Chương 5: Công nghệ sinh học thực vật.

Nuôi cấy mô thực vật.

- Là quá trình nuôi cấy vô trùng các bộ phận tách rời khác nhau của thực
vật.

Môi trường nuôi cấy mô thực vật:

Môi trường nuôi cấy phải bao gồm các nhóm chất căn bản sau:
-Các chất vô cơ đa lượng: N, P, K, S, Ca, Mg…
- Các nguyên tố vi lượng: Mn, Zn, Br, Cu, …
- Các vitamin
- Nguồn cacbon (glucose hoặc sucrose)
- Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, gibberellic
axit, abscisic axit …)

Mẫu nuôi cấy mô.

+ Mẫu dùng để nuôi cấy mô có thể thu nhận từ hầu hết các bộ phận của
cây như: rễ, thân, lá, phấn hoa… ➔ Tùy vào mục đích mà chọn mẫu
tương ứng.
+ Nguyên tắc cơ bản khi chon mẫu: Mẫu phải chứa các tế bào sống từ
các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỷ lệ lớn và dễ tạo
mô sẹo.
+ Mẫu phải được vô trùng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
 Một số kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật:
Nuôi cấy mô phân sinh:
- Mẫu nuôi cấy có nhiều loại, nhưng thường dùng là các mô phân sinh
đỉnh cành.
- Mô phân sinh được cắt, khử trùng → nuôi cấy trong môi trường thạch.
- Nếu điều kiện môi trường thích hợp thì trên mẫu cấy các tế bào sống
phân chia tạo thành 1 khối tế bào goị là mô sẹo.
- Mô sẹo sau khi được hình thành có thể được sử dụng theo các hướng
khác nhau:
+ Tạo cụm chồi: Nếu để mô sẹo tiếp tục phát triển thì sẽ tạo nên cụm
chồi. Các chồi sẽ phát triển thành các cây con.
+ Tách mô sẹo ra thành nhiều dòng thứ cấp và tiếp tục nhân khối tế bào
để phục vụ cho các mục đích khác nhau như tạo tế bào trần hoặc xử lý
thành tế bào rời để nuôi cấy tế bào đơn
Nuôi cấy mô hoặc cơ quan tách rời: Kỹ thuật nuôi cấy này cho phép
hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên các cơ quan tách rời
hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết
cắt của mẫu vật.
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:
a/ Nuôi cấy bao phấn:
+ B1: Chọn bao phấn: giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết
định trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân
bào giảm nhiễm một lần.
+ B2: Xử lí nụ hoa: Xử lí ở nhiệt độ thấp sau khi nụ hoa cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào
tử( hạt phấn đơn nhân) để tạo cây đơn bội.
+ B3: Chọn môi trường thích hợp.
+ B4: Chọn lọc cây đơn bội.
Một số phương pháp chọn lọc cây đơn bội:
+ Đếm số lượng NST;
+ Đo gian tiếp hàm lượng AND của tế bào, trồng cây tái;
+ So sánh với cây mẹ về hình hài, kích thước, khả năng sinh trưởng,…..
b/ Nuôi cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy tương tự như nuôi cấy
bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi
nuôi. Các hạt phấn này được nuôi trong môi trường lỏng kèm theo
chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng.

Ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật;

+ Nhân giống vô tính trên quy mô lớn

+ Sản xuất cây giống sạch mầm bệnh

+ Lập ngân hàng gen thực vật

Chuyển gen thực vật.

Chuyển gen – là kỹ thuật đưa đoạn DNA từ một loài vào tế bào hoặc cơ
thể của loài khác và theo dõi biểu hiện của đoạn DNA mới này. Những
thực vật được tạo ra bằng phương pháp chuyển gen được gọi là thực vật
chuyển gen (genetically modified plant – GMP, transgenic plant).
*Thực vật chuyển gen có thể mang những đặc tính di truyền quý mà cây
trồng truyền thống không có được.

Các kỹ thuật chuyển gen thực vật

- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
+Vector được sử dụng phổ biến để chuyển gen mới vào tế bào thực vật
là Ti-plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đất Ti-plasmid có khả năng kết
hợp 1 đoạn DNA của nó (T-DNA) vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào
thực vật → được sử dụng làm vector chuyển gen ở thực vật.( Coi vd ở
pp)

Quy trình chuyển gen bằng Ti-plasmid:

- Ti-plasmid được phân lập từ vi khuẩn.
- Gen ngoại lai cần chuyển được cài vào giữa vùng T-DNA của plasmid
→ tạo plasmid tái tổ hợp
- Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào thực vật/ hoặc biến
nạp lại tế bào vi khuẩn rồi cho vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp lây
nhiệm các tế bào thực vật. Khi plasmid tái tổ hợp vào được trong tế bào
thực vật thì T-DNA của nó sẽ kết hợp với DNA nhiễm sắc thể của tb
thực vật.
- Tái sinh các tế bào mang gen biến nạp thành cây hoàn chỉnh. Cây tạo
thành sẽ mang trạng mới được quy định bởi gen biến nạp.
+ Chuyển gen trực tiếp.

Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

Chuyển gen trực tiếp bằng vi tiêm: là pp chuyển gen trực tiếp chủ yếu
vào các tế bào trần.
+ Kỹ thuật chuyển gen vào lục lạp.
Kỹ thuật này dựa trên sự biểu hiện của một phân tử RNA – gọi là phân
tử RNA antisene. Phân tử này bổ sung với sản phẩm phiên mã của một
gen (RNA sense), tạo nên mạch kép, làm cho mRNA sense bị bất hoạt
và không thể dịch mã cho một protein hay enzyme tương ứng.

Ứng dụng của thực vật chuyển gen.

- Cải tạo giống cây trồng:
+ Tạo cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ.
+ Tạo cây trồng chuyển gen kháng sâu bệnh.
+ Tạo cây trồng kháng các virus thực vật.
+ Cây trồng chuyển gen có hàm lượng dinh dưỡng cao.
+ Vaccine thực phẩm (edible vaccine)

Mối lo ngại về sức khoẻ và môi trường liên quan đến CNSH
thực vật.
- Lo ngại về sự ảnh hưởng của các gen ngoại lai được chèn vào
trong thực vật như:
+ Gây dị ứng.
+ Gây ung thư.
+ Các gen marker kháng kháng sinh (Antibiotic-resistance marker
genes) có thể truyền qua cho các vi khuẩn gây bệnh ở người…
- Mối lo ngại về môi trường.
+ Ảnh hưởng đến đa dạng sinh học.
VD: thực vật chuyển gen kháng sâu bệnh có thể tiêu diệt cả những loài
côn trùng có lợi.
+Gen kháng thuốc diệt có có thể được truyền qua cho cả những loài cỏ
dại.