọc ven.
- Nếu dùng bơm tiêm một lần thì lấy 5-10 ml/người lớn, từ 2-5 ml/trẻ em.
- Xong bỏ ga rô, ép mạch đến khi máu ngừng chảy và dán băng lên trên.
- Chuyển máu vào tuýp vận chuyển có nắp và chai cấy máu
- Dán nhãn tuýp, dùng bút không xoá ghi số bệnh nhân.
- Hoàn thành các mẫu yêu cầu trường hợp điều tra của phòng thí nghiệm theo số của bệnh
nhân.
3.3. Quy trình vận chuyển
Chai máu nuôi cấy và tuýp bệnh phẩm máu cần được chuyển ở tư thế đứng thẳng
và an toàn trong khay đựng có nắp hoặc trong túi để trong hộp vận chuyển. Đi qua khu
vực địa hình khó đi, nên đệm hoặc treo chai lên để tránh vỡ hồng cầu. Chèn giấy thấm
xung quanh đề phòng bị tràn dung dịch ra ngoài.
Nếu như mẫu xét nghiệm đến được phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ, hầu như
các căn nguyên gây bệnh là vi khuẩn vẫn tồn tại trong điều kiện vận chuyển ở nhiệt độ
môi trường.
II. QUY TRÌNH SƠ CỨU BAN ĐẦU KHI BỊ TIẾP XÚC TRỰC TIẾP VỚI CHẤT
NHIỄM TRÙNG
1. Tai nạn khi bị kim tiêm làm bị thương
Một nguy cơ được coi là nghiêm trọng khi bị kim tiêm đâm làm bị thương, thậm
chí là không thấy máu chảy ra và kim tiêm cũng không bị gãy.
Dội ngay nước vào chỗ bị kim đâm và rửa bằng xà phòng.
Nếu cần thiết thì phải băng lại.
Ngay lập tức báo cáo tại nạn với người phụ trách và bác sĩ có trách nhiệm.
2. Tai nạn khi tiếp xúc với các chất nhiễm trùng
Tai nạn này bao gồm bất kỳ tiếp xúc nào không được bảo vệ giữa chất có khả năng
nhiễm trùng với chỗ da bị trầy xước, mồm, mũi và mắt.
Dội ngay nước sạch và nước xà phòng vào vùng bị tiếp xúc. Dùng nước sạch hoặc
nước muối để cho miệng và mắt.
Ngay lập tức báo cáo tại nạn với người phụ trách và bác sĩ có trách nhiệm.
3. Các hoạt động ngay lập tức sau khi xảy ra tai nạn
Không quan tâm đến tác nhân gây bệnh đang được điều tra, mà phải tuân thủ ngay
một quy trình sau khi bị tiếp xúc với chất có khả năng nhiễm trùng. Các bệnh nhân có thể

bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh khác mà không liên quan đến điều tra vụ dịch. Ví dụ
như virus viêm gan B hoặc HIV. Các mẫu máu cần được thu thập ngay lập tức từ nhân
viên y tế đã bị tiếp xúc và nếu có thể thì lấy cả từ bệnh nhân. Nếu có thể, cần phải xây
dựng một quy trình điều trị lâu dài cho những nhân viên y tế bị tiếp xúc với chất nhiễm
trùng trong quá trình điều tra dịch.
BÀI 3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP,
XÁC ĐỊNH VI KHUẨN
MỤC TIÊU
1. Sinh viên nhận biết được các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn
2. Sinh viên thực hiện kỹ thuật cấy và phân lập vi khuẩn.
3. Sinh viên thực hiện tiêu bản quan sát sự di động, hình thái vi khuẩn sau khi nhuộm
Gram.
4. Sinh viên xác định vi khuẩn phân lập.
NỘI DUNG
I. MÔI TRƯỜNG CẤY VI KHUẨN
Muốn cho vi khuẩn sống, ta phải cấy vi khuẩn vào các môi trường thích hợp, giúp
cho vi khuẩn tăng trưởng mạnh và nhanh. Các môi trường này phải hội đủ các điều kiện
sau:
- Nhiều chất dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn.
- Điều kiện vật lý thích hợp với đời sống của vi khuẩn (nhiệt độ, độ ẩm, pH, khí trường,..)
- Không chứa độc tố đối với vi khuẩn. Có rất nhiều loại môi trường thích ứng cho từng
loại, từng giống vi khuẩn.
- Môi trường phải được hấp tiệt trùng trước khi sử dụng
- Môi trường nuôi cấy ở thể đặc: thường để trong các ống nghiệm dạng nghiêng hoặc nửa
nghiêng hay các hộp petri.
- Môi trường cấy ở thể lỏng hay canh thang cấy: thường để vào các ống nghiệm
1. Phân loại môi trường
1.1. Phân loại theo trạng thái vật lý
Có rất ít loài vi sinh vật có khả năng phân hủy được agar. Vì vậy agar được sử
dụng làm chất chống đỡ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Tùy theo nồng độ của
agar thêm vào môi trường mà ta có thể chia môi trường nuôi cấy thành 3 loại:
- Môi trường lỏng là dung dịch chứa thức ăn hòa tan trong nước
- Môi trường bán đặc: là môi trường lỏng có thêm khoảng 0.5% agar

- Môi trường đặc: có khoảng 2% agar

1.2. Phân loại theo nguồn gốc vật liệu
Môi trường thiên nhiên: Có nguồn gốc từ thiên nhiên: khoai tây, đậu, thịt...trong
đó thành phần hóa học không xác định được. Ví dụ môi trường nước canh thịt, môi
trường nước trích đậu nành.
1.3. Phân loại theo công dụng
Mỗi loài vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Vì vậy ta phải chọn lựa
môi trường thích hợp cho từng loài vi sinh vật để chúng phát triển tốt. Người ta chia làm
3 loại:
- Môi trường căn bản: Là loại môi trường có thành phần thức ăn thích hợp cho nhiều loại
vi sinh vật. Ví dụ: môi trường khoai tây – agar (PGA)
- Môi trường chọn lọc (riêng biệt): Môi trường này thích hợp cho 1 nhóm vi sinh vật nhất
định
- Môi trường phân lập: Là loại môi trường thích hợp cho từng loài vi sinh vật cần phân
lập.
2. Cách pha chế các loại môi trường
2.1. Pha chế
Cân các nguyên liệu theo lượng và hòa tan trong một thể tích nước nhất định. Nếu
muốn điều chế môi trường đặc, cho tất cả vào chai thủy tinh chịu nhiệt và thêm agar đun
nóng, thường xuyên khuấy đều và bổ sung lượng nước bốc hơi bị mất.
2.2. Đo pH
Tùy theo loài vi sinh vật ta cần điều chỉnh pH cho phù hợp. Đo pH bằng pH kế và
điều chỉnh bằng dung dịch acid hay dung dịch NaOH.
2.3. Lọc và phân phối
Môi trường để nuôi cấy vi sinh vật cần phải trong, càng trong càng tốt vì như vậy
ta dễ quan sát. Có thể lọc bằng giấy lọc, vải thưa, hay bông gòn. Sau đó phân phối môi
trường vào các ống nghiệm, bình cầu...lượng môi trường không quá 2/3 dung tích bình
chứa để khi khử trùng môi trường không bị tràn ra ngoài.
2.4. Khử trùng
Thông thường khử trùng môi trường bằng nồi khử trùng nhiệt ướt ở áp suất
1kg/cm2 (121oC) trong 20 phút đến 1 giờ thùy theo loại và thể tích môi trường. Môi
trường được khử trùng xong phải bảo quản ở nhiệt độ thấp và không có ánh sáng, tránh
môi trường bị khô. Môi trường hữu cơ sau khi khử trùng thời gian tồn trữ không quá 3
tuần.


3. Thành phần môi trường nuôi cấy

* Môi trường thạch dinh dưỡng
Pepton
NaCl
Cao thịt
Thạch
Nước cất
- Cách tiến hành: Trộn các hỗn hợp thành phần, điều chỉnh pH 7 – 7.5 sau đó đem hấp
tiệt trùng ở 121oC/ 15phút
II. KỸ THUẬT CẤY VÀ PHÂN LẬP
1. Cấy vi khuẩn
Cấy vi khuẩn là chuyển vi khuẩn từ môi trường hiện tại sang môi trường khác.
Cấy vi khuẩn nhằm các mục đích:
 Cấy chuyền: chuyển gốc vi khuẩn thuần chủng từ môi trường cũ sang môi trường mới
để giữ giống, cấy chuyền thường được tiến hành định kỳ, thời gian dài ngắn tùy theo gốc.
 Cấy vi khuẩn cần khảo sát lên các môi trường để khảo sát hình thái và tính chất sinh lý,
sinh hóa ..., cấy vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy để thu hoạch số lượng lớn vi khuẩn.
Các lưu ý khi cấy:
- Thao tác phải nhanh gọn, nếu chậm sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm.
- Phải tiệt trùng kỹ que cấy
- Đốt miệng ống nghiệm khi mở nút bông cũng như khi đóng nút.
- Que cấy và miệng ống nghiệm phải để trong vùng an toàn của ngọn lửa (cách ngọn
lửa < 2 cm), không để ống nghiệm ngay trên ngọn lửa trong khi cấy.
- Đốt bỏ phần vi khuẩn thừa trên dây cấy trước khi đặt dây cấy xuống.
Cấy vi khuẩn bằng que cấy

2. Phân lập vi khuẩn

 Vi khuẩn thuần chủng: là tập hợp các vi khuẩn phát triển từ chỉ một tế bào vi khuẩn
ban đầu. Như vậy vi khuẩn thuần chủng là tập hợp gồm các vi khuẩn giống nhau về các
đặc điểm sinh lý và sinh hóa.
Trong các nghiên cứu cũng như thực hành về vi sinh vật người ta chỉ tiến hành
trên vi sinh vật đã được thuần chủng, do đó việc tạo ra vi khuẩn thuần chủng từ các tập
hợp vi khuẩn tạp ban đầu rất quan trọng.
 Phân lập vi khuẩn: là kỹ thuật được sử dụng để có được vi khuẩn thuần chủng từ hỗn
hợp các vi khuẩn.
Nguyên tắc: Vi khuẩn được trải trên môi trường với mật độ giảm dần đến khi các tế bào
vi khuẩn trong hỗn hợp ban đầu tách rời thành từng tế bào riêng rẽ và nằm xa nhau. Sau
thời gian ủ các tế bào vi khuẩn rời rạc trên sẽ phát triển thành 1 khóm vi khuẩn. Đây
chính là vi khuẩn thuần chủng, khi đó người ta có thể ly trích khóm vi khuẩn để nghiên
cứu hay cấy chuyền sang môi trường giữ gốc để lưu giữ.
Phương pháp
a. Đốt que cấy, làm nguội, lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn (lượng vi khuẩn cần lấy tùy
thuộc vào mật độ vi khuẩn của mẫu)
b. Ria (trục que cấy phải vuông góc với đường cấy và tạo với mặt thạch 1 góc
khoảng 30°, mặt phẳng vòng que cấy gần như song song với mặt thạch) vi khuẩn
trên đoạn A-B của hộp thạch từ phía thành hộp tiến ra cách thành hộp khoảng 1
cm. Đốt bỏ vi khuẩn thừa trên que cấy.
c. Làm nguội que cấy, ria vi khuẩn theo 1 chiều từ B sang C, bắt đầu từ sát thành hộp
bên trái, tiến ra sát thành hộp bên phải. Lưu ý: các đường cấy phải rời nhau, cách
nhau 1-2 mm và không cấy theo chiều ngược lại C sang B. Đốt que cấy để loại
bỏ vi khuẩn thừa trên que cấy.
d. Làm nguội que cấy, ria vi khuẩn theo 1 chiều từ C sang D, bắt đầu từ sát thành hộp
bên trái, tiến ra sát thành hộp bên phải. Lưu ý: các đường cấy phải rời nhau, cách
nhau 2 - 3 mm và không cấy theo chiều ngược lại D sang C.
e. Tiếp tục ria vi khuẩn theo 1 chiều từ D sang E, bắt đầu từ sát thành hộp bên trái,
tiến ra sát thành hộp bên phải. Lưu ý: các đường cấy phải rời nhau, cách nhau 3 - 4
mm và không cấy theo chiều ngược lại E sang D.
f. Trải vi khuẩn theo đường zig-zag từ E ra phần còn trống trong hộp thạch.
Lưu ý: không chạm vào các đường trải trước đó. Đốt que cấy để hoàn tất.

2. Phương pháp xác định vi khuẩn

Có hai phương pháp nhận định vi khuẩn, khi nhận định phải phối hợp cả hai:
 Phương pháp quan sat bằng mắt thường
- Quan sát hình thái khóm vi khuẩn sau khi phân lập và dạng vi khuẩn trong môi
trường lỏng.
- Khảo sát tính chất sinh lý của vi khuẩn: quan sát các tác động lý hóa đối với sự tăng
trưởng của vi khuẩn và quan sát các thử nghiệm sinh hóa.
 Phương pháp dùng kính hiển vi
- Khảo sát tính di động của vi khuẩn sống.
- Quan sát hình dạng, kích thước, cách sắp xếp, cấu trúc của tế bào vi khuẩn sau khi
nhuộm màu.
2.1. Khảo sát hình thái khóm vi khuẩn (khuẩn lạc)
2.1.1. Khảo sát trên môi trường đặc
Phân lập vi khuẩn trên môi trường đặc và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó tiến hành
quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước,
hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu
sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)
- Màu sắc khóm: một số vi khuẩn cho khóm có màu đặc biệt.
Ví dụ: Khóm màu vàng: Staphylococcus aureus
Vàng chanh: Sarcina lutea
Trắng: Bacillus subtilis
Trong như sương: Streptococcus
- Mùi (đặt hộp xa 20- 25 cm). Ví dụ: E. coli có mùi hôi.

2.1.2. Khảo sát vi khuẩn trong môi trường lỏng

Một số vi khuẩn có các đặc tính đặc biệt:
- Lắc có gợn sóng: E. coli
- Tủa lắng ở đáy: Staphyloccoccus aureus
- Đóng váng trên mặt: Bacillus subtilis, Vibrio cholerae
2.2. Khảo sát vi khuẩn sống
Khảo sát vi khuẩn sống gồm
- Khảo sát tính di động
- Khảo sát hình dạng
2.2.1. Kháo sát di dộng
a. Phương pháp trực tiếp
 Phương pháp giọt ép
Đặt một giọt huyền trọc chứa vi khuẩn lên lame kính, đậy lamelle và quan sát
bằng vật kính 40X. Phương pháp nay nhanh gọn nhưng giọt nước mau khô làm vi khuẩn
không di động.

 Phương pháp giọt treo

Huyền trọc vi khuẩn được treo ở mặt dưới của lamelle nên lâu khô, dễ quan sát.
*Chú ý: Khi quan sát di động cần phân biệt sự di động của vi khuẩn với sự trôi theo dòng
nước và chuyển động Brown.
b. Phương pháp gián tiếp
Cấy vi khuẩn vào giữa khối thạch mềm. Nếu vi khuẩn di động được nó sẽ mọc lan
ra khắp khối thạch, ngược lại vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
Vi khuẩn di động làm đục hết ống
Vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường

cấy
2.2.2. Khảo sát hình dạng: Nhuộm Gram để xác định hình dạng vi khuẩn

CÁC BƯỚC CHUNG ĐỂ NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN
Cấy mẫu trên môi trường

phong phú (nếu cần)
Phân lập trên các môi trường thích hợp
Khảo sát hình thái khóm vi khuẩn (khuẩn lạc) bằng mắt thường Ly trích
được khóm vi khuẩn cần khảo sát
Khảo sát hình thái vi khuẩn bằng kính Khảo sát các phản ứng sinh hóa, phản
hiển vi: Quan sát sự di động, hình dạng, cách sắp xếp ứng
sau khi nhuộm
huyết thanh của vi khuẩn
Khảo sát các tác động lý hóa trong quá trình nuôi cấ
TÊN VI KHUẨN

1. Thực hiện kỹ thuật pha chế môi trường Nutrient Agar (NA), các môi trường xác định
tính chất sinh hóa của vi khuẩn
2. Thực hiện kỹ thuật cấy phân lập vi khuẩn
3. Quan sát sự di động của vi khuẩn

4. Nhuộm Gram kết quả vi khuẩn đã phân lập được
HÌNH THÁI VI KHUẨN VÀ KHÓM VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

BÀI 4
KHẢO SÁT TÍNH CHẤT SINH HÓA, SINH LÝ CỦA VI KHUẨN
MỤC TIÊU
1. Sinh viên nắm được nguyên tắc các phản ứng sinh hóa.
2. Sinh viên thực hiện phản ứng sinh hóa xác định đặc tính của vi khuẩn.
NỘI DUNG
Khảo sát các phản ứng sinh hóa là một phương pháp kinh điển được dùng trong
định danh vi khuẩn. Ở các vi khuẩn thường gặp các phản ứng này ít khi nào trùng nhau,
do đó chúng cho phép ta phân biệt các vi khuẩn, thậm chí còn cho phép phân biệt đến các
đơn vị dưới loài.
Các phản ứng này gồm:
- Sử dụng hydratcarbon: glucose, lactose, mannitol, saccharose, xylose, mannose ...
- Cơ chế của sự ỉên men đường: phản ứng MR-VP
- Sử dụng citrat
- Khả năng nitrat hóa
- Sử dụng protein, acid amin và urê ...
I. CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA
1. Sử dụng hydrat carbon
 Nguyên tắc
Sử dụng môi trường chỉ chứa nguồn hydatcarbon cần nghiên cứu và chất chỉ thị
(đỏ phenol). Nếu vi khuẩn sử dụng được hydratcarcon này (lên men) sẽ tạo ra các sản
phẩm như acid hữu cơ hay acetoin làm pH môi trường thay đổi từ pH=7 giảm xuống pH
~ 6 và chỉ thị đỏ phenol chuyển từ đỏ sang vàng.
 Môi trường
Canh thang dinh dưỡng + 1% đường cần nghiên cứu
Hầu hết vi khuẩn đều sử dụng được glucose. Các đường đôi như lactose,
mannose ... đòi hỏi vi khuẩn phải có enzyme thủy phân chúng thành glucose.
Các phản ứng đường rất hữu ích, ví dụ như khi khảo sát vi khuẩn gây bệnh đường

ruột: các vi khuẩn có β-galactosidase để thủy phân lactose thành glucose và galactose (sử
dụng được lactose) thường không gây bệnh.
2. Sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh
Một số vi khuẩn được sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh như cystein, methionin
tạo H2S. Phát hiện bằng ion Fe2+
Fe2+ + S- → FeS (kết tủa đen)
(Xem thành phần môi trường KIA)
3. Môi trường KIA (KLIGLER IRON AGAR)
Môi trường do Kligler chế ra dùng để phát hiện cùng lúc các phản ứng: sử dụng
đường glucose, lactose, sử dụng acid amin chứa lưu huỳnh (sinh H2S) và tạo gas.
a. Thành phần môi trường
Cao thịt 3g
Cao men 3g
Pepton 20g
Lactose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Sắt ammonisulfat 0.5g
Natrithiosulfat 0.5g
Đỏ phenol 0.025g
Agar 12 – 15g
Nước cất 11
pH cuối cùng 7.4
Môi trường được phân vào ống nghiệm và tiệt trùng. Sau đó nghiêng sao cho khi
đông lại môi trường gồm 2 phần: thạch tròn và thạch nghiêng có chiều cao bằng nhau.
Có thể dùng môi trường này để phân biệt Salmonella, Shigella và Proteus.
b. Cách thực hiện
Vi khuẩn cần khảo sát được cấy hai lần:
- Lần 1: Dùng que cấy vòng cấy trên mặt lớp thạch nghiêng theo đường zigzac
- Lần 2: Dùng que cấy thẳng đâm sâu vào giữa khối thạch tròn, đường cấy phải thẳng
và rút que cấy theo đường cấy để tránh làm rách thạch.

c. Đọc kết quả

- Phần thạch tròn: đọc phản ứng sử dụng glucose
(+): màu vàng
(-): màu đỏ
Sinh gas: nếu có sẽ làm nứt thạch
- Phần thạch nghiêng: đọc phản ứng sử dụng lactose
(+): màu vàng
(-): màu đỏ
- Vùng tiếp giáp giữa hai phần: đọc phản ứng H2S nếu dương tính có màu đen
d. Giải thích
- Ở phần thạch tròn vi khuẩn hô hấp yếm khí nên sẽ sử dụng đường theo lối lên men và
sinh ra nhiều acid làm chuyển màu chỉ thị từ đỏ sang vàng.
- Ở phần thạch nghiêng vi khuẩn hô hấp hiếu khí, lượng acid sinh ra ít hơn. Do lượng
glucose trong môi trường ít nên nếu vi khuẩn chỉ sử dụng glucose thì lượng acid sinh ra
không đủ chuyển màu chỉ thị, trong khi đó lượng lactose trong môi trường gấp 10 lần
glucose nên nếu vi khuẩn sử dụng được lactose thì lượng acid sinh ra mới đủ chuyển màu
môi trường.
Cần lưu ý rằng nếu vi khuẩn sử dụng được lactose thì đương nhiên sử dụng được glucose
vì vi khuẩn thủy phân lactose thành glucose rồi mới sử dụng.
- Nếu vi khuẩn có sinh H2S, chất này kết hợp với Fe2+ trong môi trường cho ra tủa đen.
4. Các phản ứng xác định cơ chế lên men đường
Mục đích: Xác định vi khuẩn lên men theo lối cho ra hỗn hợp acid hay acetoin
acetylmethyl carbinol (CH3 COCH(OH)CH3), 2,3-butanediol (CH3 CH(OH)CH(OH)CH3),
hoặc diacetyl (CH3 COCOCH3)... Acid hỗn hợp: a. acetic
Chu trình Krebs
Phản  (Methyl
Glucoseứng MR Acid Red): Để xác định vi khuẩn có lên men theo lối cho ra acid
a. formic
Lên men
hỗn hợp hay không. Methyl Red giữ nguyên màu đỏ khi pH < 4.4 và chuyển hẳn sang
màu vàng khi pH > 6.2. b. lactic
Phản ứng VP (Voges - Proskauer): Để xác định vi khuẩn có lên men cho ra hỗn hợp
pH < 4,4
acetoin hay không. Phát hiện bằng nhỏ thuốc thử KOH 40% để tạo môi trường kiềm, sau
đó thêm α-Naphtol 5% trong cồn ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp Acetoin, pH > 5,5
5. Sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất như

Một số vi khuẩn như Salmonella paratyphi C, Aerobacter sử dụng được citrat như
nguồn carbon. Trên môi trường chứa natri citrat như nguồn carbon duy nhất, chỉ có vi
khuẩn nào sử dụng được citrat mới phát triển được. Việc sử dụng citrat tạo ra NH3 và
NH4OH, khi đó ion Na+ còn lại làm pH môi trường tăng trở nên kiềm nên sẽ chuyển màu
chỉ thị xanh bromothymol từ xanh lá (pH < 6,9) sang xanh dương đậm(pH > 7,6).
6. Sử dụng acid amin chứa nhân indol
Một số vi khuẩn có enzyme tryptophanase chuyển hóa tryptophan thành các dẫn
xuất có nhân indol. Phát hiện bằng nhỏ thuốc thử Kovac’s (thành phần gồm p-
dimethylaminobenzaldehyde, và isoamyl alcohol trong môi trường acid chlorhydric đậm
đặc), cho màu hồng.
Tryptophanase
Tryptophan Indole + Pyruvic acid + Ammonia
7. Sử dụng protein
Một số vi khuẩn có enzyme proteinase như: Bacillus subtilis có khả năng thủy
phân protein như: casein, gelatin trong môi trường thành acid amin tạo thành vùng trong
sáng xung quanh đường cấy vi khuẩn.
8. Sử dụng ure
Một số vi khuẩn có enzyme urease thủy phân ure thành NH 3 và CO2, NH3 trong
môi trường nước chuyển thành NH4OH có tính kiềm, làm đổi màu chỉ thị
phenolphthalein từ hồng sang hồng tím (pH > 8)
9. Sự hiện diện catalase
Một số vi khuẩn có enzyme catalase để phân hủy H2O2 như Staphylococcus aureus
trong khi Streptococcus không có nên đây là một phản ứng giúp phân biệt hai vi khuẩn
này.
Thực hiện
- Trên một lame sạch, đặt một giọt nước oxy già (H2O2)
- Dùng que cấy lấy chính xác khóm cần thử đặt vào giọt oxy già.
- Nếu có bọt khí sủi lên là catalase dương tính, ngược lại là âm tính.
*LƯU Ý:
- Cần nhớ rằng đa số vi khuẩn đều có catalase dương tính ngoại trừ các Streptococcus
nên khi lấy khóm vi khuẩn phải lấy đúng chỉ môt khóm cần khảo sát tránh lấy lẫn vi
khuẩn khác sẽ bị dương tính giả.
- Các yếu tố trong môi trường thạch máu cũng có hoạt tính catalase nên khi lấy khóm vi

khuẩn tránh lấy dính môi trường máu sẽ bị dương tính giả.
- Khóm vi khuẩn của Streptococcus rất nhỏ do đó khi lấy phải đảm bảo lấy được khóm
nếu không sẽ bị âm tính giả.
10. Sự hiện diện enzyme oxidase
Nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme cytochrome oxidase ở vi khuẩn.
Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền
điện tử của hô hấp hiếu khí với O 2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong
các loài vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy ý.
Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylendiamine.
Trong điều kiện có sự hiện diện của cytochrome c khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy
hóa thành một hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
Thực hiện
- Dùng que cấy lấy một khóm vi khuẩn rồi trải lên một đĩa oxidase
- Tại nơi phết vi khuẩn, giấy thấm có màu tím là phản ứng (+), không đổi màu là phản
ứng (-)
PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN
Môi trường KIA Lac Glu Man MR VP Indol Citrat Urease

Vi khuẩn Lac Glu H2S Gas
Aerobacter + + - + + + + - + - + -
aerogenes
E.coli + + - + + + + + - + - -
Proteus - + + +/- _ + - + - - - +
Salmonella - + + +/- _ + + + - - +/- -
Shigella - + - - - + + + - - - -
Phản ứng IMViC để phân biệt E. coli và Aerobacter (tên mới Klebsiella)
I M V IC
(Indol) (MR) (VP) (Citrat)
E. coli + + - -
Aerobacter - - + +
II. KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÝ HÓA

1. Các tác động vật lý

1.1. Tác động nhiệt
Mỗi vi khuẩn có một khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng của chúng.
Nếu nhiệt độ quá thấp chúng sẽ tăng trưởng chậm (ví dụ đông lạnh để bảo quản thực
phẩm). Nếu quá cao thì vi khuẩn chết, trong khoảng nhiệt độ đó có một nhiệt độ mà vi
khuẩn tăng trưởng tốt nhất gọi là thuận nhiệt hay hay nhiệt độ tối ưu.
Các vi khuẩn có bào tử thì dạng bào tử chịu nhiệt tốt hơn dạng dinh dưỡng
Ứng dụng
- Nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp
- Phân lập vi khuẩn khi chúng có khả năng chịu nhiệt khác nhau. Ví dụ: vi khuẩn
lactic, Bacillus và các vi khuẩn dinh dưỡng khác
- Diệt khuẩn thức ăn: trong thức ăn vi khuẩn gây bệnh bị diệt ở nhiệt độ 60 – 70oC
Thực hành
- Chia hộp thạch thành làm 4 phần, đánh dấu 0,5,10,15 phút
- Ống vi khuẩn (trên môi trường lỏng) được cấy trước khi tiếp xúc với nhiệt vào vị trí
0
- Đun nước đến 80oC cho ống vi khuẩn tiếp xúc với nhiệt. Sau mỗi 5 phút, lấy ra cấy
vào vị trí 5, 10, 15 phút
- Đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả
1.2. Tác động của pH
pH môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn. Phần lớn vi khuẩn phát
triển tốt ở pH trung tính (pH 7). Một số vi khuẩn ưa kiềm như Vibrio cholerae, một số ưa
acid như men rượu, vi khuẩn lactic.
Ứng dụng
- Duy trì pH thích hợp của môi trường trong quá trình nuôi cấy
- Dùng tác động của pH để phân lập vi khuẩn
- pH thấp có tác dụng bảo quản thực phẩm vì ngăn cản vi khuẩn gây bệnh trong
yaourt, dưa chua
1.3. Tác động của áp suất thẩm thấu
Đa số vi khuẩn bị ức chế tăng trưởng ở môi trường có nồng độ muối, đường cao
do hiện tượng co nguyên sinh chất.
Ứng dụng

- Bảo quản thực phẩm (siro, nước mắm, các loại mắm...)
- Phân lập vi khuẩn, ví dụ môi trường MSA (Manitol Salt Agar)
1.4. Tác động của tia cực tím (UV)
Tia UV có tác động diệt khuẩn, bước sóng 265 nm có tác động mạnh nhất.
2. Tác động của yếu tố hóa học
2.1. Tác động của các dung môi hữu cơ, xà phòng
Một số dung môi hữu cơ có tác dụng sát khuẩn do tác động lên màng tế bào vi
khuẩn hoặc làm biến tính protein: cồn, aceton, ether...thường dùng sát trùng tay.
Thực hành
- Trong các ống (5 ml) dung dịch cồn nồng độ 75%, 40% cho 0.5 ml huyền trọc vi
khuẩn Salmonella chứa 107 vi khuẩn / ml
- Sau mỗi khoảng thời gian 1, 2, 3 và 5 phút cấy vi khuẩn vào một ống môi trường
đường glucose
- Ủ các ống này ở 37oC trong 24 giờ
- Nếu vi khuẩn còn sống sót sẽ lên men đường làm chuyển màu chỉ thị từ đỏ sang
vàng.
- Ghi nhận thời gian tiếp xúc và nồng độ nào vi khuẩn sống sót
2.2. Tác động của các chất tẩy trùng
Các chất tẩy trùng có tác dụng sát khuẩn rất mạnh như sulfochromic acid, phenol,
formol...thường dùng để tẩy trùng bàn, vật dụng, phòng cấy...
 Tác động sát khuẩn của dung dịch phenol
Tác động sát khuẩn của dung dịch phenol tùy thuộc vào
- Nồng độ phenol
- Số lượng vi khuẩn
- Thời gian tiếp xúc
2.3. Tác động của oxy
Tác động của oxy phản ánh cơ chế tạo năng lượng
Dựa vào tác độngcủa oxy có thể chia vi khuẩn làm 4 loại
- Hiếu khí tuyệt đối: cần có oxy mới phát triển được (P.aeruginosa)
- Vi hiếu khí: cần một lượng oxy
- Yếm khí tuyệt đối: có oxy vi khuẩn sẽ chết

- Yếm khí tùy ý: có hay không có oxy vẫn phát triển được (E.coli)
1. Thực hiện các phản ứng sinh hóa của một vi khuẩn.
2. Thực hiện cấy hộp thạch thử tác động của tia UV (phần này làm sớm để chiếu UV
trong 2 giờ)
3. Thực hiện các phản ứng vi khuẩn chịu tác động của áp suất thẩm thấu, tác động pH.
4. Thực hiện thử nghiệm tác động của oxy, làm thừ nghiệm tác động của nhiệt và cồn.
Phần này làm sau cùng vì vi khuẩn có thể sẽ chết.

BÀI 5
KHÁNG SINH ĐỒ
MỤC TIÊU
1. Sinh viên hiểu được các khái niệm MIC, nhạy cảm, nhạy cảm trung gian, đề kháng
của vi khuẩn đối với kháng sinh
2. Sinh viên nắm được nguyên tắc, cách làm và cách đọc kết quả kháng sinh đồ theo
phương pháp Kirby-Bauer
3. Thực hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer và đọc kết quả.
NỘI DUNG
Việc sử dụng kháng sinh căn cứ vào phổ kháng khuẩn tự nhiên của kháng sinh và
tình trạng lâm sàng cũng như vị trí nhiễm trùng. Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng vi
khuẩn sẽ phát triển tính đề kháng đối với kháng sinh làm cho việc sử dụng kháng sinh bị
thất bại. Trong trường hợp đó, cần thiết xác định lại tính nhạy cảm thực tế của vi khuẩn
gây bệnh đối với kháng sinh nhằm đưa ra hướng chỉ định kháng sinh thích hợp giúp liệu
pháp kháng sinh thành công.
Trong lâm sàng người ta thường dùng phương pháp khuếch tán của Kirby- Bauer.
Phương pháp này cho phép biết ngay độ nhạy cảm in vitro của vi khuẩn khảo sát với
hàng loạt kháng sinh, từ đó định hướng chỉ định kháng sinh thích hợp để điều trị.
1. XÁC ĐỊNH MIC VÀ MBC
1.1. Định nghĩa
MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng
trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường
MBC (Minimal Bactericidal Concentration) là nồng độ tối thiểu diệt khuẩn
1.2. Phương pháp pha loãng
1.2.1. Nguyên tắc
Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn hoặc
lỏng. Kháng sinh được pha loãng ½ liên tục trong môi trường, sau đó cho vào một lượng
vi khuẩn xác định. Sau thời gian ủ, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của
vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường.
Để tìm MBC bắt đầu từ tất cả các nồng độ cao hơn MIC (thường sau 24 giờ ủ, đôi
khi sau từng 2 giờ ủ) sẽ đếm số vi khuẩn còn lại để tìm nồng độ tương ứng nhỏ nhất mà
số lượng vi khuẩn chỉ còn lại 0.01% so với lượng vi khuẩn ban đầu. Nồng độ này chính là
MBC.
Bài giảng thực hành Vi sinh đại cương Trang 31

1.2.2. Phương pháp

a. Môi trường
Mueller – Hinton
- Nước hầm thịt bò 300ml
- Pepton (casein) 17.5g
- Tinh bột 1.5g
- Nước vừa đủ 1000ml
Để làm nguội môi trường rắn thêm vào 18g agar / 1000 ml môi trường
1.2.3. Vi khuẩn
Vi khuẩn khảo sát phải được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3 – 5 khóm vi khuẩn
cấy trên 5 ml canh thang Mueller – Hinton hay Tryptic Soy Broth trong 2-6 giờ ở 37 oC
sao cho độ đục vượt quá Mc Farland 0.5, rồi pha loãng với canh thang sao cho độ đục
bằng thang Mc Farland 0.5 (1 – 3.108 vi khuẩn / ml) hoặc có thể sử dụng máy đo quang
phổ ở bước sóng 625 nm
Khi sử dụng pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 107 vi khuẩn / ml
Lượng vi khuẩn cấy vào: 10 4 (1µl) đối với phương pháp pha loãng trong môi
trường rắn hoặc 3 – 7.105 / ml môi trường đối với phương pháp pha loãng môi trường
lỏng.
1.2.4. Kháng sinh
a. Pha loãng trong môi trường lỏng
 Pha dung dịch kháng sinh mẹ có nồng độ 160 µg/l
1 2 3 4 5 6
Lượng kháng sinh (dung dịch mẹ) 1 Đối

chứng
Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5
Nồng độ kháng sinh (µg/ml) 16 8 4 2 1 0
Lượng vi khuẩn (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Sự tăng trưởng của vi sinh vật sau 24 - - - + + +

giờ
 Cấy vi khuẩn: tất cả các ống đều cấy cùng 1 lượng vi khuẩn 0.3 ml huyền trọc vi
khuẩn có mật độ 107 vi khuẩn / ml để cuối cùng mật độ vi khuẩn tron ống khoảng 3-7.10 5

vi khuẩn / ml
 Đọc kết quả
- Lắc các ống trước khi đọc
- Quan sát các ống từ nồng độ thấp đến nồng độ cao, tìm ống đầu tiên có sự ức chế tăng
trưởng nghĩa là ống vẫn trong. Đây chính là ống có MIC, các ống có sự tăng trưởng thì
đục.
b. Pha loãng trong môi trường rắn
- Cũng thực hiện như trên môi trường lỏng nhưng thêm thạch vào
- Môi trường được đun chảy rồi để nguội đến 45 – 50 oC mới cho dung dịch kháng sinh
vào
- Các ống thạch khi đã cho kháng sinh vào đổ ngay vào hộp để cho đông rắn lại.
- Khi thạch đã đông, vi khuẩn được cấy bằng một ống mao quản hay micropipet hoặc dây
cấy với một lượng 1µl vào trên bề mặt thạch (tránh làm rách thạch). Nếu dùng hộp đường
kính 60 mm, có thể cấy 4 vi khuẩn trong 1 hộp.
- Kết quả đọc được bằng sự hiện diện hay không của khóm vi khuẩn
1.2.5. Chú ý quan trọng
- Xác định MIC là một thử nghiệm có tính chất định lượng do vậy việc cân đo đếm cần
chính xác.
- Vi khuẩn sử dụng phải được làm tinh khiết trước khi hoạt hóa
- Trong các môi trường, hay dung môi không được chứa bất kỳ chất nào ảnh hưởng của
hoạt động kháng sinh
- Toàn bộ thao tác phải tiến hành nhanh chóng (đặc biệt đối với môi trường rắn vì để
chậm môi trường sẽ bị đông trước khi đổ hộp) và tránh nhiễm trùng từ bên ngoài
- Kết quả chỉ có giá trị khi trên mẫu đối chứng có sự tăng trưởng bình thường của vi
khuẩn.
- Để kết quả có thể so sánh được với MIC chuẩn, cần tiến hành song song xác định MIC
của kháng sinh chuẩn trên vi khuẩn chuẩn để chuẩn hóa kỹ thuật.
2. KHÁNG SINH ĐỒ
2.1. Nguyên tắc
Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt
thạch chung quanh, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vùng ức chế diễn
đạt được mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh. Trường hợp không có vùng
ức chế, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh.

2.2. Vật liệu

a. Đĩa kháng sinh
Là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dich thuốc kháng sinh
với nồng độ tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh phải được cất giữ trong các ống có chứa các chất
chống ẩm ở nhiệt độ ≤ -4oC. Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra và để ở nhiệt độ từ 2-8°C.
Khi thực nghiệm kháng sinh đồ, các ống chứa đĩa kháng sinh phải được lấy ra
khỏi tủ lạnh, để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ trước khi mở nắp. Các đĩa kháng sinh phải được
kiểm tra hoạt lực trên vi khuẩn chuẩn trước mỗi lần dùng.
b. Môi trường
Môi trường tiêu chuẩn để thực hiện kháng sinh đồ là môi trường Muller Hinton
agar (MHA). Môi trường MHA sẽ được thêm các chất bổ sung khi có yêu cầu, ví dụ: để
làm thử nghiệm cho Streptococci, cần thềm vào 5% máu người hoặc máu động vật.
Ngoài ra có thể dùng môi trường: Trypticase soy Agar hay môi trường thạch
máu,...
Môi trường được đổ vào hộp petri với bề dày thạch là 4 mm, bảo quản trong các
túi plastic và để trong tủ lạnh. Không được dùng sau 7 ngày. Trước khi dùng, phải lấy ra
khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt nhiệt độ phòng.
c. Vi khuẩn
Vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách lấy 3-5 khóm vi khuẩn cấy trên
5ml canh thang Mueller – Hinton hay Tryptic Soy Broth trong 2-6 giờ ở 37 oC sao cho độ
đục vượt quá McFarland 0,5 rồi pha loãng với canh thang sao cho độ đục ngang bằng với
độ đục chuẩn của ống McFarland 0,5 (1-3.108 vi khuẩn/ml). Dùng ngay trong vòng 15
phút sau khi chuẩn độ đục.
2.3. Tiến hành
- Môi trường được nấu chảy, đổ hộp. Để cho thạch đông.
- Trải vi khuẩn: dùng que bông vô trùng nhúng vào canh cấy vi khuẩn, xoay que trên
thành ống để ép cho ráo nước, rồi quét trên mặt thạch thật đều và kín. Khi quét được hơn
½ hộp, xoay hộp 60° và quét lần thứ 2. Xoay hộp 60° và quét lần thứ 3. Cuối cùng dùng
que bông quét 1 vòng xung quanh, sát thành hộp.
- Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở 37°C trong không quá 15 phút.
- Đặt kháng sinh: dùng kẹp được tiệt khuẩn (đốt trên đèn, làm nguội) cặp khoanh giấy rồi
đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, các đĩa cách nhau tối thiểu 2,5 cm và cách
thành hộp tối thiểu 2 cm. Không xê dịch đĩa sau khi đã đặt. Chỉ được phép đặt đĩa khi
mặt thạch đã khô.

- Ủ 37°C trong 24 giờ.

2.4. Đọc kết quả
Vi khuẩn mọc trên khắp mặt thạch và
làm đục mặt thạch, có 2 trường hợp xảy ra
 Xung quanh đĩa kháng sinh không có vùng ức chế
(thạch đục đến tận mép đĩa kháng sinh).
Kết luận : vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh đó
 Xung quanh đĩa kháng sinh có một vòng trong suốt,
đó là vùng ức chế, là nơi dưới tác động của kháng sinh vi khuẩn không tăng trưởng được.
Trong trường hợp này, ta không thể kết luận được ngay mà phải:
- Đo đường kính vùng ức chế (tính bằng mm)
- So sánh với đường kính vùng ức chế được trình bày trong bảng hướng dẫn của
NCCLS (National Commettee Clinical Laboratory Standards). Có 3 mức độ nhạy
cảm với kháng sinh
- Nhạy cảm (Susceptible – S): vi khuẩn đáp ứng với những liều kháng sinh thông
thường khi được dùng theo những đường thích hợp, gồm cả đường uống
- Trung gian (Intermediate – I): vi khuẩn có thể bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt
được sau khi dùng liều lớn nhất theo đường tiêm chích
- Kháng (resistant – R): vi khuẩn không bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt được do
đó thuốc không nên được lựa chọn cho điều trị
*Chú ý quan trọng
- Thạch Mueller-Hinton là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ thường quy
cho những vi khuẩn không khó mọc
- Các đĩa kháng sinh cần bảo đảm hoạt lực với các vi khuẩn chuẩn:
Staphylococcus aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922...
- Với các vi khuẩn khó mọc như Haemophilus sp, Neissseria gonorrhoeae
… cần có các môi trường và bảng tiêu chuẩn biện giải riêng biệt
- Các kháng sinh lựa chọn làm kháng sinh đồ sẽ tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh.
3. PHỐI HỢP KHÁNG SINH
3.1. Mục đích phối hợp kháng sinh
Tăng hiệu quả diệt khuẩn: các kháng sinh phối hợp hiệp lực có thể diệt các chủng
vi khuẩn đã đề kháng với các kháng sinh riêng rẽ.

Mở rộng hoạt phổ: khi nhiễm trùng nặng nhưng chưa tìm được vi khuẩn gây bệnh
người ta phối hợp kháng sinh để mở rộng hoạt phổ nhằm đảm bảo kháng sinh diệt được
vi khuẩn dù là vi khuẩn nào.
Ngăn ngừa vi khuẩn phát triển sự đề kháng: một số kháng sinh dễ bị đề kháng nên
không thể dùng riêng rẽ, hoặc trường hợp kháng sinh dài ngày làm nguy cơ phát triển đề
kháng cao.
3.2. Hậu quả của sự phối hợp
Có ba trường hợp xảy ra
Hợp lực: phối hợp có tác động kháng khuẩn mạnh hơn các kháng sinh dùng riêng
rẽ trên 1 loại vi khuẩn. Đây là phối hợp có lợi.
Riêng rẽ: phối hợp có tác động như các kháng sinh dùng riêng rẽ. Người ta có thể
chấp nhận điều này để mở rộng hoạt phổ.
Đối kháng: tác động phối hợp thấp hơn mỗi kháng sinh dùng riêng. Khi phối hợp
tránh trường hợp này.
3.3. Phương pháp thăm dò phối hợp kháng sinh – phương pháp khuếch tán trong
môi trường rắn
Thực hiện như kháng sinh đồ nhưng các kháng sinh được đặt sao cho các vùng ức
chế chồng lên nhau. Nếu phối hợp hiệp lực vi khuẩn sẽ bị ức chế mạnh nhất ở vùng tiếp
giáp, ngược lại là sự đối kháng nếu ở vùng tiếp giáp vi khuẩn phát triển mạnh hơn.
Trường hợp tác động riêng rẽ thì tại vùng tiếp giáp vi khuẩn phát triển như các vùng
khác.
Thí dụ: phương pháp đặt băng giấy vuông góc: Quan sát nơi góc vuông tiếp giáp
hai băng giấy theo mũi tên.

1. Chọn khúm vi 2. Pha huyền dịch vi
3. So độ đục chuẩn của huyền dịch vi khuẩn

4. Trải vi khuẩn lên mặt thạch
5. Đặt đĩa kháng sinh lên mặt 6. Đo đường kính vùng ức chế
Các bước thực hiện kháng sinh đồ Kirby-Bauer



1. Thực hiện kháng sinh đồ của một số vi khuẩn

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP

BÀI 5. CÁC THỬ NGHIỆM VỀ KHÁNG SINH
Nhóm........................ Lớp .......................Ngày thực tập .............................
Tổ (bàn) ......................... ................................................................
1. Kháng sinh đồ Vi khuẩn:?
Tên kháng sinh

Đường kính vùng ức
chế (mm)
Sự tăng trưởng (+/-)
2. Phối hợp kháng sinh
Phối hợp 1 gồm .......................................+ .....................................................
Phối hợp 2 gồm .........................................+ .................................................
Phối hợp 3 gồm .........................................+ .................................................
Phối hợp 1 2 3
Hiệp lực? (+/-)
Riêng rẽ? (+/-)
Đối kháng? (+/-)
Câu hỏi:
1. Vì sao nói “MIC của một vi khuẩn tỉ lệ nghịch với đường kính vùng ức chế”. Đúng
hay sai? Giải thích (ngắn gọn)
2. Nếu vi khuẩn chưa tinh khiết sẽ ảnh hưởng như thế nào đến kết quả kháng sinh đồ?
Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến đường kính vòng ức chế?

BÀI 6
CHUẨN ĐOÁN TỤ CẦU KHUẨN
MỤC TIÊU
1. Sinh viên biết cách lấy bệnh phẩm cổ họng.
2. Sinh viên phân lập tách rời khóm trên các môi trường.
3. Sinh viên nhận được khóm của một số vi khuẩn gây bệnh.
4. Sinh viên nhuộm gram, mô tả hình dạng, kích thước của mỗi loại khóm, làm phản
ứng phân biệt.
5. Sinh viên kết luận được tụ cầu gây bệnh.
NỘI DUNG
1. Đại cương
Trong cổ họng có thể hiện diện những vi khuẩn gây bệnh và không gây bệnh,
nhưng một vi khuẩn chỉ được coi là nguyên nhân gây bệnh cổ họng khi:
- Thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh.
- Chiếm số lượng nhiều hơn các vi khuẩn khác.
2. Vi khuẩn gây bệnh và hoại sinh
Staphylococcus aureus coagulase (+)
3. Môi trường nuôi cấy
Thạch máu: môi trường phong phú cần thiết cho sự kiểm nghiệm vi khuẩn cổ
họng, cho tất cả loại vi khuẩn đều mọc được và để khảo sát sự huyết giải của nhóm vi
khuẩn.
Huyết giải α: huyết giải không hoàn toàn. Vi khuẩn cho một vòng màu xanh rêu
xung quanh khóm vi khuẩn.
Huyết giải β: huyết giải hoàn toàn. Vi khuẩn cho một vòng trong sáng xung quanh
khóm vi khuẩn.
Huyết giải γ: không huyết giải, giữ nguyên màu của máu xung quanh khóm vi
khuẩn.
4. Phương pháp xét nghiệm
4.1. Lấy bệnh phẩm
Nguyên tắc chung: lấy trước khi dùng kháng sinh, bệnh nhân có triệu chứng viêm
nhiễm cổ họng rõ rệt.

Dùng que bông vô trùng, quẹt cả hai bên bốc amygdale của bệnh nhân. Tránh
đụng răng, lưỡi hay nước miếng của bệnh nhân.
Lưu ý cần có sự hợp tác của bệnh nhân, nếu không phải dùng thêm thanh đè lưỡi.
Động tác lấy phải nhẹ nhàng, cẩn thận tránh gãy que bông vào họng nguy hiểm.
4.2. Những việc cần phải làm trong xét nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh cổ họng
Ngày thứ nhất
Phân lập trên các môi trường thạch máu:
Dùng que bông phân lập từ A đến B, sau đó dùng dây cấy phân lập tiếp theo đến
E. (phương pháp đường rạch).
Chú ý quan sát chỗ nào trên que có vi khuẩn thì mới phân lập xuống. Nếu lượng vi
khuẩn quá ít, có thể dùng que bông phân lập.
Ngày thứ hai
Quan sát các khóm vi khuẩn
Trên thạch máu
Có mấy loại khóm?
 Màu sắc, hình dáng, kích thước của mỗi loại.
Quan sát sự huyết giải. Lưu ý huyết giải loại gì, chính xác do loại khóm nào?
Nhận định nhóm vi khuẩn gây bệnh
Trên thạch máu:
- Biện luận qua các môi trường.
- Nhuộm gram, quan sát hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn.
- Biện luận.
- Làm phản ứng phân biệt (nếu cần).
- Kết luận tên vi khuẩn.
Staphylococcus aureus Huyết giải β của Staphylococcus aureus

BÀI 7
CHUẨN ĐOÁN LIÊN CẦU KHUẨN VÀ CHUẨN ĐOÁN PHẨY
KHUẨN TẢ
MỤC TIÊU
1. Biết cách lấy bệnh phẩm cổ họng và mẫu phân.
2. Phân lập tách rời khóm trên các môi trường.
3. Nhận được khóm của một số vi khuẩn gây bệnh cổ họng và bệnh tả.
4. Nhuộm đúng gram, mô tả hình dạng, kích thước của mỗi loại khóm, làm phản ứng
phân biệt.
5. Kết luận được vi khuẩn gây cổ họng và bệnh tả.
NỘI DUNG
1. CHUẨN ĐOÁN LIÊN CẦU KHUẨN
1.1. Đại cương
Trong cổ họng có thể hiện diện những vi khuẩn gây bệnh và không gây bệnh,
nhưng một vi khuẩn chỉ được coi là nguyên nhân gây bệnh cổ họng khi:
Thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh.
Chiếm số lượng nhiều hơn các vi khuẩn khác.
1.2. Vi khuẩn gây bệnh và hoại sinh
Streptococcus hemolyticus β (Strep. pyogenes group A)
Streptococcus viridans (hemolyticus α)

1.3. Môi trường và sự huyết giải

Thạch máu: môi trường phong phú cần thiết cho sự kiểm nghiệm vi khuẩn cổ
họng, cho tất cả loại vi khuẩn đều mọc được và để khảo sát sự huyết giải của nhóm vi
khuẩn.
Huyết giải α: huyết giải không hoàn toàn. Vi khuẩn cho một vòng màu xanh rêu
xung quanh khóm vi khuẩn.
Huyết giải β: huyết giải hoàn toàn. Vi khuẩn cho một vòng trong sáng xung quanh
khóm vi khuẩn.
Huyết giải γ: không huyết giải, giữ nguyên màu của máu xung quanh khóm vi
khuẩn.
1.4. Phương pháp xét nghiệm
Lấy bệnh phẩm
Nguyên tắc chung: lấy trước khi dùng kháng sinh, bệnh nhân có triệu chứng viêm
nhiễm cổ họng rõ rệt.
Dùng que bông vô trùng, quẹt cả hai bên bốc amygdale của bệnh nhân. Tránh
đụng răng, lưỡi hay nước miếng của bệnh nhân.
Lưu ý cần có sự hợp tác của bệnh nhân, nếu không phải dùng thêm thanh đè lưỡi.
động tác lấy phải nhẹ nhàng, cẩn thận tránh gãy que bông vào họng nguy hiểm.
Những việc cần phải làm trong xét nghiệm tìm liên cầu khuẩn
Ngày thứ nhất
- Phân lập trên các môi trường thạch máu:
- Dùng que bông phân lập từ A đến B, sau đó dùng dây cấy phân lập tiếp theo đến E.
(phương pháp đường rạch). Chú ý quan sát chỗ nào trên que có vi khuẩn thì mới
phân lập xuống. Nếu lượng vi khuẩn quá ít, có thể dùng que bông phân lập.
Ngày thứ hai
Quan sát các khóm vi khuẩn
Trên thạch máu
- Có mấy loại khóm?
- Màu sắc, hình dáng, kích thước của mỗi loại.
- Quan sát sự huyết giải. lưu ý huyết giải loại gì, chính xác do loại khóm nào?
Nhận định nhóm vi khuẩn gây bệnh
Trên thạch máu:
- Biện luận qua các môi trường.

- Nhuộm gram, quan sát hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn
- Biện luận.
- Làm phản ứng phân biệt (nếu cần)
Kết luận tên vi khuẩn.
2. CHUẨN ĐOÁN PHẨY KHUẨN TẢ
2.1. Ly trích bệnh phẩm
- Khi đang bệnh, trước khi dùng kháng sinh.
- Để phân trong hủ sạch, không dính nước tiểu.
- Mẫu phân phải được gửi ngay tới phòng thí nghiệm. nếu phải gửi đi xa dùng môi trường
chuyên chở đặc biệt để tránh vi khuẩn hoại sinh phát triển lấn át vi khuẩn gây bệnh.
2.2. Nguyên tắc khảo sát phân tìm phẩy khuẩn tả
Vi khuẩn đường ruột rất phức tạp và về hình thể rất giống nhau, do đó không thể
dựa vào hình thái mà phân biệt được. Để xét nghiệm người ta phải dùng một hệ thống
môi trường có mức độ chọn lọc tăng dần để cô lập vi khuẩn nghi ngờ, giúp định hướng
trong chẩn đoán.
2.3. Phương pháp xét nghiệm
Lấy bệnh phẩm
Mẫu phân có hạt gạo:
Cần tìm cho V.cholerae. Phân lập mẫu trên các môi trường.
- Thạch pH 9.0.
- Thạch TCBS.
- Môi trường lỏng pepton kiềm.
- Cấy phản ứng Cholerae-Red.
Nhận định vi khuẩn gây bệnh
Mẫu phân có hạt gạo: tìm V.cholerae
- Nhận định khóm vi khuẩn gây bệnh:
- Trên môi trường TCBS cho những khóm vàng (chú ý loài Proteus cho khóm vàng).
- Trên môi trường peptone kiềm cho váng trắng nổi lên.
Khảo sát bằng kính hiển vi:
- Quan sát sự di động: lấy váng trắng trong peptone kiềm. Quan sát kiểu di chuyển của
V. cholerae (kiểu bướm). Nếu lấy khóm màu vàng trên môi trường TCBS, vi khuẩn
di động không nhanh đặc trưng.

Nhuộm màu Gram: lấy váng trắng hoặc nước peptone kiềm nhuộm. Quan sát hình
dạng đặc trưng của vi khuẩn, tìm dạng phẩy khuẩn mảnh mai. Nếu lấy khóm TCBS, xem
có hình dạng đặc trưng hay không?
Kết luận có V.cholerae hay không?
Vibrio cholerae trên thạch TCBS Vibrio cholerae

Bài 8
CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH VÀ CÁC PHƯƠNG
PHÁP CHẨN ĐOÁN VIRUS
MỤC TIÊU
1. Sinh viên nắm được một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh.
2. Sinh viên nắm được một số phương pháp chuẩn đoán virus.
NỘI DUNG
Để chẩn đoán được bệnh nhiễm virus, có thể dựa vào:
- Phát hiện sự có mặt của kháng thể (KT) kháng virus trong huyết thanh bệnh nhân ở
thời điểm bắt đầu có triệu chứng hoặc sớm hơn (Chẩn đoán huyết thanh).
- Xác định sự hiện diện của virus hoặc sản phẩm của chúng trong máu bệnh nhân hoặc
mô khác (Chẩn đoán trực tiếp hoặc phân lập virus).
1. Chẩn đoán huyết thanh
Trong các phương pháp chẩn đoán huyết thanh thì kỹ thuật ELISA là thường được
sử dụng nhất.
1.1. Kỹ thuật ELISA
Nguyên lý: Đây là phản ứng miễn dịch đánh dấu, trong đó chất đánh dấu là một
enzym dùng để phát hiện phức hợp kháng nguyên (KN) - kháng thể (KT) nhờ một cơ
chất đặc hiệu.
Các kỹ thuật ELISA thường dùng:
- Kỹ thuật dùng kháng kháng thể IgM (KKT - IgM ) gắn enzym phát hiện KT:
1. Gắn KN lên nền cứng ( phiến dẻo hay đáy ống nghiệm )
2. Thêm huyết thanh cần xác định KT. Sau thời gian ủ, rửa để loại bỏ KT không kết
hợp với KN.
3. Thêm KKT - IgM gắn enzym, ủ một thời gian rồi rửa bỏ KKT- IgM thừa.
4. Thêm cơ chất. Sau thời gian ủ, cho chất ngưng phản ứng rồi đọc kết quả đo mật độ
quang học OD (Opical density)
- Kỹ thuật "Sandwich" (Dùng KN gắn enzym để phát hiện KT) :
1. Gắn KN (virus ) đã biết lên nền cứng.
2. Phủ huyết thanh cần xác định KT lên, để một thời gian rồi rửa nước.
3. Thêm KN gắn enzym vào. Sau ủ, rửa để loại KN-enzym thừa.

4. Cho cơ chất đặc hiệu vào, sau thời gian ủ thì thêm chất ngưng phản ứng rồi đọc
kết quả bằng đo mật độ quang học.
1.2. Các kỹ thuật khác
- Phản ứng kết hợp bổ thể (Complement fixation test) Trong phản ứng này có 2 hệ
thống tham gia:
+ Hệ thống 1 gồm có KN và huyết thanh bệnh nhân cần tìm KT
+ Hệ thống 2: hồng cầu cừu (HCC) và huyết thanh kháng HC (KHC) cừu. Trong đó,
trung gian giữa hai hệ thống này là bổ thể (BT): Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có KT
thì KT sẽ kết hợp với KN, bổ thể sẽ gắn với phức hợp KN-KT. Vì bổ thể đã được chuẩn
độ trước chỉ đủ để kết hợp với phức hợp KN- KT nên bổ thể không còn để kết hợp với
phức hợp HCC- KHC của hệ thống 2 khi cho thêm vào, do vậy HC cừu không bị tan.
- Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination - Inhibition ):
Do một số virus có cấu trúc bề mặt mang KN có khả năng làm ngưng kết HC. Do
vậy dựa vào tính chất này ta chuẩn đoán được virus.
- Phản ứng trung hòa (Neutralization):
Do KT có thể làm mất khả năng gây nhiễm của virus đối với tế bào nuôi cấy hoặc
động vật thí nghiệm. Vì vậy, dựa vào tính chất này người ta xác định được KT đặc hiệu
trong huyết thanh. Tuy nhiên, kết quả này thực hiện khó khăn và cho kết quả chậm.
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immuno fluorescene) và miễn dịch phóng xạ
(Radioimmuno assay).
Cả hai kỹ thuật này đều là kỹ thuật miễn dịch đánh dấu giống ELISA, nhưng chất
đánh dấu dùng để xác định phức hợp KN-KT là huỳnh quang hoặc chất phóng xạ. Các kỹ
thuật này thường ít được sử dụng.
2. Chẩn đoán các bệnh nhiễm virus
2.1. Nguyên lý
Sử dụng KT mẫu hoặc các thiết bị khoa học để xác định trực tiếp virus hoặc các
thành phần hay chất chuyển hoá của chúng (acid nucleic hoặc protein).
2.2. Các kỹ thuật xác định nhanh
Kỹ thuật ELISA: Về nguyên lý cũng giống như kỹ thuật tìm KT, nhưng mục đích
ở đây là tìm KN.
Bài giảng thực hành Vi sinh đại cương Trang

- Miễn dịch huỳnh quang: Kỹ thuật này dùng chất màu huỳnh quang gắn vào KT để
phát hiện KN của virus.
- PCR (Polymerase chain reaction): Đây là kỹ thuật khuyếch đại phân tử ADN và
ARN có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Có thể phát hiện được acid nucleic (ADN hoặc
ARN) của virus sau khi được khuếch đại nhờ polymerase.
- Probes: Một số đoạn ADN của virus gắn chất phóng xạ thường được dùng để phát
hiện genome hoặc mARN của virus trong mô hoặc dịch cơ thể bệnh nhân bằng phép
lai phân tử.
- Kính hiển vi điện tử: Có thể phát hiện trực tiếp virus và hình thể của chúng. Tuy
nhiên, ít sử dụng vì đòi hỏi bảo hộ và trang thiết bị hiện đại
- Tìm các thể vùi trong cơ thể: Một số virus có thể tạo ra các khối đặc biệt nằm trong
nhân hoặc bào tương của tế bào nhiễm trùng (Ví dụ: Thể negri trong bệnh dại). Cho
nên, có thể phát hiện các thể vùi này bằng thuốc nhuộm với các đặc điểm riêng của
nó.
2.3. Phân lập và xác định virus
2.3.1. Các phương pháp lập virus
Sau khi lấy bệnh phẩm thì phải diệt hết tạp khuẩn bằng kháng sinh rồi mới nuôi
cấy phân lập virus. Hiện nay, có 3 phương pháp thường dùng :
- Nuôi cấy phân lập trên tế bào cảm thụ:
+ Có 2 loại tế bào thường dùng để nuôi cấy phân lập virus, đó là: tế bào tiên phát (Ví dụ :
tế bào thận khỉ) và tế bào thường trực (Ví dụ: tế bào Hela...).
+ Bệnh phẩm được gây nhiễm vào các tế bào nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh dưỡng
như acid amin, muối khoáng và huyết thanh. Nhiệt độ thường là 37 oC và khí trường CO2
và O2 cũng phải luôn cân bằng.
+ Để phát hiện khả năng huỷ hoại tế bào của virus, ta có thể dựa vào các dấu hiệu là:
nguyên sinh chất tế bào bị tiêu huỷ, do đó tế bào co tròn và không bám được vào thành
chai. Ngoài ra, có thể virus tạo ra các ổ phá huỷ, môi trường trở thành màu đỏ tím.
- Nuôi cấy phân lập trên bào thai gà:
Thường dùng những quả trứng ấp được 8-11 ngày, soi lên đèn trong buồng tối để
xác định buồng hơi và vị trí bào thai. Đục một lỗ ở buồng hơi rồi chọc kim tiêm qua, bơm
khoảng 0,2 ml bệnh phẩm vào vị trí đã xác định ( tuỳ theo từng virus). Cuối cùng, dùng
farafin nóng chảy hàn kín lỗ thủng ở lại và tiếp tục cho ấp ở 35-36 oC với thời gian tuỳ
từng loại virus.
- Phân lập virus trên động vật thí nghiệm:

Một số virus chỉ có thể phân lập bằng cấy truyền lên động vật thí nghiệm, thông
thường nhất là chuột. Sau khi cấy truyền thì động vật thí nghiệm sẽ được quan sát các
dấu hiệu của bệnh hoặc chết do virus gây ra.
2.3.2. Xác định virus
Sau khi thu hoạch virus nuôi cấy phân lập được, chúng ta có thể xác định các virus
này nhờ huyết thanh mẫu (standard sera) bởi các phản ứng: ngăn ngưng kết hồng cầu, kết
hợp bổ thể, trung hoà và miễn dịch huỳnh quang.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Giáo trình thực hành vi sinh vật học – Đại học y dược TPHCM
2. Giáo trình thực hành vi sinh vật học – Đại học y dược Cần Thơ

Thực Hành VI Sinh - Chỉnh Sửa

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Thực Hành VI Sinh - Chỉnh Sửa

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Trường Đại học Nam Cần Thơ Khoa Dược

BÀI 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN....................13

BÀI 5. KHÁNG SINH ĐỒ...............................................................................................30

BÀI 6. CHUẨN ĐOÁN TỤ CẦU KHUẨN....................................................................34

BÀI 7. CHUẨN ĐOÁN LIÊN CẦU KHUẨN VÀ PHẨY KHUẨN TẢ........................36

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 1

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 2

+ Đậy lamell kính lên giọt dịch.

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 3

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 4

3.2. Phương pháp nhuộm ngược

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 5

3.4. Nhuộm Gram

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 6

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 7

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 8

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 9

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 10

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 11

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 12

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 13

- Môi trường đặc: có khoảng 2% agar

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 14

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 15

3. Thành phần môi trường nuôi cấy

Cấy vi khuẩn bằng que cấy

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 16

2. Phân lập vi khuẩn

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 17

2. Phương pháp xác định vi khuẩn

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 18

2.1.2. Khảo sát vi khuẩn trong môi trường lỏng

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 19

 Phương pháp giọt treo

Vi khuẩn di động làm đục hết ống

Vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 20

CÁC BƯỚC CHUNG ĐỂ NHẬN ĐỊNH VI KHUẨN

Cấy mẫu trên môi trường

Phân lập trên các môi trường thích hợp

YÊU CẦU THỰC HÀNH

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 21

4. Nhuộm Gram kết quả vi khuẩn đã phân lập được

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 22

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 23

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 24

c. Đọc kết quả

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 25

Tryptophan Indole + Pyruvic acid + Ammonia

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 26

Môi trường KIA Lac Glu Man MR VP Indol Citrat Urease

II. KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÝ HÓA

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 27

1. Các tác động vật lý

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 28

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 29

Bài giảng Thực hành Vi sinh đại cương Trang 30

Bài giảng thực hành Vi sinh đại cương Trang 31

1.2.2. Phương pháp

Lượng kháng sinh (dung dịch mẹ) 1 Đối

Lượng môi trường (ml) 9 5 5 5 5 5

Nồng độ kháng sinh (µg/ml) 16 8 4 2 1 0

Lượng vi khuẩn (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3