W 1939 roku Hill wykazał, że oświetlane chloroplasty w obecności odpowiednich

akceptorów, np. potasu heksacyjanożelazianu (III), powodują rozszczepianie wody przy

nieobecności CO2, czemu towarzyszy wydzielenie tlenu (2a, 2b).

Zredukowaniu czterech równoważników akceptora odpowiada wydzielenie jednej cząsteczki

tlenu à reakcja Hilla – przyczyniło się to zjawisko do wyjaśnienia roli wody jako źródła
elektronów do redukcji CO2 i ostatecznego potwierdzenia, że tlen wydzielający się w trakcie
fotosyntezy pochodzi z wody.
à wykazuje możliwość oddzielenia fotochemicznej reakcji wydzielania O2 od
fotosyntetycznej redukcji CO2

Reakcja Hilla – wykazanie, że znajdujące się w roztworze wodnym izolowane chloroplasty w

obecności akceptora elektronów dokonują rozszczepienia wody i jest to proces zależny od
światła.

- przykładem reakcji Hilla jest redukcja 2,6-dichlorofenoloindofenolu (2,6-DCIP) przez

naświetlone chloroplasty
- naświetlenie zawiesiny chloroplastów w środowisku wodnym pozbawionym CO2 i
zawierającym 2,6-DCIP (akceptor elektronów) powoduje wydzielanie się tlenu, pomimo
braku CO2 a 2,6-DCIP znajdujący się w roztworze ulega redukcji z formy utlenionej
(niebieska) do zredukowanej (bezbarwna)
- w warunkach in vivo ostatecznym akceptorem elektronów jest NADP+, ale przeprowadzając
in vivo z wykorzystaniem izolowanych chloroplastów, można go zastąpić innymi związkami,
np. 2,6-DCIP
- szybkość redukcji 2,6-DCIP ocenia się kolorymetrycznie, dokonując pomiarów absorbancji
roztworu przy długości fali 600nm.
- spadek absorbancji wynikający ze zmniejszenia stężenia utlenionej formy 2,6-DCIP na
skutek jego redukcji jest skorelowany z intensywnością procesu rozszczepienia wody przez
izolowane chloroplasty.
WYKONANIE DOŚWIADCZENIA:
1. Zawiesina chloroplastów (moździerz, homogenizować przez 5’ z 18cm3 schłodzonego
0,5M r-r sacharozy. Homoent przesączyć przez podwójną warstwę Miracloth.)
2. Umieścić w probówce zawiesiny chloroplastów i poddać termicznej denaturacji,
delikatnie ogrzewając aż do wrzenia.
3. Ochłodzić probówkę i przesączyć przez włókninę
4. Do prob. Dodać roztwór inkubacyjny, do 1 dodać sacharozę, do 2 zagotowaną
zawiesinę chloroplastów, do 3 świeżą zawiesinę chloroplastów.
5. Do I cz. prob. Dodać r-r 2,6-DCIP, zamieszać i zmierzyć absorbancję
6. II cz. Prob. Wystawić na działanie żarówki 100W

- wraz z upływem czasu inkubacji, absorbancja maleje.

- najszybsze zmiany zaszły w próbie, gdzie znajdowały się świeże chloroplasty wystawione na
działanie światła
- najsłabsze zmiany są widoczne w próbie z chloroplastami zdenaturowanymi
- zmiany absorbancji w badanych próbach są związane z fotolizą wody
- różnice w zmianach absorbancji w badanej próbie, związane są z intensywnością procesu
fotolizy wody.
- optymalnymi warunkami dla fotolizy wody w chloroplastach są chloroplasty naświetlane
światłem.

- głównym dostępnym źródłem azotu dla roślin są azotany.

- przyswajanie azotu w formie jonów azotanowych wymaga ze strony rośliny znacznego
nakładu energii
- azot może być wykozystany do budowy ziązków organicznych dopiero po redukcji
azotanów do amoniaku (do at. Azotu zostaje przyłączonych 8 elekronów)
redukcja jonów azotanowych do amonowych przebiega dwustopniowo
- 1 etap: redukcja azotanów do azotynów katalizowana przez reduktazę azotanową,
przebiega zgodnie z reakcją:

---à
Reakcja ta zachodzi w cytoplazmie komórek, dawcą elektronów do redukcji jonów NO3 – jest
NADH.
Reduktaza azotanowa jest homotetramerem, który zawiera FAD, cytochrom b557 oraz
molibdenopterynę

rozproszenie e- z
NADH na NO3 przez kofaktory reduktazy azotaowej

- reduktaza azotanowa jest enzymem indukowanym – jest syntetyzowana tylko w

obecności substratu, czyli azotanów
- aktywność tego enzymu jest proporcjonalna do stężenia azotanów w komórce.
- synteza reduktazy azotanowej jest regulowana przez azotan na poziomie ekspresji genu
- obecność azotanów jest niezbędna do utrzymania odpowiedniego poziomu białka
reduktazy azotanowej, które bez substratu ulega degradacji
- czynnikiem warunkującym aktywność reduktazy azotanowej jest obecność molibdenu, oraz
światło

- 2 etap: redukcja azotynów do jonów amonowych katalizowana przez reduktazę

azotynową, przebiegająca zgodnie z reakcją:

- Reakcja ta zachodzi w chloroplastach, a w niefotosyntetyzujących częściach roślin (np.

korzenie) – w innych plastydach.
- dawcą elektronów do redukcji azotynów jest zredukowana ferredoksyna (Fd).
- w fotosyntetyzujących tkankach roślin redukcja ferdoksyny zachodzi w fazie jasnej
fotosyntezy
- w tkankach niefotosyntetyzujących ferredoksyna jest redukowana przez NADPH2 –
pochodzący ze szlaku pentozofosforanowego
- powstające jony amonowe mogą być następnie wbudowywane w strukturę aminokwasów,
co stanowi właściwą asymilację azotu

1. Oznaczanie aktywności reduktazy azotanowej

- miarą aktywności reduktazy azotanowej w liścieniach ogórka jest ilość azotynów
powstałych w czasie inkubacji liścieni w buforze zawierającym azotan. Oznacza się
stężenie jonów NO2 – w płynie poinkubacyjnym.
Wykonanie:

- różnice w absorbancji są spowodowane różną ilością azotynów

- im ciemniejsza barwa roztworu, tym większe stężenie NO2 – które powstały
podczas redukcji azotanów do azotynów, katalizowanej przez reduktazę azotanową
- wraz ze wzrostem stężenia NO2 – absorbancja wzrasta. Aktywność reduktazy
azotanowej jest najwyższa w próbie zawierającej liścienie hodowane w 0,1 M KNO3,
a najmniejsza w próbie zawierającej liścienie hodowane w H2O
- wraz ze wzrostem stężenie azotanów w podłożu, aktywność reduktazy azotanowej
rośnie
- gdy w podłożu nie ma azotanów, reduktaza azotanowa ma aktywność bliską zeru
- reduktaza azotanowa jest enzymem indukowanym – jest syntetyzowana i aktywna
tylko w obecności azotanów
W fazie ciemnej fotosyntezy, zlokalizowanej w tylakoidach gran chloroplastów następuje
asymilacja CO2 oraz wytworzenie cukrów prostych w postaci trioz lub heksoz
FAŁSZ

W fazie ciemnej fotosyntezy, woda jest źródłem elektronów do redukcji CO2 oraz źródłem
O2 jako produkt uboczny fotosyntezy
Falsz

W fazie ciemnej fotosyntezy zlokalizowanej w stromie chloroplastów następuje asymilacja

CO2 oraz wytworzenie cukrów prostych
???p

W fazie jasnej fotosyntezy, woda jest źródłem elektronów do redukcji CO2 oraz źródłem O2,
generowanego jako główny produkt fotosyntezy
FAŁSZ

W fazie jasnej fotosyntezy przebiegającej w tylakoidach gran i stromy chloroplastów,

wytwarzana jest asymilacyjna siła wykorzystywana w fazie ciemnej fotosyntezy
???p

W fazie jasnej fotosyntezy woda jest donorem e- dla kompleksu manganowego oraz źródłem
O2 który stanowi produkt uboczny
???p

W fazie jasnej fotosyntezy, przebiegającej w stromie chloroplastów, wytwarzana jest siła

asymilacyjna, wykorzystywana w fazie ciemnej fotosyntezy
?p

Kompleks enzymatyczny, zawierający atomy molibdenu pośredniczy w procesie rozkładu

wody na elektrony, protony i tlen. Atomy te przechodząc na wyższy stopień utlenienia
przekazują kolejno elektrony do chlorofilu P680, w czym pośredniczy tyrozyna. Dopiero po
odłączeniu od atomów 2 elektronów następuje rozszczepienie 2 cząsteczek wody na 4
elektrony, 4 protony i cząsteczkę tlenu.

Rośliny pobierają azot aktywnie, wbrew gradientowi elektrochemicznemu, w formie jonu

azotanowego oraz biernie w formie jonu amonowego. Istotnym czynnikiem ułatwiającym
pobieranie jonu azotanowego jest jego rozproszenie w roztworze glebowym, w porównaniu
z jonem amonowym, który często ulega sorpcji przez koloidy glebowe.

Rośliny pobierają azot aktywnie, wbrew gradientowi elektrochemicznemu, w formie jonu

azotanowego oraz biernie w formie jonu amonowego. Ważnym czynnikiem regulującym
dostępność azotu w glebie dla roślin jest pH. Pobieranie jonów amonowych zachodzi łatwiej
w środowisku obojętnym i maleje wraz z obniżeniem pH. W warunkach niskiego pH łatwo
pobierane są jony azotanowe.

W reakcji Hilla wydzielenie 1 cz. Tlenu związane jest z redukowaniem 4 równoważników

utleniacza. Reakcja Hilla umożliwia oddzielenie fotochemicznej reakcji wydzielania tlenu od
fotosyntetycznej redukcji dwutlenku węgla. Przykładem r. Hilla jest redukcja 2,6-
dichlorofenoloindofenolu przez naświetlone chloroplasty.

Czynnikiem niezbędnym do rozszczepienia wody w chloroplastach jest obecność dwutlenku

węgla w stromie.
FAŁSZ

Czynnikiem niezbędnym do rozszczepienia wody w chloroplastach, któremu towarzyszy

wydzielenie tlenu O2 jest obecność dwutlenku węgla CO2
FAŁSZ

Czynnikiem niezbędnym do rozszczepienia wody w fotoukładzie Ps I, któremu towarzyszy

wydzielenie … dwutlenku węgla CO2
PRAWDA

Czynnikiem niezbędnym do rozszczepienia wody w fotoukładzie Ps II, któremu towarzyszy

wydzielenie tlenu O2 jest dostęp do światła
PRAWDA

Które z poniższych zdań NIE jest prawdziwe:

- Masa tkanki roślinnej użytej do wykonania analizy procesu rozszczepienia wody nie ma
wpływu na intensywność zachodzących reakcji
- Homogenizacja tkanki roślinnej w roztworze sacharozy pozwala na otrzymanie zawiesiny
świeżych chloroplastów, posiadającychotoczkę chloroplastową oraz zdegradowane błony
tylakoidów

+ traktowanie chloroplastów wysoką temp. Powoduje zmianę ich struktury oraz wpływa
negatywnie na proces rozszczepienia wody
+ brak dostępu do światła jest czynnikiem, który zmniejsza intensywność procesu rozszczepu
wody
+ dostęp do światła jest czynnikiem który zwiększa intensywność procesu rozszczepienia
wody
+ Homogenizacja tkanki roślinnej w roztworze sacharozy pozwala na otrzymanie zawiesiny
świeżych chloroplastów, posiadającychotoczkę chloroplastową oraz funkcjonujące błony
tylakoidów
+ 2,6 DCIP ulega redukcji z formy utlenionej do zredukowanej
+ masa tkanki roślinnej użytej do wykonania analizy procesu rozszepienia wody ma wpływ na
intensywność zachodzącej reakcji

Która z wymienionych cech NIE dotyczy reduktazy azotanowej:

- Enzym indukcyjny, którego synteza jest regulowana egzogennie przez substrat NO2

+ aktywność enzymu jest kontrolowana przez światło absorbowane przez fitochrom

+ głównym donorem elektronów dla tego enzymu jest NADH
+ homotetramer białkowy, zbudowany z 4 podjednostek połączonych ze sobą
niekowalencyjnie
WYKRES
- próba zawierająca świeże chloroplasty, oświetlana 20 min P4
- próba zawierająca świeże chloroplasty, oświetlana 10 min, inkubowana w ciemności 10 min
P3
- próba zawierająca zdenaturowane chloroplasty, oświetlana 20 min P1
- próba zawierająca świeże chloroplasty, inkubowana w ciemności 10 min, oświetlana 10 min
P2

Rola 2,6 DCIP – akceptor elektronów w r. Hilla, zastępuje NADP+, pod wpływem światła
przechodzi w formę zredukowaną w środowisku wodnym

Rola H2O – woda ulega rozszczepieniu, z 2 cz. H2O pod wpływem światła powstaje tlen, 4H+,
4e-

Rola CO2 odbarwienie 2,6 dcip zachodzi nawet w przypadku całkowitego braku co2 w
układzie, co2 nie jest niezbędne do rozszczepienia wody
Zmiana barwy niebieskiej na bezbarwną

Reduktaza azotynowa:
6 FD zred.

Redukcja azotanów
NADH

WYKRES
Wykonano doświadczenie mające na celu określenie aktywności reduktazy azotanowej w
liścieniach ogórka, której miarą jest ilość azotynów powstałych w czasie inkubacji liścieni w
buforze zawierającym azotany. Na podstawie uzyskanych wyników absorbancji określ, w
którym wariancie próby wymienione są zgodnie z malejącą aktywnością reduktazy
azotanowej
OD NAJWIĘKSZEJ DO NAJMNIEJSZEJ