TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
⁂

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME

Giảng viên hướng dẫn:

MS nhóm: S2,4-N6
Sinh viên thực hiện:
Huỳnh Thị Yến Nhi MSSV: 61900491
Đoàn Triệu Vy MSSV: 61900631
Ân MSSV: 620
Sang MSSV: 620
 MỤC LỤC

Bài số 1: THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN VÀWHEY PROTEIN TỪ SỮA BÒ....3

Bài số 2: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH.......16

Bài số 3: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA...........29

Bài số 4: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME INVERTASE TỪ NẤM MEN. 47

Bài số 5: XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC CỦA INVERTASE........................56

2
 Điểm
Bài số 1: THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN
VÀWHEY PROTEIN TỪ SỮA BÒ

I. Tổng quan:
1.1. Giới thiệu về casein sữa:
Casein được chia làm bốn nhóm phụ: αs1, αs2, β và κ-casein. Cả bốn nhóm này đều
có cấu trúc không đồng nhất.

Điểm chung giữa casein α và β là các amino acid được este hóa bởi phosphoric
acid. Do có nhiều nhóm phosphate và những nhóm kỵ nước trong phân tử casein, các
phân tử polymer được hình thành từ casein rất đặc biệt và bền. Những phân tử này được
cấu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch
keo, tạo nên màu trắng của sữa. Những phức chất này được gọi là các micelle casein.

Xác định hàm lượng Casein trong sữa theo phương pháp Kjeldahl.

Whey protein là tên gọi thông dụng để chỉ các protein huyết thanh của sữa. Nếu
casein được tách ra khỏi sữa gầy bằng cách bổ sung axit khoáng thì một nhóm protein
vẫn còn lại trong dung dịch sữa và được gọi là protein huyết thanh sữa, chiếm gần 20%
protein trong sữa. Chúng rất dễ hòa tan và có thể được xếp vào chia thành các nhóm sau:

 α-lactalbumin
 β-lactoglobulin
 Albumin huyết thanh
 Immunoglobulins
 Protein hỗn tạp và polypeptide

1.2. Các dạng chế phẩm protein:

Protein concentrate: Là chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu là 65 %.
Protein concentrate có nhiều dạng: hạt, sệt hoặc bột mịn. Chế phẩm có chứa nhiều chất

3
xơ, giàu protein và amino acid được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực: thực phẩm chức
năng, thực phẩm chay, thức ăn gia súc làm tăng giá trị dinh dưỡng sản phẩm.

Protein isolate: Giống chế phẩm protein concentrate nhưng chứa hàm lượng
protein thực vật rất cao 90 %. Protein isolate chứa hầu hết các amino acid cần thiết cho sự
phát triển nhưng chứa hàm lượng chất béo thấp giúp ngăn ngừa chứng loãng xương, ung
thư, các triệu chứng thời kì mãn kinh,…

II. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH THỰC TẾ:

2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ

Hình 1. 1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm casein và whey protein từ
sữa bò

4
2.2 . Thuyết minh thực tế:
- Gia nhiệt: cho becher chứa khoảng 100 mL sữa vào bể điều nhiệt cho đến khi
sữa đạt 40 oC.

Hình 1. 2 Gia nhiệt sữa đến 40 oC

- Kết tủa casein: dùng dung dịch acetic acid 10 % điều chỉnh pH sữa đến pI của
casein (pH = 4,60) để casein kết tủa, để yên hơn 5 phút.

Hình 1. 3 pH từ sữa sau khi cho acetic acid

5
- Ly Tâm: Thu tủa bằng cách cho hỗn hợp sữa sau khi kết tủa bằng acetic acid
vào ống sau đó cho vào máy ly tâm 6000 vòng/ 10 phút) và thu tủa casein còn
phần dung dịch whey chiết ra một erlen mới.

Hình 1. 4 Dịch Whey thu được sau khi ly tâm

- Rửa tủa bằng cách cho: Đầu tiên cho nước cất lạnh 4 oC vào với lượng khoảng
gấp đôi tủa tiếp tục ly tâm. Tiếp tục bỏ phần nước đi và cho ethanol 95% vào
tiếp tục ly tâm thu tủa. Cuối cùng cho ether dầu hỏa và để khử béo và sau đó là
thu tủa. Lưu ý khi cho ống ly tâm vào máy ly tâm khối lượng của các ống phải
bằng nhau đặt đối xứng qua trục để tránh hư máy.

6
Hình 1. 5 Khối lương casein thu được Hình 1. 6 Khối lương casein thu được
trước khi ly tâm (1) sau khi ly tâm (2)

- Sấy: sấy casein và giấy lọc đến khi khối lượng không đổi, sau đó đem cân và
tính được lượng casein thu nhận.

Hình 1. 7 Casein được đem đi sấy ở 55 oC

7
Thu dịch whey protein: Dịch whey sau khi ly tâm thu được cho vào becher riêng và gia
nhiệt lên 70 oC. Sau đó điều chỉnh pH từ 4,6 về pH 4. Sau đó trữ mẫu ở ngăn mát 4 oC.

Hình 1. 8 Gia nhiệt whey lên 70 oC và chỉnh pH về 4

III. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả.

3.1.1. Thu nhận casein.

_ Khối lượng giấy ban đầu cân được: 0.46 g.

Hình: Khối lượng giấy cân

_ Thu được casein sau khi sấy:

8
 Hình: Casein thu được sau khi sấy
 Sau khi sấy khô thu được:
mtổng= 4,41(g)
mgiấy= 0,46 (g)
⟶ mcasein = 4,41 – 0,46 =3,65 (g)

3.1.2. Kiểm tra độ ẩm

_ Cân 1g casein thu được sau sấy để vào cân sấy ẩm

1g casein đã sấy khô để vào cân

9
 3.1.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford:

a. Dụng cụ, hóa chất

Máy UV-VIS
Ống nghiệm 10
Giá ống nghiệm 1
Pipet 1mL 2
Pipet 5mL 1
Cốc thủy tinh 100 mL 3
_ Dung dịch protein chuẩn: dung dịch albumin có 0.1mg/mL.
_ Dung dịch thuốc thử Bradford có thành phần như sau:
+ Coomassie Brillian Blue G-250: 0.05g
+ Ethanol tuyệt đối: 47g
+ Phosphoric acid: 85g
Coomassie Brillian Blue G-250 được hoà tan trong ethanol, bổ sumg acid
phosphoric và định mức đến 1000 mL bằng nước cất. Lọc chân không, cho
vào chai tối, giữ 4oC.

b. Cách tiến hành

_ Bước 1
_

3.1.4. Định lượng whey theo phương pháp Bradford:

_ Số ml dịch whey thu được: V = 74 (ml)

10
 Hình 1. 9 Số ml dịch whey thu được
_ Bước 1: Xây dựng đường chuẩn
Sử dụng dung dịch protein chuẩn là albumin tinh khiết đã biết trước nồng
độ.
Lấy 6 ống nghiệm đánh số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5.Bổ sung các thành phần
vào ống nghiệm theo bảng sau:

Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nước cất (mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Albumin 0.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
mg/mL (mL)
Thuốc thử
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
Bradford (mL)
Hàm lượng
0 10 20 30 40 50
albumin (μg)

11
 Hình 1. 10 Các ống nghiệm được pha với nồng độ tăng dần
3.1.4. Biện luận:

_ Thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong chế phẩm bằng phương pháp
Bradford:
_ Kết quả dựng đường chuẩn hoặc mẫu có thể không đạt như mong muốn vì
những lí do sau:
 Trong quá trình làm, do rửa dụng cụ không sạch hay chưa
thật sự khô ráo nên dẫn đến nhiễm hóa chất gây sai lệch thể
tích.
 Thao tác chưa cẩn thận, dùng micropipet hoặc pipet chưa
đúng cách.
 Tính toán độ pha loãng chưa đúng.


12
 Điểm
Bài số 2: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH
Ngày thí nghiệm: 10/3/2022

I. TỔNG QUAN:
1.3. Giới thiệu về enzyme urease:

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm
amidase. Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5. Tên hệ thống là:
Carbamate amide hydrolase. Trong đó: số 3 chỉ nhóm chính – hydrolase, số 5 chỉ
nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C - N khác liên kết peptide, số 1 chỉ phân
nhóm phụ cắt các amide thẳng (amide hyrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease
trong phân nhóm phụ.

Trong tự nhiên có hơn 200 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme
urease như H.pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia
enterocolitica, Bacillus pasterurii, Escherchia coli…. Enzyme urease cũng có ở
dịch tiêu hoá của các động vật như trâu, bò, dê, chó.

Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây
thuộc họ đậu như đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine
hispida)…

Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic và
amoniac theo phương trình sau:

13
 Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc
nhận biết sự có mặt của ure trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa.

1.4. Hóa chất – dụng cụ thí nghiệm:

Dụng cụ - thiết bị: Nguyên liệu – Hóa chất:

- Micropipet 10 – 100 µL, 100 –
1000 µL.
- Pipet 5mL: 2, pipet 1mL: 2
- Ống đong 100mL: 1
- Cốc 500mL: 1
- Cốc 100mL: 2
- Ống nghiệm thường: 15
- Ống nghiệm nhỏ: 10
- Đũa khuấy: 1
- Muỗng cân hóa chất: 1
- Quả bóp cao su: 1
- Ống hút nhỏ giọt nhựa: 2
- Đậu nành (200g/lớp)
- Acetone
- Dung dịch Ba(OH)2 2%.
- Dung dịch Cystein 5.10-3M, EDTA
5.10- 3M pha trong đệm phosphate
1/15M pH 7.
- Dung dịch NH4Cl chứa 10μg
NH3/mL.
- Thuốc thử Nessler (Merck).
- Dung dịch urea 2% pha trong đệm
phosphate 1/15M pH 7.
- Đệm phosphate 1/15M pH 7.
- HCl 0,5M.
- Thuốc thử Bradford.

II. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH THỰC TẾ:

2.1. Chuẩn bị:

- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp Bradford: Lấy từ bài 1
Hàm lượng albumin (µg) OD
0 0
10 0.101
20 0.216
30 0.303
40 0.467
50 0.554

14
 ∆ OD = 0.328
PT đường chuẩn: y = 0.0113x - 0.009

- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp Nessler:

Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Thể tích NH4Cl (mL) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Lượng NH3 (µg) 0 5.0 10 15 20 25
Thể tích nước (mL) 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
Thể tích Nessler (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Lắc đều và ổn định 15 phút. Các ống được đo mật độ quang tại
bước sóng 490 nm.

15
 Hình 2.1. Xây dựng đường chuẩn
Nessler

Hàm lượng NH3 (µg) OD

0 0
5 0.05
9
10 0.13
7
15 0.19
1
20 0.29
0
25 0.39
8
Phương trình đường chuẩn: y = 0.0156x – 0.0163

16
17
 2.2. Quy trình thí nghiệm
2.2.1. Quy trình trích ly enzyme urease thô

- Nguyên liệu: Đậu nành đã được tách béo. Cân 12 g đậu nành.
- Hòa tan: Đậu nành tách béo hòa tan với 100 mL ete dầu hỏa (tỷ lệ bột: dung
dịch trích ly là 12 g : 100 mL).
- Sau khi trích ly, 1-2 mL dịch urease thô được pha loãng khoảng 20-30 lần để
phân tích hàm lượng protein và hoạt tính urease. Phần dịch urease còn lại sẽ
được đong thể tích và thực hiện kết tủa urease

Đậu nành

Xay nhỏ

Ete dầu hoả (tỷ

lệ: 1g bột: 2mL Trích ly loại lipid Lipid
ete)

Dung dịch EDTA Trích ly urease (pH 7,

Bã
5.10- 3 M, Cystein 12h)
18
5.10-3 M
 Ly tâm (5000 vòng/phút, 10’)

Dịch enzyme
urease thô

Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất dịch enzyme urease thô

Dịch enzyme
urease thô

Lọc

Định mức 50 lần Đo thể tích V1

Dịch A Dịch B

19
- Dịch A được đem đo protein và hoạt tính urease bằng phương pháp Bradford
và Nessler.

2.2.2. Kết tủa acetone enzyme urease

Dịch B

Làm lạnh 4⁰C

Rót dung môi acetone (làm lạnh -20⁰C)

theo thành, khuấy nhẹ

20

Lắng tủa 30 phút

Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất kết tủa acetone enzyme urease

- Bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi bay hơi hết acetone.
- Khối lượng enzyme urease cân được 0.1 g (m = 0.1 g) hòa tan với 100 mL
buffer pH 7 (EDTA + Cystein) trước khi đo protein và hoạt tính urease bằng
phương pháp Bradford và Nessler.

21
 Enzyme urease thu được

2.2.3. Xác định protein trong mẫu bằng bradford:

Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (1 mẫu)
Dung dịch mẫu (mL) 0.1 0
Nước cất (mL) 0.9 1.0
Thuốc thử Bradford (mL) 5.0 5.0
Lắc đều và để ổn định màu trong 15 phút. Đo OD ở bước sóng 595 nm.

22
 Hình 2.2.3. Xác định protein bằng phương pháp
Bradford
2.2.4. Xác định hoạt tính của urease bằng nessler:

Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu)

Nước cất (mL) 0.4 0.4

Dung dịch ure 2% 0.5 0.5

(mL)
Dung dịch HCl 1N 0 0.5
(mL)
Dung dịch Urease (mL) 0.1 0.1

Lắc đều – Để 10 phút

Dung dịch HCl 1N 0.5 0

(mL)
Lấy 0.5 mL của mỗi mẫu vào 6 ống nghiệm khác.

Bổ sung nước cất 5.0 mL, 0.5 mL thuốc thử Nessler, lắc đều và để
ổn định màu trong 15 phút. Đo OD ở bước sóng 490 nm.

23
 Hình 2.2.4. Xác định hoạt tính của urease bằng phương pháp
Nessler

III. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả:
3.1.1. Xác định hàm lượng protein của dịch enzyme urease thô
bằng phương pháp bradford:
_ Số mL dịch enzyme urease thô thu được: V1 = 50 mL.
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:

Ống nghiệm OD
Mẫu Trắng 0
Mẫu Thật 0.214

_ Tính toán kết quả:

• PT đường chuẩn: y = 0.0028x - 0.0002
• Hàm lượng protein thực tế:
0.214+ 0.009 1 −3 protein
P1 = × × 10 × 50=9.87(mg )
0.0113 0.1 mL
Hàm lượng protein tổng:
Pt1 = 9.87 ×50= 493.5 (mg protein)

24
 3.1.2. Xác định hoạt tính urease của dịch enzyme urease thô bằng
phương pháp nessler:
_ Kết quả:

Ống nghiệm OD
Trắng 1 0.105
Trắng 2 0.093
Trắng 3 0.085

Mẫu 1 0.267
Mẫu 2 0.294
Mẫu 3 0.363

_ Suy ra :
∆ OD=∆ ODmtn−∆ ODmt
( 0.267−0.105 ) + ( 0.294−0.093 ) + ( 0.363−0.085 )
¿ =0.213
3

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Nessler: y = 0.0156x – 0.0163.
• Hoạt tính dịch enzyme urease:
y−b 1.5 1 1
A1 = × × × ×F
a 0.5 0.1 17× 10
0.213+0.0163 1.5 1 1
= × × × ×50
0.0156 0.5 0.1 17 × 10

= 129.69 (IU/mL)

• Hoạt tính tổng dịch enzyme urease:

At1 = A1 x V = 129.69 x 50 = 6484.5 (IU)

3.1.3. Xác định hàm lượng protein của bột urease kết tủa bằng
aceton bằng phương pháp bradford:
_ Khối lượng enzyme urease cân được: m = 0.3 g
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:

Ống nghiệm OD

25
 0 0
1 1.157
2 1.121
3 1.168
OD = 1.149

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.0113x - 0.009
• Hàm lượng protein thực tế:
1.149+0.009 1 −3 100
P2 = × ×10 × 3 = 1.025 (mg protein/mg)
0.0113 0.1 0.1 ×10

• Hàm lượng protein tổng:

Pt2 = 1.025× 0.1 × 1000 = 102.5 (mg protein)

3.1.4. Xác định hoạt tính urease của bột urease kết tủa bằng
phương pháp nessler:
_ Kết quả:

Ống nghiệm OD
Trắng 1 0.113
Trắng 2 0.114
Trắng 3 0.115

Mẫu 1 0.148
Mẫu 2 0.158
Mẫu 3 0.115

_ Suy ra:
∆ OD = ∆ ODmtn −¿ ∆ ODmt

26
 ( 0.148−0.113 ) + ( 0.158−0.114 ) +(0.115−0.115)
=
3
= 0.026
_ Tính toán kết quả:
• Phương trình đường chuẩn Nessler: y = 0.0156x – 0.0163.
• Hoạt tính dịch enzyme urease:
y – b 1.5 1 1
A2 = × × × ×F
a 0.5 0.1 17 × 10
0.026+0.0163 1.5 1 1 100
= × × × ×
0.0156 0.5 0.1 17 × 10 0.1 ×1000
= 0.479 IU/mg
• Hoạt tính tổng dịch enzyme urease:
At2 = A2 x m = 0,479 × 0.1 × 1000 = 47.9 (IU)
• Hiệu suất của tổng quá trình:
At 2 47.9
H= × 100 = ×100 = 0.74%
At 1 6484.5
• Độ tinh sạch:
A2 0.479
AP2 P2 1.025 0.467
ŋ= = = = = 0.035
AP1 A 1 129.69 13.14
P1 9.87

IV. BIỆN LUẬN:

_ Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có xảy ra nhiều sai sót:
 Thao tác chưa chuẩn dẫn đến sai số trong quá trình hút dung dịch,
dẫn đến đường chuẩn không đạt yêu cầu. Các số OD không nằm
trong vùng của phương trình đường chuẩn.
 Hiệu suất chưa cao (0.74%) và độ tinh sạch chưa cao (0.035< 1) vì
trong quá trình kết tủa urease bằng aceton, một phần enzyme bị biến
tính do bị oxy hóa. Nguyên liệu có thể chưa được trích ly urease
nhiều và thực hiện thao tác trong lúc đổ aceton vào dịch từ thành
vào quá nhanh dẫn dến enzyme biến tính.

27
 Điểm
Bài số 3: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA
Ngày thí nghiệm: 24/3/2022

I. TỔNG QUAN:
1.5. Giới thiệu về enzyme bromelain:
- Bromelain là một enzyme thuộc lớp enzyme thủy phân (hydrolase), phân giải
protein. Mã số của bromelain: EC.3.4.4.24. Bromelain được tìm thấy trong mô thực
vật của cây họ Dứa (họ Bromeliaceae).
- Hiện tại, bromelain có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Trong
ngành thực phẩm, bromelain được sử dụng làm mềm thịt, thủy phân protein… Trong
ngành dược phẩm, bromelain được sử dụng trong các loại thuốc kháng viêm, kháng
sinh… Ngoài ra, bromelain còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp khác.

1.6. Hóa chất – dụng cụ thí nghiệm:

Dụng cụ - thiết bị: Nguyên liệu – Hóa chất:

- Máy ly tâm - ống falcon 15 Ml - Dứa 200 g
- Máy sấy đông khô - Ethanol 98 %v/v
- Máy xay sinh tố - 300mL Amonium sulfate
- Máy đo UV - Giấy cellophane
- Cốc 500 ML 1 - Chỉ
- Cốc 250mL 2 - Nước cất
- Đũa khuấy 1 - Dung dịch tyrosine chuẩn 1mol/mL:
- Ống nhỏ giọt 1 18,118mg tyrosine hòa trong 100mL HCl
- pipette 10mL 1 0,2N.
- pipette 5 mL 1 - Dung dịch casein 2% pha trong đệm
- Micropipette 1000 μL 1 phosphate pH7
- Micropipette 100 μL 1 - TCA 5%
- Ống nghiệm 10 - Thuốc thử Folin - Ciocalteu pha loãng
- Giấy lọc 2 5 lần - Dung dịch NaOH 0,5N
- Rây mịn - Dung dịch HCl 0,2N
- Thuốc thử Bradford

28
II. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH THỰC
TẾ:

2.1. Chuẩn bị:

- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp Bradford: Lấy từ bài 1
Hàm lượng albumin (µg) OD
0 0
10 0.101
20 0.216
30 0.303
40 0.467
50 0.554
∆ OD = 0.328
PT đường chuẩn: y = 0.0113x - 0.009

- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp Anson:

 Chuẩn bị 6 ống theo bảng sau:

Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Tyrosine chuẩn 1 µmol/mL (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
HCl 0.2 N (mL) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
NaOH 0.5 N (mL) 2 2 2 2 2 2
29
 Thuốc thử Folin (mL) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Lắc đều và ổn định 10 phút. Các ống được đo mật độ quang tại bước sóng
690 nm.

- Xây dựng phương trình đường chuẩn Anson theo kết quả đo được:
- Mẫu trắng: OD = 0.075
Tyrosine chuẩn 1 µmol/mL ΔOD
0 0
0.1 0.249
0.2 0.327
0.3 0.497
0.4 0.686
0.5 0.837
Phương trình đường chuẩn: y = 1.6189x – 0.028

2.2. Quy trình thí nghiệm

2.2.1. Quy trình thu nhận enzyme bromelain

Dứa

30
 Nước (tỷ lệ1:1) Xay nhuyễn

Ly tâm Bã

Amonium sulfate
hoặc ethanol 98% Kết tủa enzyme
v/v

Ly tâm
Dịch

Sấc ký rây phân tử

Ly tâm

Chế phẩm
bromelain

2.2.2.
Sơ Kếtcông
đồ quy trình tủa enzyme
nghệ sảnbromelain bằng muối
xuất dịch enzyme amonium sulfate:
bromelain

- Muối amonium sulfate được bổ sung từ từ vào dung dịch nước dứa sau ly tâm ở
4oC. Vừa cho vừa khuấy đều để dung dịch đạt nồng độ amonium sulfate 70% bão
hòa. Hỗn hợp được để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó đem ly tâm với
tốc độ 6000 vòng/ phút trong 5 phút. Thu nhận tủa và thẩm tích.

31
 2.2.3. KẾT TỦA ENZYME BROMELAIN BẰNG ETHANOL 98%:

_ Cho cồn 98% ( đã được làm lạnh -20 oC) vào dịch nước dứa sau ly tâm để thực
hiện kết tủa bromelain tại nồng độ ethanol 80%. Trộn đều hỗn hợp, để yên ở 4 oC
trong 30 phút. Đem ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 5 phút thu
tủa, phơi tủa bromelain trong tủ lạnh cho bay hơi hết ethanol.

2.2.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký rây phân tử:

_ Nguyên tắc: Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau
đi qua cột sắc ký thì những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ chui vào trong các hạt
của pha tĩnh. Các chất có phân tử lượng lớn thì trượt qua hạt và theo pha động
xuống trước. các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt ra theo mức độ phân tử
lượng của chúng. Những chất có phân tử lượng càng lớn ra càng nhanh và chất có
phân tử lượng nhỏ nhất ra cuối cùng.

Ngâm gel

Hoạt hoá gel

Nhồi cột

Chạy sắc ký

Xác định hàm lượng

protein và hoạt tính enzyme

2.2.5. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký rây phân tử:

32
_ Chuẩn bị 4 ống nghiệm sạch tiến hành như sau:

Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (1 mẫu)

Dung dịch mẫu (mL) 0.1 0

Nước cất (mL) 0.9 1.0

Thuốc thử Bradford (mL) 5.0 5.0

Lắc đều và để ổn định màu trong 15 phút. Đo OD ở bước sóng 595 nm.

Hình 2.2. Xác định protein trong mẫu bằng

Bradford
2.2.6. Xác định hoạt tính protease của bromelain bằng anson:

_ Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch tiến hành như sau:

Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu)

(mL)

Casein 2% 5 5

Dịch Enzyme ở 30℃ 1 0

33
 Lắc đều – để đúng 10 phút.

TCA 5% 5 5

Dịch Enzyme ở 30℃ 0 1

Lấy 1mL dịch lọc ở mỗi ống, thêm 2mL NaOH 0.5N + 0.6mL thuốc th

Folin (đã pha loãng). Lắc đều, để yên 10 phút rồi đo mật độ quang ở bước

sóng 690 nm.

2.3. Thuyết minh thực tế:

2.3.1. Thu nhận enzyme bromelain:

_ Xay nhuyễn: dứa sau khi cân đem đi xay nhuyễn bằng máy xay với lượng nước
bổ sung theo tỷ lệ 1:1 về khối lượng thu được hỗn hợp dứa.

Hình 2.3.1. Xay nhuyễn dứa

34
_ Lọc sơ bộ: hỗn hợp dứa sau khi xay được đem đi lọc thô để tách sơ bã dứa và lấy
phần dịch tạo sự thuận tiện cho quá trình ly tâm phía sau.
_ Ly tâm: Dịch dứa sau khi lọc sơ bộ được cho vào 2 falcon 50mL để tiến hành ly
tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để tách bỏ chất xơ. Sau khi ly tâm,
phần dịch được thu lại cho vào ống đong để xác định thể tích, phần bã còn lại
được bỏ đi.
_ Sau đó, dịch dứa sau khi ly tâm được chia làm 3 phần

 Phần 1: Hút 33.75 ml dịch enzyme => đem đi kết tủa bromelain ở
ethanol 80%
 Phần 2: Hút 50 ml dịch enyzme => Đem đi kết tủa bởi Amonium sunfate
ở 70% bão hòa
 Phần 3: Hút 10ml dịch enzyme, định mức lên 50 ml bằng bình định mức
=> Xác định hàm lượng protein theo Bradford và hoạt tính protease theo
phương pháp Anson

2.3.3. Kết tủa enzyme bromelain bằng muối amonium sulfate:

_ Muối amonium sulfate được bổ sung từ từ vào dung dịch dứa sau ly tâm ở 40C.
_ Lượng muối amonium sulfate bổ sung được tính theo phụ lục 1- Cách tính nồng
độ (NH4)2SO4 bổ sung. Vừa cho vừa khuấy đều để dung dịch đạt nồng độ
amonium sulfate 70% bão hòa. Dung dịch (NH4)2SO4 có nồng độ ban đầu là 0%,
dung dịch (NH4)2SO4 có nồng độ mong muốn là 70%. Theo bảng phụ lục 1,
lượng (NH4)2SO4 cần bổ sung là 472g tính trên 1 lít dung dịch. Do thể tích dịch
dứa thực hiện kết tủa chỉ bằng 50mL nên lượng muối cần bổ sung thực tế là
23.6g.

35
 Hình 2.3.3. Lượng muối amonium sunfate
bổ sung

_ Ly tâm: Hỗn hợp sau khi được để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đem ly
tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút.

Hình 2.3.3. Hỗn hợp dịch tủa

_ Bổ sung thêm một lượng nhỏ đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa 5.10-3M, Cystein
5.10-3M hòa tan với tủa vừa thu được sau đó cho vào túi cellophane. Quá trình
thẩm tích được thực hiện trong dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa 5.10-

36
 3M, Cystein 5.10-3M, thay đệm sau mỗi 2h cho đến khi kiểm tra hết muối trong
tủa enzyme.
_ Sau khi kết tủa, ta thu được V=2,5 ml. Đem đi pha loãng 20 lần với nước cất. Sau
đó đi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính
protease theo phương pháp Anson.

2.3.4. KẾT TỦA ENZYME BROMELAIN BẰNG ETHANOL 98%:

_ Để kết tủa enzyme bromelain tại nồng độ 80%. Với nồng độ đầu của ethanol là
98% => Cần dùng 150 ml dung dịch Ethanol 98% để kết tủa 33.75 ml dịch
enzyme bromelain.
_ Sau đó, trộn đều hỗn hợp, để yên ở 4C trong 30 phút. Đem ly tâm hỗn hợp với tốc
độ 6000 vòng/ phút trong 5 phút thu tủa, phơi tủa bromelain trong tủ lạnh cho bay
hơi hết ethanol.
_ Ta thu được 3 ống tủa : m ống = 38.94 g
m sau khi tủa = 39.78 g
 m tủa: 0.16 g
_ Ta lấy khối lượng 1 ống tủa là 0.053g tủa hòa tan với 5ml nước cất. Sau đó đi xác
định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính protease theo
phương pháp Anson.

III. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả kết tủa enzyme bromelain bằng muối amonium
sulfate:
3.1.1. Xác định hàm lượng protein của dịch enzyme bromelain
bằng phương pháp Bradford:
_ Tính toán kết quả:
• PT đường chuẩn: y = 0.0113x - 0.009
OD = 0,109
• Hàm lượng protein thực tế:
0,109+0,009 1 −3 mg
P1 = × × 10 ×5=0.522( )
0,0113 0 ,1 ml
Hàm lượng protein tổng:
Pt1= P1 × V1 = 0.522 × 83.75 = 43.7175 mg protein

37
 3.1.2. Xác định hoạt tính protease của dịch enzyme bromelain
bằng phương pháp anson:
_ Tính toán kết quả:
• Phương trình đường chuẩn Anson: y = 1,61189x + 0,028
• Hoạt tính dịch enzyme bromelain:
y – b 11
A1 = × ×K
a 10
0.25−0.028 11
= × ×5
1.6189 10
= 0.75 IU/mL
• Hoạt tính tổng dịch enzyme bromelain:
At1 = A1 x V1 = 0.75 x 83.75 = 62.8125 IU

3.1.3. Xác định hàm lượng protein của tủa bromelain kết tủa
bằng muối amonium sulfate bằng phương pháp Bradford:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:

Ống nghiệm OD
0 0.786
1 0.842
2 0.838
3 0.789
_ Suy ra:
∆ OD = ∆ ODmtn −¿ ∆ ODmt
= 0.823 – 0.786
= 0.037
_ Tính toán kết quả:
• Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.0113x - 0.009
• Hàm lượng protein thực tế:
0.037+0.009 1 −3
P2 = × ×10 × 20 = 0.814 mg protein/mL
0.0113 0.1

• Hàm lượng protein tổng:

Pt2 = = P2 × V2 = 0.814 × 29 = 23.606 mg protein

38
 3.1.4. Xác định hoạt tính protease của tủa bromelain kết tủa bằng
muối amonium sulfate bằng phương pháp Anson:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODmtn và mẫu trắng ODmt ở bước sóng
690 nm thu được kết quả:

Ống nghiệm OD
Trắng 1 0.276
Trắng 2 0.286
Trắng 3 0.261

Mẫu 1 0.392
Mẫu 2 0.386
Mẫu 3 0.444

_ Suy ra:
∆ OD = ∆ ODmtn −¿ ∆ ODmt
( 0.394−0.276 ) + ( 0.386−0.286 )+(0.444−0.261)
=
3
= 0.133
_ Tính toán kết quả:
• Phương trình đường chuẩn Anson: y = 1.6189x + 0.028.
• Hoạt tính dịch enzyme bromelain:
y−b 11
A2 = × ×K
a 10
0.133−0.028 11
= × × 20
1.6189 10
= 1.44 IU/mL
• Hoạt tính tổng dịch enzyme bromelain:
At2 = A2 x V2 = 1.44 × 29 = 41,77 IU
• Hiệu suất của tổng quá trình:
At 2 41.77
H= × 100 = ×100 = 66.5 %
At 1 62.8125

39
 • Độ tinh sạch:
A2 1.44
AP2 P2 0.814 1.77
ŋ= =
A1
=
0.75
= 1.43 =1.23 1.069
AP1
P1 0,522

3.1.5. Xác định hàm lượng protein của sắc ký bromelain kết tủa
bằng muối amonium sulfate bằng phương pháp Bradford:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:
Ống nghiệm OD ΔOD
0 1.069 0
3 1.112 0.043
4 1.086 0.017
9 1.140 0.071

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.0113x - 0.009
• Hàm lượng protein thực tế:
0.043+0.009 1 −3
P3 = × ×10 = 0.046 mg protein/mL
0.0113 0.1

0.017+0.009 1 −3
P4 = × ×10 = 0.023 mg protein/mL
0.0113 0.1
0.071+0.009 1 −3
P9 = × ×10 = 0.07 mg protein/mL
0.0113 0.1

( P3 × V 3 ) + ( P4 ×V 4 ) +(P9 × V 9 )
PSK =
V 3 +V 4 +V 9

( 0.046 ×2 ) + ( 0.023 × 2 )+(0.07 × 2)

= = 0.046 mg protein/mL
2+2+2

40
 3.1.6. Xác định hoạt tính protease của sắc ký bromelain kết tủa
bằng muối amonium sulfate bằng phương pháp Anson:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 690
nm thu được kết quả:

Ống nghiệm OD ΔOD

Trắng 1 0.112 0

Mẫu 1 0.258 0.146

Mẫu 2 0.312 0.2
Mẫu 3 0.322 0.21

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Anson: y = 1.6189x +¿ 0.028
• Hoạt tính dịch enzyme bromelain:
y−b 11
A= × ×K
a 10

0.146−0.028 11
A3 = × = 0.08 IU/mL
1.6189 10

0.2−0.028 11
A4 = × = 0.12 IU/mL
1.6189 10
0.21−0.028 11
A9 = × = 0.123 IU/mL
1.6189 10
A 3 × V 3 + A 4 ×V 4 + A9 ×V 9
ASK =
V 3+ V 4 +V 9

( 0.08 ×2 ) + ( 0.12 ×2 ) +(0.123 ×2)

= = 0.107 IU/Ml
2+ 2+2

• Hoạt tính tổng dịch enzyme bromelain:

AtSK = ASK × V = 0.107 × 348 = 37.236 IU

• Hiệu suất của tổng quá trình:

41
 A tSK 37.236
H= ×100 = × 100 = 59.28 %
At1 62.812

• Độ tinh sạch:
A SK 0.107
A PSK PSK 0.046
ŋ= = = = 1.61
AP1 A1 0.75
P1 0.522

3.2. Kết quả kết tủa enzyme bromelain bằng ethanol 98%:
3.2.1. Xác định hàm lượng protein của dịch enzyme bromelain
bằng phương pháp Bradford:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODmtn và mẫu trắng ODmt ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:

Lần đo Giá trị

1 1.182

2 1.129

3 1.126

Trắng 1.005

OD = 0,14

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.0113x - 0.009
• Hàm lượng protein thực tế:
0.14+0.009 1 −3 5
P2 = × × 10 × = 12.44 mg protein/mg
0.0113 0.1 0.053

42
 Pt2 = P2  m = 12.44  0.16 = 1.9904 mg
3.2.1. Xác định hoạt tính protease của tủa enzyme bromelain bằng
phương pháp anson:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODmtn và mẫu trắng ODmt ở bước sóng
690 nm thu được kết quả:

Mẫu trắng Mẫu thật

0.26 0.427
0.294 0.339
0.3 0.380
Trung bình cộng
0.285 0.382
∆OD= 0.097

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Anson: y = 1.6189x +¿ 0.028
• Hoạt tính dịch enzyme bromelain:
y−b 11
A2 = × ×K
a 10

0.097−0.028 11 5
= × ×
1.6189 10 0.053

= 4.42 IU/mL
• Hoạt tính tổng dịch enzyme bromelain:
At2 = A2 x m = 4.42 x 0.16 = 0.71 IU

3.2.3. Xác định hàm lượng protein của dịch bromelain kết tủa
bằng ethanol bằng phương pháp bradford:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 595
nm thu được kết quả:
_

Lần đo Giá trị

1 1.096

43
 2 1.009
3 0.970
Trắng 0.916
OD = 0.109

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.0113x - 0.009
• Hàm lượng protein thực tế:
0.109+0.009 1 −3
P1 = × ×10 ×5 = 0.522 mg protein/mL
0.0113 0.1

Pt1 = P1. V1 = 0.522 × 33.75 = 17.6175 mg

3.2.4. Xác định hoạt tính protease của dịch bromelain kết tủa
bằng ethanol bằng phương pháp anson:
_ Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm ODx và mẫu trắng OD0 ở bước sóng 690
nm thu được kết quả:

Mẫu trắng Mẫu thật

0.236 0.507
0.238 0.458
0.232 0.479
Trung bình cộng
0.235 0.481
∆OD=0,25

_ Tính toán kết quả:

• Phương trình đường chuẩn Anson: y = 1.6189x +¿ 0.028
• Hoạt tính dịch enzyme bromelain:
y−b 11 V
A1 = × ×
a 10 m
0.25−0.028 11
= × ×5
1.6189 10
= 0.75 IU/mL

44
 • Hoạt tính tổng dịch enzyme bromelain:
At1 = A1 x V = 0.75 × 33.75 = 25.3125 IU

• Hiệu suất của tổng quá trình:

At2 0.71
H= × 100 = × 100 = 94.67 %
At1 0.75
• Độ tinh sạch:
A2 4.42
AP2 P2 12.44 0.355
ŋ= = = = =0.247
AP1 A1 0.75 1.436
P1 0.522

IV. BIỆN LUẬN:

_ Trong quá trình tiến hành thí nghiệm có xảy ra nhiều sai sót:
Thao tác chưa chuẩn dẫn đến sai số trong quá trình hút dung dịch, dẫn đến
đường chuẩn không đạt yêu cầu. Các số OD không nằm trong vùng của
phương trình đường chuẩn.
_ Về thao tác thí nghiệm và các lưu ý:
 Khi ly tâm, cần cân đo chính xác lượng thể tích của 2 ống falcon chứa
dung dịch để đảm bảo sự cân bằng về khối lượng, vị trí đặt ống đối xứng
tránh gây hư hỏng máy và thiếu chính xác trong quá trình ly tâm.
 Khi tiến hành tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4, cần lưu ý thay đệm
thường xuyên.
 Khi chạy sắc ký, cần chú ý:
 Nhồi bông vào đáy cột, cho giấy lọc lên sao cho bằng phẳng với bông
gòn, khi đó cho gel vào sẽ thích hợp hơn.
 Canh chỉnh tốc độ chảy từ 3 – 4 giây/giọt, chú ý chảy càng chậm càng tốt
vì lượng enzyme thu được sẽ nhiều hơn.

45
 Điểm
Bài số 4: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME INVERTASE TỪ NẤM MEN

I. TỔNG QUAN:
1. Enzyme invertase
Invertase là một enzyme thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic của saccharose,
còn được gọi là β-fructofuranocidase (E.C.3.2.1.26). Invertase có nhiều ứng dụng
trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, bánh và dược phẩm. Invertase được dùng
nhiều nhất trong sản xuất syrup đường nghịch đảo - hỗn hợp fructose và glucose tỷ
lệ 1:1 từ sucrose. Invertase được sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae thường
hoạt động ở môi trường acid nhẹ đến trung tính (3.0-7.0), và trong khoảng nhiệt độ
khoảng 30C đến 75C.

46
 2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính invertase
Chuẩn bị đệm 0,1 M pH từ 1-12.
Chuẩn bị dung dịch enzyme (10 IU/mL) trong các đệm pH 1-12.
Xác định hoạt tính enzyme với cơ chất pha trong đệm tương ứng. Vẽ
đồ thị hoạt tính enzyme invertase biến thiên theo pH để xác định pH tối ưu
của invertase.
Dung dịch đệm đa năng Brittion và Robinson ( pH = 1,8 ÷ 12 )

II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH THỰC TẾ:

2.1. CHUẨN BỊ:
- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp Bradford: Lấy từ bài 1.
Hàm lượng albumin (µg) OD

0 0

10 0.101

20 0.216

30 0.303

40 0.467

50 0.554
47
 ∆ OD = 0.328

PT đường chuẩn: y = 0.0113x - 0.009

- Phương trình đường chuẩn theo phương pháp DNS:

 Chuẩn bị 6 ống theo bảng sau:
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ đường (µmol/mL) 0 2.5 5.0 7.5 10 0
Dung dịch đường chuẩn (mL) 0 0.25 0.5 0.75 1 0
Nước cất (mL) 1 0.75 0.5 0.25 0 1
DNS (mL) 1 1 1 1 1 1
Đậy nắp, đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh
dung dịch về nhiệt độ phòng.
Nước cất (mL) 10 10 10 10 10 10
Lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp

- Xây dựng phương trình đường chuẩn DNS theo kết quả đo được ở bước sóng λ = 540
nm

48
 Ống nghiệm ΔOD
1 0
2 0.23
3 0.483
4 0.748
5 0.864

2.2. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM:

2.2.1. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE
THEO DNS:
- Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch và khô, đánh số, tiến hành như sau:

Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (1 mẫu)
Dung dịch sucrose 0,3 M 1 1
Đệm acetate 0,1M pH 4,7 1,9 2

Dung dịch enzyme

0,1 0
invertase

Lắc đều - Để 10 phút ở 300C

49
 - Sau đó, hút 1 mL hỗn hợp phản ứng của từng mẫu thí nghiệm và mẫu trắng cho vào
lần lượt 6 ống nghiệm chứa sẵn 1mL DNS, đun cách thủy ở 100 0C trong 5 phút, sau đó làm
nguội nhanh dung dịch về nhiệt độ phòng.
- Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 10 mL nước cất, lắc đều đến khi dung dịch không còn
phân lớp. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.

50
 * Tiến hành lần lượt với các đệm acetate 0,1M với các pH lần lượt là:

pH = 2.09 pH =3.29 pH = 4.1

pH = 5.02 pH = 6.09 pH = 7

pH = 7.96 pH = 9.15 pH = 10.38

pH = 11.2 pH = 11.98

III. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN:

3.1. KẾT QUẢ:
3.1.1. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA DỊCH ENZYME INVERTASE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP DNS:

Phương trình đường chuẩn DNS: y=0,0898x+0,0158

 pH = 2.09

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 0.974
0.119
OD 0.872
ODtrung bình 0.923 0.119
OD 0.804

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
0.804−0.0158 3 1
A= × × ×2=5.266 IU /mL
0.0898 1 10

 pH =3.29

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 1.314
0.120
OD 1.211

51
 ODtrung bình 1.2625 0.120
OD 1.1425

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
1.1425−0.0158 3 1
A= × × × 2=7.528 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 4.1

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 1.483
0.088
OD 1.353
ODtrung bình 1.418 0.088
OD 1.33

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
1.33−0.0158 3 1
A= × × × 2=8.781 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 5.02

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 1.515
0.321
OD 1.612
ODtrung bình 1.5635 0.321
OD 1.2425

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10

52
 1.2425−0.0158 3 1
A= × × × 2=8.169 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 6.09

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 1.101
0.181
OD 1.008
ODtrung bình 1.0545 0.181
OD 0.8735

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
0.8735−0.0158 3 1
A= × × × 2=5.731 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 7

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 1.349
0.266
OD 1.227
ODtrung bình 1.288 0.266
OD 1.022

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
1.022−0.0158 3 1
A= × × ×2=6.723 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 7.96

Mẫu Thật Mẫu Trắng

53
 OD 1.084
0.09
OD 1.217
ODtrung bình 1.1505 0.09
OD 1.0605

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
1.0605−0.0158 3 1
A= × × × 2=6.980 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 9.15

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 3
0.08
OD 3
ODtrung bình 3 0.08
OD 2.92

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
2.92−0.0158 3 1
A= × × ×2=19.404 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 10.38

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 3
0.103
OD 3
ODtrung bình 3 0.103
OD 2.897

54
 ∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
2.897−0.0158 3 1
A= × × × 2=19.251 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 11.2

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 0.973
0.071
OD 0.717
ODtrung bình 0.8435 0.071
OD 0.7725

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
0.7725−0.0158 3 1
A= × × × 2=5.056 IU /mL
0.0898 1 10

 pH = 11.98

Mẫu Thật Mẫu Trắng

OD 0.110
0.069
OD 0.085
ODtrung bình 0.0975 0.069
OD 0.0285

∆ OD−b 3 1
A= × × ×F
a 1 10
0.0285−0.0158 3 1
A= × × × 2=0.085 IU /mL
0.0898 1 10

55
 III.2. Biện luận
Invertase có hoạt tính cao nhất tại pH 5,02 (so với các giá trị pH khảo sát).

Điểm
Bài số 5: XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG
HỌC CỦA INVERTASE

I. TỔNG QUAN:
1.1. ENZYME INVERTASE:
Invertase là một enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết glycoside có
trong saccharose để tạo thành D-glucose và D-fructose. Invertase hoạt động tối ưu
tại pH 4.7, 55℃.
Dưới tác dụng của enzyme saccarase (invertase) đường đôi saccharose bị cắt
thành 2 đường đơn như sau:

Hình 1.1

56
 Invertase có nguồn gốc từ thực vật, động vật và vi sinh vật, hiện nay được
sản xuất chủ yếu nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Enzyme saccarase (invertase) của nấm men S. Cerevisae có thể tồn tại ở 2
trạng thái: nội bào hay ngoại bào. Invertase nội bào khoảng 135,000 Da, trong khi
Invertase ngoại bào khoảng 270,000 Da.
Saccarase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân saccarose tạo thành glucose và
fructose. Vì vậy, chúng ta có thể dựa vào sự biến thiên lượng đường khử được tạo
thành để xác định hoạt tính của nó.

1.2. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENZYME:

Hình 1.2 Cơ chế

xúc tác của enzyme
 Trong đó:
E: enzyme
S: Cơ chất (Substrate)
P: Sản phẩm (Product)
ES: phức enzyme - cơ chất
1.3. THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC:

Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis
Km. Tốc độ của phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất
có trong môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng
vẫn tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.
Michaelis – Menten đã thiết lập phương trình biểu diễn sự phụ thuộc vận tốc
phản ứng ban đầu vào nồng độ cơ chất như sau:

57
  Trong đó:
v: vận tốc phản ứng.
Vmax: vận tốc cực đại của phản ứng.
[S]: nồng độ cơ chất.
Km: hằng số Michaelis – Menten.
Từ phương trình Michaelis - Menten, Lineweaver - Burk xácđịnh 2 thông số Vmax và
Km dựa vào biểu diễn sự phụ thuộc giữa 1/v và 1/[S]:

Đường biểu diễn cắt trục tung ở điểm 1/Vmax và cắt trục hoành ở điểm -1/Km từ đó
có thể tính được các giá trị Vmax và Km:

Hình 1.3 Đồ thị xác định Km và Vmax theo Lineweaver – Burk

II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH THỰC TẾ:

2.3. CHUẨN BỊ:

58
 Dung dịch đường chuẩn: dung dịch chứa 0,09 g glucose và 0,09 g fructose tỷ lệ là
1:1 nồng độ 10 µmol/mL (pha cho cả lớp).
Lập đường chuẩn DNS (mỗi nhóm tự chuẩn bị một phương trình đường chuẩn):
Lấy 5 ống nghiệm có nắp, bổ sung hóa chất lần lượt như sau:
Ống 1 2 3 4 5
nghiệm
Nồng độ 0 2.5 5.0 7.5 10
đường
(µmol/mL
)
Dung dịch 0 0.25 0.5 0.75 1
đường
chuẩn
(mL)
Nước cất 1 0.75 0.5 0.25 0
(mL)
DNS (mL) 1 1 1 1 1
Đậy nắp, đun cách thủy ở 100℃ trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch
về nhiệt độ phòng.
Nước cất 10 10 10 10 10
(mL)
Lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp.
* Đo độ hấp thu ở bước sóng = 540 nm. Tính OD từ đó vẽ đồ thị OD theo nồng độ đường
chuẩn.
2.4. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
Nồng độ đường 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125
(µmol/mL)

59
 Dung dịch đường 3 3 0 0 0
saccarose 0.2 M trong
đệm acetat pH 4.7
(mL)
Dung dịch từ ống 0 0 3 mL từ ống 3 mL từ ống 3 mL từ ống
nghiệm trước (mL) nghiệm 2 nghiệm 3 nghiệm 4
Dung dịch đệm acetat 0 3 3 3 3
pH 4.7 (mL)
Dung dịch hút bỏ 0 0 0 0 3
(mL)
Cho vào tất cả các ống 3 mL dung dịch E có nồng độ pha loãng thích hợp.
DNS (mL) 1 1 1 1 1
Đậy nắp, đun cách thủy ở 100℃ trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch về nhiệt
độ phòng.
Nước cất (mL) 10 10 10 10 10
Lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp.
* Lưu ý: Cứ sau 5, 10, 15, 30 phút lấy nhanh từ mỗi ống 1ml cho vào ống nghiệm đã
đánh số tương ứng và có chứa sẵn 1 ml thuốc thử DNS.
Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Tính: ∆OD = OD mẫu – ODtrắng. Dựa vào phương
trình đường chuẩn để xác định lượng đường khừ tạo thành.
Vẽ đồ thị biểu diễn sản phẩm hình thành theo thời gian tương ứng với mỗi
nồng độ saccarose trong đó trục tung là số 𝜇mol sản phẩm được tạo thành và trục
hoành là thời gian thủy phân (phút).
Xác định vận tốc ban đầu của phản ứng: Dựng đường tiếp tuyến với đường
biểu diễn sản phẩm theo thời gian tại thời điểm 0 ứng với các nồng độ cơ chất ban
đầu khác nhau. Vận tốc ban đầu của phản ứng (𝜇mol sản phẩm/phút) được tính
bằng tangα0 (α0 là góc được tạo thành bởi đường tiếp tuyến và trục hoành).

60
 Từ vận tốc ban đầu V0 tính được đối với mỗi nồng độ cơ chất, tính các giá trị
1/[S] và 1/V0 tương ứng. Vẽ đường biểu diễn theo Lineweaver - Burk và xác định
các giá trị Km, Vmax

2.5. THUYẾT MINH THỰC TẾ:

- Phương trình đường chuẩn DNS:

III. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN:

3.2. KẾT QUẢ:
y−b −3 mg
Ta có : X = x 180 x 10 ( )
a ml
- Đồ thị theo nồng độ saccharose:
 [S] = 0.5 g/L
t(phút) 0 5 10 15 20
Nồng độ đường (µmol/mL) ΔOD
OD 0 0,102 0,119 0,125 0,131
X 0 0 0,173 0,207 0
0,219 0,231
Phương trình: P(t) = 5E-05x3 2.5
- 0,0029x2 + 0,0452x + 0,00280.23
⟶ vo = 0,0452 (mg (G-F)/phút)
5 0.483

7.5 0.748

10 0.864

61
  [S] = 1 g/L
t(phút) 0 5 10 15 20
OD 0 0,217 0,252 0,264 0,271
X 0 0,403 0,473 0,497 0,511
Phương trình: P(t) = 0,0001x3 - 0,0068x2 + 0,1052x + 0,0069
⟶ vo = 0,1052 (mg (G-F)/phút)

62
  [S] = 2 g/L
t(phút) 0 5 10 15 20
OD 0 0,455 0,463 0,482 0,496
X 0 0,880 0,896 0,934 0,962
Phương trình: P(t) = 0,0003x3 - 0,016x2 + 0,2262x + 0,0238
⟶ vo = 0,2262 (mg (G-F)/phút)

 [S] = 4 g/L
t(phút) 0 5 10 15 20
OD 0 0,806 0,881 0,936 0,972
X 0 1,584 1,734 1,845 1,917
Phương trình: P(t) = 0,0003x3 - 0,016x2 + 0,2262x + 0,0238
⟶ vo = 0,2262 (mg (G-F)/phút)

63
 - Tính toán:
V0
[S] ( mg (G- 1 1 2
(x) V 0 (y) x.y x
(g/L) F)/phút S

) x tb=0,9375
0,5 0,0452 2 22,12 44,24 4 y tb=10,1165
1 0,1052 1 9,506 9,506 1
2 0,2262 0,5 4,42 2,21 0,25
4 0,2262 0,25 4,42 1,105 0,0625
∑ x =3 ,75 ∑ y=40,466 ∑ xy =57,061 ∑ x 2=5,3125
n × ∑ xy−∑ x × ∑ y
 a= 2 = 10,64
n× ∑ x 2−( ∑ x)

 b = y tb - a× x tb = 0,139
 y= 10,64x + 0,139

64
 1
 Vmax = b = 7,19 (mg G-F/phút).

 Km = a× Vmax = 76,5 (g/l).

65