Odpowiedź odpornościowa organizmu:

 Zestawienie elementów układu immunologicznego:

Wrodzony układ odpornościowy Adaptacyjny układ odpornościowy
Odpowiedź nieswoista (wrodzona) Swoista odpowiedź na patogeny i antygeny

Ekspozycja prowadzi do natychmiastowej Brak natychmiastowej odpowiedzi na

odpowiedzi ekspozycję

Elementy odporności komórkowej i humoralnej Elementy odporności komórkowej i humoralnej

Brak pamięci immunologicznej Ekspozycja prowadzi do powstania pamięci

immunologicznej
Występuje u prawie wszystkich organizmów
żywych Po raz pierwszy pojawiła się u żuchwowców

Przeciwciała - rodzaj białka wydzielanego przez komórki plazmatyczne (czyli pobudzone limfocyty B) w
przebiegu odpowiedzi odpornościowej typu humoralnego. Charakteryzuje się ono zdolnością do swoistego
wiązania antygenów

Przeciwciała – budowa:
 Są to białkowe cząsteczki o kształcie zbliżonym do litery „Y”, o masach cząsteczkowych od 150 do
970 kDa, złożone z
czterech glikozylowanych łaocuchów peptydowych:
•ciężkich związanych ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi
•lekkich związanych z łaocuchami ciężkimi również za pomocą mostków dwusiarczkowych.
Rejon, w którym występują wiązania dwusiarczkowe pomiędzy H , nazywamy rejonem zawiasowym
 fragmentów Fab, odpowiadających jego ramionom i wiążących się z antygenem fragmentu Fc, pełniącego funkcję efektorową, czyli
odpowiadającego za różne zjawiska zapoczątkowywane związaniem antygenu, na
przykład immunofagocytozę.
 Każdy łaocuch posiada częśd stałą która jest taka sama u wszystkich przeciwciał danej klasy, oraz częśd zmienną różniącą się wśród przeciwciał
o różnej swoistości.
w skład fragmentu Fc wchodzi wyłącznie częśd stała H, zaś w skład fragmentu Fab fragment części stałej i częśd zmienna łaocucha ciężkiego
oraz kompletne łaocuchy lekkie.

Przeciwciała – klasyfikacja:
 Przeciwciała można sklasyfikować ze względu na budowę łańcuchów lekkich oraz ciężkich, przy czym różnice dotyczą wyłącznie części stałych

Antygeny:

MAKROCZĄSTECZKA, OBCA W STOSUNKU DO ORGANIZMU, DO KTÓREGO WNIKA, ROZPOZNAWANA PRZEZ KOMÓRKI

IMMUNOLOGICZNIE KOMPETENTNE, INDUKUJĄCA PRODUKCJĘ SWOISTYCH PRZECIWCIAŁ I KOMÓREK EFEKTOROWYCH

pełnowartościowy antygen charakteryzuje się 2 cechami:

* immunogennością (zdolnością wzbudzania swoistej odpowiedzi immunologicznej) i antygenowością (zdolnością przereagowania ze swoistymi
przeciwciałami i komórkami efektorowymi

IMMUNOGENNOŚĆ antygenu zależy od:

 natury chemicznej antygenu

 wielkości cząsteczki
 struktury cząsteczki
 obcości wobec organizmu, do którego wnika (autoantygeny, antygeny syngeniczne, antygeny allogeniczne, antygeny ksenogeniczne
 resorpcyjności antygenu
kondycji organizmu
Antygeny: - naturalne - sztuczne - syntetyczne

SWOISTOŚD ANTYGENOWA - ZDOLNOŚD REAGOWANIA Z WYTWORZONYMI PRZECIWCIAŁEM LUB Z KOMÓRKĄ EFEKTOROWĄ

DETERMINANTA ANTYGENOWA (= EPITOP) CZĘŚD ANTYGENU, KTÓRA ODPOWIADA ZA IMMUNOGENNOŚD I SWOISTOŚD

ANTYGENU

WYRÓŻNIAMY DETERMINANTY:

 IMMUNODOMINUJĄCE

 PRZYTŁUMIONE

 SEKWENCYJNE

 KONFORMACYJNE

Hapteny to proste związki chemiczne, które stają się immunogenne dopiero po związaniu z białkiem, polisacharydem lub inną makrocząsteczką. W
immunologii podstawowej są one cennym narzędziem do badania determinantów antygenowych i epitopów (znalazły szerokie zastosowanie w różnych
testach immunologicznych).

Surowice odpornościowe:

 Surowica vs. Plazma

 Surowica krwi (łac. serum) – częśd osocza krwi pozbawiona fibrynogenu. Składa
się z wody (90%), białek (7%) oraz soli mineralnych i innych związków
organicznych i nieorganicznych (3%). W surowicy krwi znajdują się też
przeciwciała, w tym między innymi te skierowane przeciw antygenom grup krwi
(anty-A oraz anty-B).

 Plazma– zasadniczy płynny składnik krwi, w którym są zawieszone elementy

morfotyczne (komórkowe). Stanowi ok. 55% objętości krwi. Uzyskuje się je przez
wirowanie krwi zabezpieczonej przed krzepnięciem. Gdy dojdzie do krzepnięcia
osocza, wydziela się skrzep, a pozostały płyn to surowica*1+.

 Nazwę plazma wprowadził czeski fizjolog Jan Evangelista Purkyně; pochodzi ona od późnołacioskiego słowa plasma, a ono od starogreckiego
πλάσμα plasma „kształt, odlew, obraz”.

 Surowica i osocze wydają się nie różnid się na powierzchni, ale główną różnicą jest to, że surowica nie zawiera fibrynogenu i jest otrzymywana
po krzepnięciu krwi.

Surowice odpornościowe – otrzymywanie

Do pobierania próbek krwi należy używad zestawów próżniowych jednorazowego użytku (zestawy aspiracyjnopróżniowe, vacutainer). Używanie
zestawów próżniowych zapewnia właściwą jakośd próbek oraz zmniejsza ryzyko kontaktu osób pobierających, transportujących oraz wykonujących
analizy z materiałem potencjalnie zakaźnym.

Surowica - materiał z wyboru do oznaczeo biochemicznych i prawie wszystkich hormonów

jest pobierana do probówek bez antykoagulanta

1. po pobraniu krwi pozostawid na 30 – 60 min.

2. następnie przez 10 min wirowad przy 3000 obr/min.

3. usunąd skrzep

4. ponownie wirowad przez 10 min przy 3000

Adiuwanty:
  są to związki lub ich mieszaniny, które podane łącznie z Ag znacznie nasilają ich immunogennośd.
Najczęściej stosowane są następujące adiuwanty:
o kompletny adiuwant Freunda – (KAF- zawiera oleje mineralne, emulgator, prątki gruźlicy)
o niekompletny adiuwant Freunda - (NAF- zawiera oleje mineralne, emulgator)
o ałun potasowy wytrącony w roztworze antygenu
o żel poliakrylamidowy
o bentonit (średnica 0.3-0.5m) opłaszczony antygenem przez adsorpcję
o fragmenty polistyrenu
o filtry nitrocelulozowe opłaszczone antygenem
o inne

Zbiór postępowań, których przestrzeganie redukuje wpływ badań na zwierzęta:

1. Reduction:
Ograniczenie liczby zwierząt używanych w eksperymentach poprzez:
 doskonalenie technik eksperymentalnych
 doskonalenie metod analizy wyników
 dzielenie się informacjami z innymi zespołami badawczymi
2. Refinement:
Uściślenie zakresu eksperymentu i udoskonalenie opieki nad zwierzętami w celu ograniczenia ich cierpienia poprzez:
 stosowanie mniej inwazyjnych technik
 zapewnienie lepszej opieki medycznej
 Stworzenie lepszych warunków życia
3. Replacement:
Zastąpienie eksperymentów na zwierzętach metodami alternatywnymi takimi jak:
 zastosowanie kultur komórkowych
 użycie modeli komputerowych
 rekrutacja ochotników spośród ludzi (jeśli to możliwe)
 wykorzystanie badao epidemiologicznych

surowice odpornościowe – zastosowanie w praktyce i nauce:

ANTYGEN (Ag) - makrocząsteczka, obca w stosunku do organizmu, do którego wnika, rozpoznawana jest przez komórki immunologicznie kompetentne,
indukuje produkcję swoistych przeciwciał i proliferację komórek efektorowych.

Cechy antygenu

Pełnowartościowy antygen charakteryzuje się 2 cechami:

 immunogennością (zdolnością wzbudzania swoistej odpowiedzi immunologicznej)

 antygenowością (zdolnością przereagowania ze swoistymi przeciwciałami i komórkami efektorowymi)

Pełnowartościowy antygen nazwać można inaczej immunogenem. Wśród antygenów można wyróżnić tzw. hapteny czyli antygeny cechujące się tylko
antygenowością.

DETERMINANTA ANTYGENOWA – (inaczej epitop) część antygenu, która odpowiada za immunogenność i swoistość antygenu

SWOISTOŚĆ ANTYGENOWA - zdolność reagowania z wytworzonymi przeciwciałem lub z komórką efektorową

Przeciwciało

Przeciwciało (antibody, Ab, inaczej immunoglobulina)

Białka należące do glikoprotein, produkowane w odpowiedzi humoralnej przez limfocyty B na antygeny obce lub zmienione antygeny własne (które
nabyły cechy obcości).
Przeciwciała reagują w sposób swoisty z antygenami, które indukowały ich rozwój.

 Przeciwciała naturalne - występują naturalnie (fizjologicznie) w surowicach osób zdrowych. Obecność tych przeciwciał nie jest wynikiem
wcześniejszej stymulacji antygenowej
 Przeciwciała odpornościowe - powstają po stymulacji obcym antygenem. Zdolne do swoistej reakcji serologicznej z wywołującym ich
powstawanie antygenem
KLASY PRZECIWCIAŁ

1.Immunoglobuliny A (IgA) – posiadają ciężki łańcuch w formie α (alfa)

2.Immunoglobuliny D (IgD) – posiadają ciężki łańcuch w formie δ (delta)

3.Immunoglobuliny E (IgE) – posiadają ciężki łańcuch w formie ε (epsilon)

4.Immunoglobuliny G (IgG) – posiadają ciężki łańcuch w formie γ (gamma)

5.Immunoglobuliny M (IgM) – posiadają ciężki łańcuch w formie μ (mi)

Izotypy – rozróżnia się je na podstawie zasadniczych różnic w planie budowy łańcuchów. Podział na izotypy polega na podziale na klasy i podklasy oraz
typy i podtypy

Allotypy – są to drobne zmiany w obrębie danego izotypu, warunkowane zmiennością genetyczną. Przeważnie chodzi o zmienność konkretnych
aminokwasów w określonej pozycji łańcucha

Idiotypy – to grupy przeciwciał o takiej samej swoistości. Różnią się one budową części zmiennej mimo posiadania tej samej części stałej (mogą to być te
same izotypy)

Fragment przeciwciała, który wiąże antygen (paratop) tworzy przestrzenną strukturę, do której dopasowuje się antygen

Fragment antygenu, który wiąże fragment przeciwciała nazywa się epitopem lub determinantą antygenową.

Reakcja antygen – przeciwciało:

Za wiązanie Ag-Ab odpowiadają różne typy oddziaływań:

* siły elektrostatyczne

* wiązania wodorowe

* wiązania hydrofobowe

* siły Van der Waalsa

Swoistość przeciwciała jest uwarunkowana przestrzennym ułożeniem części zmiennych Fab. W danej grupie przeciwciał mogą wystąpić różnice w sile
wiązania determinanty antygenowej, czyli powinowactwie. Im bardziej dopasowane są miejsce wiążące antygen oraz epitop tym większa siła wiązania.

Awidność zależy od powinowactwa i określa siłę wiązania antygenu posiadającego różne determinanty antygenowe przez przeciwciała.

AGLUTYNACJA - reakcja serologiczna pomiędzy antygenami występującymi na powierzchni komórek (drobnoustrojów, roślin, zwierząt) a swoistymi
przeciwciałami obecnymi w środowisku reakcji.

aglutynacja bezpośrednia = czynna  (biorą w niej udział antygeny będące częścią składową komórki )

aglutynacja pośrednia = bierna  (antygeny rozpuszczalne zaadsorbowane na cząstce stałej (np. lateks lub erytrocyt owczy)

Precypitacja

to reakcja między cząsteczką przeciwciała swoistego, a antygenem rozpuszczalnym (o masie cząsteczkowej od 40- do 160000 D), zachodząca w
środowisku płynnym. Reakcja ta zachodzi dwu-fazowo. W pierwszej fazie antygen reaguje z przeciwciałem i powstają kompleksy immunologiczne,
które w drugiej fazie reakcji, w strefie równowagi ich stężeń, wypadają w roztworze pod wpływem elektrolitów, w postaci precypitatów widocznych
gołym okiem.
Na przebieg reakcji precypitacji wpływają :

 – stosunki ilościowe antygenu i przeciwciała

 – stężenie elektrolitów w środowisku reakcji
 – pH środowiska
 – temperatura

Precypitacja probówkowa: W strefie równowagi obu reagentów (strefa ekwiwalencji) dochodzi do wytrącania się precypitatu

Precypitacja w żelu - Immunodyfuzja

 Jest reakcją precypitacji, ale zachodzącą w środowisku żelowym.

 Oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczek antygenu i przeciwciała w żelu.

 W środowisku żelowym precypitat powstaje w miejscu zetknięcia się dwóch reagentów, będących w optymalnym stosunku ilościowym, czyli w
strefie ekwiwalencji i powstaje w postaci linii, łuku lub pierścienia precypitacyjnego.

Najczęściej jako środowisko reakcji stosuje się 1-2% żel agarowy lub agarozowy, pozwalające na swobodną dyfuzję reagentów.

Szybkość dyfuzji w żelu jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczek a wprost proporcjonalna do stężenia reagentów.

Na przebieg reakcji wpływają :

 – stosunki ilościowe antygenu i przeciwciała

 – stężenie elektrolitów w środowisku reakcji

 – pH środowiska – temperatura

Klasyfikacja metod immunodyfuzji zależy od tego, czy w żelu dyfunduje jeden, czy obydwa reagenty.

 W związku z tym wyróżnia się odczyny immunodyfuzji:

 - pojedynczej, w której dyfunduje jeden reagent (antygen) do żelu, a drugi (przeciwciało) obecny jest w żelu w równomiernym stężeniu
 - podwójnej, w której obydwa reagenty dyfundują w żelu

Reakcję immunodyfuzji można wykonać w probówkach, na płytkach, na szkiełkach

Surowice odpornościowe

Surowica o dużej zawartości swoistych przeciwciał otrzymana w wyniku naturalnego lub sztucznego uodpornienia określonym antygenem (wirusy,
bakterie, toksyny, komórki, fragmenty tkanek antygeny rozpuszczalne, takie jak białka, polisacharydy itp.).

Surowice odpornościowe mogą być :

 poliwalentne (zawierają przeciwciała o różnych swoistościach, czyli skierowane są przeciwko różnym antygenom),

 monowalentne ( zawierają przeciwciała skierowane przeciwko jednemu antygenowi)

Przeciwciała monoklonalne

 Skierowane są przeciwko jednej determinancie antygenowej i pod każdym względem są identyczne.

 Przeciwciała monoklonalne mają przewagę nad surowicami poliwalentnymi i monowalentnymi, ponieważ te drugie, mimo iż dają możliwość
wykrywania szerokiego zakresu determinant antygenowych, to nie mogą być używane w precyzyjnych badaniach immunologicznych czy
immunochemicznych.

Przeciwciała monoklonalne – znaczenie w nauce:

 1/ precyzyjne badania wykonywane w celu poznawania nowych struktur na komórkach (np. użyte w metodzie barwienia komórek do określania
ich fenotypu), do badania udziału i rozmieszczenia różnych antygenów np. glikolipidowych, glikoproteinowych, będących regulatorami
proliferacji komórek, mediatorami oddziaływań miedzy komórkami w tkance

2/ śledzenie i poznawanie mechanizmów komórkowych i procesów immunologicznych, ich zaburzeń np. w transformacji nowotworów

3/ badanie różnych substancji wydzielanych przez komórki (np. cytokiny, będące czynnikami wzrostowymi komórek, hormony -regulujące
procesy fizjologiczne) i wykrywanie nieprawidłowości w ich produkcji

4/ analizowanie determinant antygenowych, śledzenie zmian antygenowych, zachodzących w różnych drobnoustrojach

5/ badanie struktury przeciwciał i ich reakcji z antygenami

Przeciwciała monoklonalne – znaczenie w diagnostyce:

 bardzo szybkie wykrywanie i określanie przynależności gatunkowej, szczepowej antygenów różnych drobnoustrojów w tkance i płynach ustroju
lub w produktach żywnościowych itd.

 stosowanie do neutralizowania różnych toksyn, blokowania różnych rozpuszczalnych lub strukturalnych antygenów bakteryjnych, wirusowych i
pasożytniczych

 typowanie antygenów drobnoustrojów

 typowanie antygenów zgodności tkankowej

 określanie grup krwi

 precyzyjne rozpoznanie niedoborów immunologicznych

 diagnozowanie chorób nowotworowych

 stosowane ich jako środek immunosupresyjny w reakcji transplantacyjnej, w procesach autoimmunizacyjnych itd.

Miano antygenu - najmniejsze stężenie antygenu, przy którym jest jeszcze widoczny precypitat

IMMUNODYFUZJA POJEDYNCZA

REAKCJA Ag-Ab, w której dyfunduje jeden reagent (antygen) do żelu, a drugi (przeciwciało) obecny jest w żelu w równomiernym stężeniu

- odczyn Manciniego – reakcja na płytce Petriego / szalce

Reakcje precypitacji oraz immunodyfuzji znalazły zastosowanie do:

 oznaczeń ilościowych, czyli oceny poziomu przeciwciał w surowicy odpornościowej przez określenie miana precypitacyjnego tzn. takiego
najmniejszego stężenia antygenu, przy którym jeszcze powstaje pierścień precypitacyjny

 do oznaczeń jakościowych, czyli wykrywania antygenu przy użyciu wzorcowych przeciwciał lub wykrywania przeciwciał precypitujących w
surowicach badanych przy użyciu wzorcowego antygenu

 ocenyidentycznościlubzłożonościantygenów

ELEKTROFOREZA
Jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym
ładunkiem elektrycznym przemieszczają się.

Prędkośd przemieszczania się naładowanej elektrycznie makrocząsteczki zależy od: jej ładunku,

1. rozmiaru,

2. kształtu

3. oraz oporów ruchu środowiska.

Głównym obszarem zastosowao elektroforezy są:

1. biochemia białek i kwasów nukleinowych,

2. biologia molekularna,

3. farmakologia,

4. medycyna sądowa,

5. weterynaria,

6. diagnostyka medyczna

ELEKTROFOREZA - Przyłożenie pola elektrycznego do wodnego roztworu elektrolitu zawierającego makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym
ładunkiem elektrycznym (makrojony) zawsze powoduje ruch jonów, zarówno elektrolitu, jak i makrojonów, w kierunku elektrod o przeciwnym znaku
ładunku elektrycznego.

 Siła jonowa (μ) - jest funkcją stężenia jonów wchodzących w skład elektrolitu (buforu).

 Jej wartośd (μ) definiuje się jako połowę sumy iloczynów stężeo molowych (c) i kwadratu wartościowości (Z) wszystkich jonów znajdujących
się w roztworze:

 zbyt wysokie stężenie jonów powoduje ograniczenie ich ruchliwości

 zbyt niskie stężenie jonów prowadzi do niedoboru nośników ładunku elektrycznego i wzrostu oporności elektrycznej

 pH - miara stężenia jonów wodorowych w elektrolicie (istotne znaczenie w odniesieniu do białek i peptydów)

 Białka i peptydy posiadają własności amfoteryczne (obdarzone są wypadkowym ładunkiem elektrycznym dodatnim lub ujemnym w
zależności od warunków środowiskowych (pH).

 W punkcie izoelektrycznym (pI) wypadkowy ładunek elektryczny cząsteczki białka równy jest zeru (zależy od pH).

o Każde białko charakteryzuje się jemu właściwym punktem izoelektrycznym (pI)

o Zawsze w środowisku o pH < pI białko obdarzone jest ładunkiem dodatnim i migruje w kierunku elektrody ujemnej.
  chemicznie: nadsiarczan amonu (inicjacja polimeryzacji) i TEMED (katalizator)

 fotochemiczne: ryboflawina i długofalowe światło UV (inicjacja polimeryzacji) i TEMED (katalizator)

ELEKTROFOREZA

Rodzaje elektroforezy ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego:

 elektroforeza pionowa (ang.verticalelectrophoresis): Wtechnicetejnośnikelektroforetyczny wypełnia szklane rurki (elektroforeza rurkowa) lub
znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi (ang. spacer) (elektroforeza płytowa).

Rodzaje elektroforezy ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego:

 elektroforeza pozioma (ang. horizontal electrophoresis): jest rodzajem elektroforezy w którym nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie
poziomej.

Elektroforeza strefowa - podstawowy i najszerzej stosowany rodzaj elektroforezy. Odbywa się w nośniku, w którym elektrolit ma w całej objętości stałą
wartośd pH. - Różnica dystansów migracji poszczególnych makrojonów, w ciągu określonego czasu, w bezpośredni sposób wynika z różnicy w
ruchliwości elektroforetycznej (ładunku i masy) tych jonów w nośniku w obecności pola elektrycznego.

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF) - odbywa się w nośniku, w którym wartośd pH buforu zmienia się w sposób ciągły od wartości najwyższej przy
katodzie do najniższej przy anodzie (zastosowanie specjalnych nośników pH zwanych amfolinami).

 Amfoteryczne substancje (białka, peptydy) migrują w polu elektrycznym w kierunku elektrod o znaku przeciwnym ich ładunkowi.
 Napotykając po drodze zmieniające się wartości pH elektrolitu zatrzymują się w miejscu, w którym pH=pI.
 Uzyskuje się w ten sposób separację molekuł białkowych zgodnie z ich wartościami pI.

Odmiany elektroforezy strefowej:

1. Elektroforeza natywna

 Rodzaj elektroforezy prowadzony zwykle w poliakrylamidzie w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane. Rozdział
białek w elektroforezie natywnej zależy od:

o wielkości hydrodynamicznej (konformacja przestrzenna białka) (większa ruchliwośd białek o konformacji bardziej upakowanej,
mniejsza ruchliwośd oligomerów)

o ładunku, jakim obdarzona jest cząsteczka białka

o Zalety: możliwośd odzyskania cząsteczek białkowych w stanie pełnej aktywności biologicznej.

o Wady: słaba rozdzielczośd metody.

ELEKTROFOREZA

Barwienie – stosowane barwniki:

 Białka (po uprzednim utrwaleniu żelu)

 Błękit kumassi (ang. Coomassie Brilant Blue) – pozwala wykryd 1 μg białka/prążek

 Czero amidowa – pozwala wykryd 1 μg białka/prążek

 Barwienie srebrem – pozwala wykryd 10 ng białka/prążek

 Oligonukleotydy – znaczniki fluorescencyjne, np. bromek etydyny

IMMUNOELEKTROFOREZA

 jest definiowana jako separacja i identyfikacja białek na podstawie różnic w ładunku elektrycznym i reaktywności z przeciwciałami. Metoda
łączy w sobie dwie techniki: elektroforezę w żelu i podwójną immunodyfuzję.

 Metoda ta łączy elektroforezę z reakcją antygen-przeciwciało (wytrącanie się precypitatu w postaci łuku precypitacyjnego); technika
różnicowania białek na podstawie ich właściwości elektroforetycznych i immunologicznych

 Opiera się na zjawisku precypitacji wielocząsteczkowych kompleksów antygen-przeciwciało i pozwala na detekcję obecności antygenu oraz
określenie ilości tego antygenu w próbce

o Medium rozdzielające jest zwykle żelem agarozowym.

o Żel ma naprzemiennie wycięte dołki i nacięcia.

o Próbkę umieszcza się w dołkach i przeprowadza elektroforezę w celu rozdzielenia białek.

o Do szczelin dodaje się przeciwciało (lub mieszaninę przeciwciał).

o Przeciwciało i antygen migrują do siebie i tworzą łuki precypitynowe w obszarze optymalnego stężenia.

Etapy immunoelektroforezy:

1. Rozdział białek w polu elektrycznym (elektroforeza)

2. Immunodyfuzja rozdzielonych elektroforetycznie antygenów i odpowiednich przeciwciał

Technikę tę stosuje się m.in. do:

1. Oceny frakcji białkowych w płynach ustrojowych

2. Rozpoznawania niedoborów immunologicznych

3. Diagnostyce gammapatii

4. Metoda łączy w sobie dwie techniki: elektroforezę w żelu (etap I) i podwójną immunodyfuzję (etap II). Stosowana do badania materiału
zawierającego mieszaninę białek.

Immunoelektroforeza prosta wg Scheideggera

Metoda łączy w sobie dwie techniki: elektroforezę w żelu (etap I) i podwójną immunodyfuzję (etap II). Stosowana do badania materiału zawierającego
mieszaninę białek

Przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą byd wyrażone przez:

 obecnośd lub brak linii precypitacyjnej

  szerokośd, kształt, położenie łuku, ostrośd linii

 intensywnośd barwy precypitatu

 zmiany w ruchliwości elektroforetycznej linii precypitacyjnej

 pojawianie się łuków dodatkowych

Zastosowanie immunoelektroforezy prostej:

 wykrywanie zaburzeo w biosyntezie białek

 wykrywanie dysproteinemii

 potwierdzenie paraproteinemii

 identyfikacja białka monoklonalnego

PRECYPITACJA ANTYGENU

 Reakcja między rozpuszczalnym antygenem i rozpuszczalnym przeciwciałem, polegająca na tworzeniu swoistego, nierozpuszczalnego
kompleksu antygen-przeciwciało, którego koocowym efektem jest powstający precypitat (zmętnienie).
 Wypadanie precypitatu z roztworu następuje jedynie w strefie równowagi (ekwiwalencji)

Inne rodzaje immunoelektroforezy

Immunoelektroforeza rakietkowa wg Laurella

 Jest to metoda ilościowa pozwalająca na bezpośrednie oznaczenie stężenia antygenu białkowego w badanym materiale biologicznym

 Prowadzona jest w nośniku elektroforetycznym wysyconym badanym przeciwciałem w warunkach pH=pI przeciwciała.

 W kierunku od katody do anody elektroforetycznie migruje próbka zawierająca antygen.

 W miejscu kontaktu antygen-przeciwciało dochodzi do precypitacji wielkocząsteczkowych kompleksów.

 W wyniku tego powstają charakterystyczne linie o kształcie startującej rakiety.

  Technika pozwala określid ilośd antygenu przez porównanie powierzchni zawartej pod krzywą. Antygen przemieszcza się w żelu zawierającym
unieruchomione przeciwciała – stężenie antygenu określa się na podstawie wysokości szczytów precypitacyjnych powstałych wtedy, gdy
antygen zostanie w całości związany przez przeciwciała.

 Immunoelektroforeza prosta wg Scheideggera

TEST ELISA – testy fazy stałej

Test immunoenzymatyczny wykorzystujący przeciwciała (Ab; ang. antibody) znakowane enzymami, które są swoiste wobec danego antygenu (Ag; ang.
antigen); zachodzi swoista reakcja immunologiczna Ab-Ag;

 Metoda mikro-płytkowa umożliwiająca ilościowe wykrywanie peptydów, białek, przeciwciał i hormonów;

 Antygen (bezpośrednio lub pośrednio) MUSI BYĆ unieruchomiony na powierzchni stałej (np. na 96- dołkowej mikropłytce polistyrenowej o
wysokim powinowactwie);
 Aktywność enzymów sprzężonych z przeciwciałami wykrawana jest dzięki zastosowaniu odpowiednich dla tych enzymów substratów, które s
enzymatycznie przekształcane w barwne produkty (pomiar absorbancji barwnych produktów).
 W testach ELISA wykorzystuje się przeciwciała poliklonalne lub/i monoklonalne

ANTYGEN

 Typy antygenów:
 • kompletne (białka i wielocukry o m.cz. > 5 kDa)
• niekompletne (zw. małocząsteczkowe, np. hapteny)

Przeciwciała poliklonalne, które są specyficzne dla różnych epitopów tego samego antygenu, zatem są heterogenn (niejednorodne), mogą wykazywać
wiązanie nieswoiste i mogą różnić się powinowactwem do antygenu.

Przeciwciała monoklonalne, które są jednorodne i wiążą takie same epitopy na antygenie, posiadają dużą swoistość oraz nie wykazują różnic w
powinowactwie do epitopu.

 Enzymy wykorzystywane w testach ELISA sprzęgane są z przeciwciałami (poliklonalnymi lub monoklonalnymi) wiązaniem:
Biotyna/awidyna lub biotyna/steptawidyna
 Przeciwciała sprzężone z enzymem nazywamy koniugatem przeciwciał

Enzymy katalizują przekztałcenie substratu w barwny produkt (w obecności chromogenu):

PEROKSYDAZA CHRZANOWA (HRP; horseradish peroxidase)

 enzym izolowany z korzenia chrzanu;

 z uwagi na dużą aktywność i niezawodne metody wykrywania jego aktywności jest najczęściej
 wykorzystywany do znakowania przeciwciał;
 wykrywanie aktywności: enzym ten w obecności H2O2 utlenia substraty do barwnych produktów, np.:

Chromogeny dla HRP:

 OPD (orto-fenylodiamina) → produkt o barwie żółto-pomarańczowej ;

  DAB (3,3’-diaminobenzydyna) → produkt o barwie brązowej (nierozpuszczalny polimer);
 TMB (3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna) → produkt o barwie niebieskiej (rodnik TMB), który po zastopowaniu reakcji (0.5 M H2 SO4 , 0.5 M
HCl, 1 M H3PO4 ) przechodzi w diiminę o barwie żółtej;
ABTS (kwas sulfonowy 2,2-azino-di(3-etyl-benzo-tiazoliny) → produkt o barwie zielono-niebieskiej.

FOSFATAZA ALKALICZNA (AP, alkaline phosphatase)

 otrzymywana z jelit cielęcych;

 stosowana głównie do znakowania Ab monoklonalnych;
 Substrat dla AP: pNPP (p-nitrofenylofosforan sodowy) → produkt o barwie żółtej (p-nitrofenol)

ACETYLOCHOLINOESTERAZA (AChE)

 enzym izolowany ze strętwy (ryba)

 Substrat dla AChE:
 Reagent Ellmana (acetylocholina z kwasem 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoesowym)) → produkt o barwie żółtej (kwas 5-tio-nitrobenzoesowy)

β-D-GALAKTOZYDAZA

OKSYDAZA GLUKOZOWA

Ogólne etapy testu ELISA:

2. Płytkę opłaszcza się badanym antygenem oraz antygenem wzorcowym (krzywa kalibracyjna) i inkubuje z nim;
3. Następnie z płytki odpłukuje się nadmiar niezwiązanego antygenu (PBS z detergentem);
4. Miejsca na płytce, do których nie związał się antygen blokujemy roztworem blokującym, aby ograniczyć stopień niespecyficznego wiązania się
przeciwciał (PBS z albuminą lub odtłuszczonym mleku w proszku);
5. Ponownie płuczemy płytkę;
Dodajemy do dołków przeciwciała sprzężone z enzymem (koniugat) i inkubujemy;
6. Ponownie płuczemy płytkę;
7. Dodajemy substrat dla enzymu (wywołanie reakcji barwnej);
8. Pomiar absorbancji na czytniku mikropłytek.

Blokowanie najczęściej przeprowadza się z użyciem:

•1-5% roztworu surowiczej albuminy wołowej (BSA) w PBS (pH 7) • 0.1-0.5% odtłuszczone mleko w proszku w PBS (pH 7)
• 1-5% roztworu kazeiny lub kazeinianu w PBS (pH 7)

PŁUKANIE:

 Przeprowadza je się w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych reagentów. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu bufor o fizjologicznym pH
(np. PBS), co zapobiega denaturacji białek, jak i sprzyja zachowaniu aktywności skoniugowanych z przeciwciałami enzymów.
 dzięki czemu możliwe jest usunięcie niespecyficznie związanych z płytką związków. Po każdej inkubacji płytkę

rodzaje (warianty) testu Elisa:

 test ELISA bezpośredni

 pośredni
 kanapkowy – najczulszy i najbardziej specyficzny spośród testów ELISA
 kompetecyjny (konkurencyjny)