3.

CÁC LOẠI PHA TĨNH ĐỂ NHỒI CỘT SẮC KÝ

HPLC

- Có nhiều loại pha tĩnh để nhồi cột HPLC, đa dạng.

- Tất cả các kỹ thuật sắc ký đều có cột HPLC: cột pha thường (normal phase column),
cột pha tạo nối (bonded phase), cột pha đảo (reverse phase), cột trao đổi ion (ion
exchange column), cột sắc ký gel (size exclusion column)...

- Phần lớn các nguyên liệu là silica, là những hạt có kích thước nhỏ, có diện tích bề
mặt lớn (200-300 m’lg) và chịu đựng được áp suất tương đối cao.

- Các loại nguyên liệu khác có thể là alumin, zirconium, nguyên liệu trao đổi ion...

Bảng 2: Các loại cột HPLC dùng trong các kỹ thuật sắc ký khác nhau

Loại cột Tính chất của hợp chất có thể phân tích
Cột pha thường, pha Có trọng lượng phân tử nhỏ (< 2.000). Không có mang điện
đảo, pha tạo nối tích. Có thể có tính phân cực hoặc không. Có thể hòa tan trong
dung môi hữu cơ hoặc nước.
Cột trao đổi ion Có trọng lượng phân tử nhỏ (< 2.000). Phân tử có mang điện
tích. Loại hợp chất hòa tan trong nước.
Cột sắc ký gel Có trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn. Không có mang điện
tích. Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước

3.1. Pha thường (Normal phase)

- HPLC pha thường, còn được xem là kỹ thuật sắc ký hấp thu, là phương pháp sử
dụng một pha động không phân cực, kết hợp với một pha tĩnh phân cực.

- Cơ chế tách chất dựa vào việc phân bố của các phân tử chất tan giữa dung dịch và sự
hấp thu lên trên bề mặt của pha tĩnh.
* Kỹ thuật sắc ký rắn-lỏng

- Nguyên liệu dùng cho kỹ thuật sắc ký rắn-lỏng này là silica gel, alumin và graphit..
trong đó silica được sử dụng nhiều nhất, vì nó có lớp bề mặt mang nhiều nhóm silanol
rất hoạt tính.

- Cơ chế hấp thu là sự tương tác giữa nhóm silanol của silica gel với các nhóm chức
phân cực của phân tử chất tan (nhóm alcol, amin, ceton, acid carboxylic).

- Sắc ký hấp thu tách tốt các hợp chất có tính không phân cực hoặc phân cực vừa phải,
giải ly nhờ sử dụng loại dung môi khá phân cực.

- Kỹ thuật này không phù hợp lắm với loại dung môi rất phân cực.

- Các hợp chất có mang nhóm chức phân cực sẽ tương tác với nhóm hoạt động bề mặt
silanol của silica gel.

- Các hợp chất càng có tính phân cực càng hấp thu mạnh, vì thế sắc ký rắn-lỏng phù
hợp để tách hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có tính phân cực khác nhau.

- Kỹ thuật này không phù hợp với các loại hợp chất tan kém trong dung môi, như hợp
chất thơm đa nhân, dầu béo hoặc các hợp chất trong một dãy đồng đẳng.

*Kỹ thuật sắc ký lỏng lỏng

- Sắc ký lỏng lỏng bao gồm một pha động lỏng và một pha tĩnh lỏng; pha tỉnh này
gồm một chất lỏng được cho bao phủ lên trên một giá mang (support) nhờ vào một lực
vật lý, đó là sự hấp thu.
- Để tránh việc dung môi bị trôi tuột khỏi giá mang, dung môi giải ly phải được bão
hòa với các thành phần của pha tĩnh.
- Pha động và pha tính cần phải có độ phân cực khác hẳn nhau và hỗn hòa vào nhau,
- Sắc ký lỏng lỏng có thể phân loại thành sắc ký lỏng lỏng pha thường và sắc ký lỏng
lỏng pha đảo.
+ Loại sắc ký lỏng lỏng pha thường rất bền nhờ sự tạo nối mạnh mẽ giữa pha tĩnh và
giá mang, gồm những cặp không hỗn hoà vào nhau.
+ Với hệ thống pha đảo dung môi giải ly phải bão hòa với pha tĩnh squalan, dung môi
mới không trôi tuột ra khỏi giá mang.
- Ưu điểm: có thể tái sử dụng lại pha tĩnh; có nhiều loại chất lỏng tương thích để làm
pha tĩnh, cho kết quả tách chất hiệu quả hơn....

- Nhược điểm: của sắc ký lỏng-lỏng là dung môi giải ly phải Bảo hòa với pha tĩnh
nên không thể áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần, phải
duy trì pha tĩnh ở nhiệt độ không được thay đổi quá nhiều, chỉ khoảng ± 0,5°C.

3.2. Pha tạo nối (bonded phase)

- Pha tĩnh tạo nối bằng hoá học (chemically bonded stationary phase) đã được phát
triển, dựa vào các hạt silica đường kính 3, 5 và 10 pm.

- Giá mang silica có nhiều lỗ rỗng, có hạt hình cầu hoặc có hình dạng bề ngoài không
đều.

Ưu điểm:

 Các loại phân tử phân cực, không phân cực, loại ion, loại có khả năng ion hóa...
đều có thể tách chỉ bởi một cột sắc ký và với pha động phù hợp.
 Có thể chế tạo nhiều loại pha tĩnh với độ phân cực khác nhau.
 Có thể lựa chọn nhiều loại dung mỗi giải ly.
 Dung môi giải ly chủ lực là nước kết hợp với những dung môi hữu cơ như
metanol, acetonitril là những loại dung môi luôn dễ kiếm, có giá cả phù hợp
 Có thể áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần mà
không làm hư hại pha tĩnh (lớp dung môi bọc bên ngoài trôi tuột khỏi giá
mang).
 Hệ thống đạt sự cân bằng nhanh và không để lại các hệ quả xấu.

Nhược điểm: dung môi chỉ nên ở khoảng pH 2,0–8,5, vượt quá khoảng này, pha tĩnh
bị đứt nối hoặc bị thủy giải. Không thể sử dụng các dung môi có tính oxid hoá.
Điều chế pha tạo nối bằng cách biến đổi các nhóm silanol bề mặt thành các nhóm dẫn
xuất. Có các loại pha tạo nối như sau:

 Các nhóm alkyl như octadecyl (CigH37), ngoài ra còn một số nhóm khác với
dây carbon ngắn hơn như C,, C2, Cg và aryl.
 Các nhóm phân cực như amino, cyanopropyl, eter, diol.
 Các nhóm trao đổi ion như acid sulfonic, amino, ammonium tứ cấp.

3.2.1. Nguyên liệu tổng hợp pha tạo nối

Bảng 3 trình bày một số loại pha tĩnh có bán trên thị trường với tên thương mại, mạch
carbon dài ngắn khác nhau.

Bảng 3: Một số loại pha tĩnh có bán trên thị trường.

Kích Thể tích Diện tích Lượng Pha tĩnh che

thước lỗ bề mặt carbon phũ
Tên thương Pha tĩnh Che phủ
lỗ (Å) (ml/g) (m2/g) (%) (µmol/m2)
mại đầu
Hypersil SAS C1 120 0,7 170 3,0 5,29 Không
Spherisorb C1 80 0,5 220 4,0 1,08 Một phần
Ultremex C1 80 0,8 200 3,0 4,5 Không
Ultremex C2 80 0,8 200 3,0 4,5 Có
Hypersil C4 300 0,6 50 2,0 4,8 Có
Nucleosil C4 120 0,65 200 - - Có
Nucleosil 300 C4 300 0,8 100 1,0 1,41 Có
Nucleosil 500 C4 500 0,8 35 1,0 4,04 Có
Nucleosil C4 1.000 0,85 25 1,0 5,66 Có
1000
Nucleosil C4 4.000 0,7 10 < 1,0 - Có
4000
Spherisorb C6 80 0,5 220 6,0 2,51 Có
Ultremex C6 80 0,8 200 13,0 3,29 Có
Hypersil C8 300 0,6 50 3,0 5,24 Có
Hypersil Mos C8 120 0,7 170 7,0 3,85 Không
1
Nucleosil 100 C8 100 1,0 350 9,0 2,49 Không
Nucleosil 500 C8 500 0,8 35 1,0 2,42 Không
Hypersil C18 120 0,7 170 10,0 2,84 Có
Nucleosil C18 1.000 0,85 25 1,0 1,69 Có
1000
Kromasil C18 100 0,9 340 19,0 3,1 Có
Nucleosil 100 Phenyl 100 1,0 350 8,0 1,96 Không
Spherisorb Phenyl 80 0,5 220 3,0 1,08 Một phần
Selectosil Phenyl 110 1,1 330 8,0 2,08 Không
Spherisorb CN 80 0,5 220 3,5 2,37 Không
Hypersil CPS2 CN 120 0,7 170 4,0 3,55 Có
Iltremex CN 80 0,8 200 2,5 1,83 Không
Zorbax CN 70 - 330 5,0 2,41 Có
Spherisorb NH2 80 0,5 220 2,0 1,58 Không
Selectosil NH2 110 1,1 330 3,3 1,8 Không
Nucleosil 100 Diol 100 1,0 350 0 - Không
Spherex Diol 100 0.8 180 2,0 1,37 Không
Hypersil SAX Anion 120 0,7 170 2,7 1,56 Có
Selectosil Anion 110 1,1 330 1 meq/g - Không
Selectosil Cation 110 1,1 330 1 meq/g - Không
Spherisorb Cation 80 0,5 220 6,0 - Không
Ultremex Cation 80 0,8 200 0,4 2,88 Không
meq/g
Hình 4 trình bày sơ đồ các loại phản ứng để điều chế các loại pha tĩnh tạo nối khác
nhau. Các pha tĩnh tạo nối thương mại có 40-60% các nhóm silanol được biến đổi
thành các dẫn xuất. Các pha tĩnh này chịu được áp suất dòng chảy của pha động ở
6.000 psi (41,4 MPa) trong khoảng pH 2,0–8,5.

- Các loại pha tĩnh tạo nối, giai đoạn thông dụng nhất là sử dụng clorur tionyl để
biến nhóm silanol thành clorosilan.
- Tiếp đó, có thể gắn các nhóm chức hữu cơ vào silica bằng các dẫn xuất
Grignard hoặc organolitium, hoặc cho nhóm clorosilan tác dụng với amin để
tạo nên alkylaminosilan
- Nguyên liệu của pha tạo nối được sử dụng nhiều nhất là những nguyên liệu
được tạo thành bằng cách cho nhóm silanol bề mặt tác dụng với
organoclorosilan giúp nối pha tĩnh vào chất mang, ngang qua nổi siloxan (Si-
 O-Si

3.2.2. Cơ chế bắt giữ chất của pha tạo nối

- Cơ chế bắt giữ chất của pha tạo nối rất phức tạp.

- Có thể hiểu nó có tính chất tương tự như sự phân bố trong hệ thống pha lỏng-lỏng và
cũng có thể hiểu là có một sự tranh dành giữa dung môi giải ly và các phân tử chất tan
để chiếm lấy một “vị trí” trên pha tĩnh.

- Các nhóm silanol còn sót lại trên bề mặt của hạt silica có thể gây hiệu ứng hấp thu,
khiến cho có hiện tượng tín hiệu mũi trên sắc ký đồ kéo đuôi, tạo vệt dài.

- Vì lý do này, nên sử dụng loại pha tĩnh có hàm lượng pha tĩnh che phủ cao, hoặc loại
có nhóm silanol tự do đã được che phủ đầu.

- Lượng carbon che phủ không có ý nghĩa nhiều bằng phần trăm bề mặt silica được
che phủ vì nó ảnh hưởng đến khả năng giữ chất, tính chất hoá học, độ bền về pH của
pha tĩnh.

- Về việc lựa chọn dây alkyl dài hoặc ngắn: có một nguyên tắc tổng quát là các hợp
chất tan có tính phân cực được tách tốt hơn nhờ vào pha tĩnh có dây alkyl ngắn và chất
tan có tính kém phân cực được tách tốt hơn nhờ vào pha tĩnh có dây alkyl dài.

- Pha tĩnh nitril thường để tách các porphyrin.

-Các pha tĩnh aminoalkyl thường được sử dụng để tách các loại đường và peptid, tuy
nhiên không nên sử dụng pha này để tách các hợp chất carbonyl vì các hợp chất này sẽ
tạo thành base Schiff với pha tĩnh.

3.2.3. Pha tĩnh thủ tỉnh

- Hoạt tính sinh học của các hợp chất thủ tính tùy thuộc vào hóa lập thể, nhiều cặp đối
phân cho thấy chúng có hoạt tính trái ngược nhau, thí dụ đồng phân D-penicillamin có
hoạt tính chữa bệnh trong khi đối phân L-của nó lại độc, vì vậy cần phải tách riêng
chúng ra.

- Nguyên tắc hoạt động của pha tĩnh thủ tính: hai đối phân sẽ biến thành (với
tính chất tạm thời, trong một khoảng thời gian ngắn ngủi, thoáng qua) hai
xuyên lập thể phân đối với pha tĩnh, tạo nên phức chất kém bền. Phức chất nào
kém bền sẽ bị giải ly ra khỏi cột nhanh hơn so với phức chất kia.

Pha tĩnh Pirkle

- Để pha tĩnh Pirkle nhận diện được một hợp chất thủ tính, chất đó phải có ít nhất ba
vị trí tương tác với pha tĩnh, trong đó phải có một vị trí phụ thuộc vào hóa lập thể.

- Ở các vị trí, sự tương tác có thể xảy ra nhờ vào các yếu tố sau: sự cho và nhận điện
tử π giữa những mảnh nhân thơm (π-donor, π- acceptor aromatic fragments); sự tạo
nối hydrogen liên phân tử và sự hút lưỡng cực.
Khi có ba điểm tương tác xảy ra, sẽ tạo nên một phức xuyên lập thể phân giữa pha
tĩnh và chất thủ tính.

- Phức chất này được thành lập một cách thoáng qua, tạm thời và thuận nghịch.

-Mỗi đối phân sẽ tạo một phức với pha tĩnh với mức năng lượng khác nhau.

-Đối phân nào tạo phức bền hơn với pha tĩnh sẽ bị pha tĩnh giữ lại trong cột mạnh hơn,
vì thế sẽ ra khỏi cột chậm so với đối phân kia.

- Pha tĩnh Pirkle có nhiều vị trí có thể gây nên những loại tương tác như trình
bày trên, nên pha tĩnh này được sử dụng để tách nhiều loại cặp đối phân như:
alcol, hợp chất thơm có mang nhóm diol, diacylglycerol, những thuốc chữa
bệnh có cấu trúc là các hợp chất dị hoàn...

Pha tạo nối cyclodextrin

- Cyclodextrin là carbohydrat có vòng, có tính thủ tính được cấu tạo bởi sáu, bảy
hoặc tám đơn vị glucopyranose và được gọi tên lần lượt là: α-, β- và γ-
cyclodextrin. Chỉ có β-cyclodextrin là được chọn làm pha tĩnh thủ tính trong
sắc ký.
 - Khi cyclodextrin được sử dụng để làm pha tĩnh thủ tính, cơ chế lưu giữ chất
chủ yếu là sự tạo phức chất.
- Cần phải thực nghiệm trong điều kiện pha đảo và chất tan cần có một nhóm thế
là nhân thơm, để bảo đảm có sự tương tác hoá lập thể giữa chất tan với oxygen
glycosic, nếu không, chất tan sẽ hiện diện ở những vị trí lộn xộn bên trong ống
và hệ thống mất tính chọn lọc đối phân.
- Ngoài ra, có thể có trường hợp chất tan phải có nhóm chức để có thể ở vào vị
trí tạo nối hydrogen với các nhóm hydroxyl ở mặt trên của cyclodextrin.

3.2.4. Các loại pha tĩnh khác

- HPLC có tất cả các loại pha tĩnh giống như trong sắc ký cột cổ điển.

- Có pha tĩnh trao đổi ion với các nhóm chức hoạt động cũng như cho sắc ký gel (Size
exclusion chromatography, SEC).

- Pha tĩnh tạo nên bởi divinylbenzen được tạo mạng ngang bởi styren cho thấy ưu
điểm vượt trội.
- Các hạt gel có kích thước với đường kính khoảng 50-10 6Å, và có khả năng tách chất
có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 10 đến 5x108 Dalton.
Hình 8 và 9 hướng dẫn việc lựa chọn loại cột HPLC khi muốn phân tích các hợp chất
tan trong dung môi hữu cơ hoặc tan trong nước.

3.2.5. Sắc ký điều chế (preparative liquid chromatography)

- Với các loại cột HPLC trình bày trên là loại cột phân tích, tuy nhiên, khi cần thiết
cũng có thể sử dụng để cô lập một lượng mẫu chất đủ để phân tích NMR.

- Thực hiện bằng cách mỗi lần chích vào máy một lượng mẫu < 5 mg, dùng cột
loại phân tích, đường kính bên trong 4,6 mm; lặp lại vài ba lần sẽ thu được đủ
lượng mẫu.
- Ngoài ra cũng có loại cột điều chế: cột dài 300 mm, đường kính bên trong 50
mm, có thể tách đến 1 g mẫu.