_—__________ MIcnonioL0G1A DE ALIMENTOS :cTA PREPARACIGN DE MEDIOS DE CULTIVO AQOBJETIVO Describir los procedimlentos para la prep: 2.0 ALCANCE 10 aplica para Ia preparacién de medios de cultivo para el andiisis yaracién de medios de cultlvo. Este métod nierobiolégico de producto terminado, producto en proceso, agua tratada y no tratada. 3.0 PRINCIPIO DEL METODO Un medio constituido de compuestos quimicos cor caldo simple y otros medios que nocidos es llamado medio quimicamente definido o sintético. Agar nutriente, otros tejidos no son quimicamente definidos. contienen peptona y extractos de carne u stancias, incluyendo Estos extractos son constituidos de una variedad compleja de sub: aminoécidos, vitaminas y carbohidratos. Mecios quimicamente definidos para el crecimiento de algunas bacterias. Los medios de cultive se denominan habituaimente como no selectivos, selectivos, diferenciales o selectivos — diferenciales. Los medios no selectivos son nutritivamente muy ricos y se emplean coménmente para enumerar la microbiota total o transferir y mantener los microorganismos en cultivos puros. Un medio selective permite el ;arés (microorganismos seleccionados) € crecimiento de ciertos microorganismos de impide la multiplicacién de microorganismos competidores. Los agentes selectivos (r+ ejemplo el cristal violeta que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas) son estos medios. Los medios diferenciales se utilizan ‘componentes esenciales de alimento. entre subpoblaciones presentes en un ocasionalmente para_distingui baséndose en una Gnica propiedad bioquimica. .s un método eficaz para la seleccién y diferenciacion de los microbiota comple} Un medio que contenga tanto agente selectivo como diferenciales e: microorganismos que se buscan de entre los presentes en una Los medios de cultivo pueden ser liquidos (caldos) 0 sdlidos (agar) dependiendo del propésito del experimento. Escaneado con CamScannerMICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS CTA AQINTURELRENCIAS ‘Se debe utilinar agua doatilnda estéril, y asequrat S.OSLGURIDAD Todas tox ahimnos deben cumplr con fos estind Facuttod de Clencias Cuvinvicas vorveia do claro residual dle sequetdad, politiens de la GQ.MEDIOAMBILNIL ‘Todos los desechos generados deben llevar rotulado antes de disponertos. ‘LOLQUIPAMIENTO 7.1 Balanza Anaiitica con precisién a 0.01 mg o equivalente. 130 al autoclave en reciplentes correctamente 7.2 Plancha calefactora 7.3 Autoclave 7.4 Estufa ‘7.5 Refrigerador 7.6 Erlenmeyer 7.7 Probetas 7.8 Varilla de vidrio 7.9 Espatula ‘8.0 REACTIVOS 8.1 Agua Destilada estéril 8.2 Glicerina liquida Escaneado con CamScannerSS SOVC CSS Ss SHSVVVswPTsVuvvuuere ~~ -- _—___—_MICROMIOLOGIA DE AUMENTOS cra ‘0,0 PROCEDIMIENTO. 10.1 Pese la cantidad necesarla del medio de cultivo de acuerdo con el protocolo que esté utilizando segiin el proveedor, 10.2 Use agua destilada o destontzada, 10.3 i el medio contiene agar, agite continuamente y callente el medio hasta ebullicién, El agar funde (se percibe porque el medio se aclara) en solucién acuosa en ebullicion, Todo medio que requiera esterilizacién debe colocarse en envase termorresistente. Nunca llene un envase més de las tres cuartas partes de su capacidad, ya que el liquido se expandird durante el calentamiento, Enrosque las tapas parcialmente para permitir ‘que escape la presién del vapor. En general la tapa debe estar hacia la mitad de la rosca completa o algo mas para la sujecion, : 10.4 Aquellos medios que no se lleva a esterilizacién, se debe preparar utiizando materiales y agua estrictamente esterlizados, bajo campana y con el mechero encendido, 105 La esterilizacién se logra manteniendo el material o el medio de cultivo en el autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 10.6 Deje enfriar el medio hasta 45°C, luego destape la boca del frasco que contiene el medio de cultivo y pase por la lama del mechero Bunsen 10.7 Levante la tapa de la placa de Petri en uno de los lados, lo minimo posible. Vierta 15 — 20 ml del medio estéril en placa estéril y deje homogeneizar el medio con movimientos circulares de la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj. 10.8 Deje solidificar el medio, invierta las placas y guardelas en refrigerador (0 -5* °C) OBSERVACION 4 En caso de trabajar con tubos, cargar las soluciones en tubos, tapar y esterlizar en autoclave (si requlere). sk Las placas se invierten para evitar condensados sobre la superficie del agar, reduciendo la posibilidad de contaminacién, “& El medio agar no deberé guardarse por un periodo superior a 15 (quince) Escaneado con CamScannerct GIA DI 5 + dias a fin de evitar la deshidratacién de la superficie Algunos medios no pasan por esta etapa 1. Agar Baird Parker Medio de alta especificidad diagnéstica y selectividad para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos, Fi lent Este medio contiene cloruro de litio y telurito de potasio para inhibir el desarrollo de la flora microbiana acompafiante, mientras que el piruvato de sodio y la glicina estimulan selectivamente el crecimiento de estafilococos. El agregado de yema de huevo permite visualizar colonias convexas de color negro rodeado de una zona transparente debido a la lipdlisis y protedlisis. Las_mismas quedan confirmadas por la prueba de coagulasa. Escaneado con CamScannerMICROIOLOGIA DE ALIMENTOS CTA a 7 Microorganism: Crecim! ‘Apariencia | E. coli Ninguno: Ninguno P mirabilis Bueno Marron 'S. dureos Bueno a excelente Negras, con borde blanco, rodeado de una zona clara S. epidermidis Escaso a bueno Negra, tamafio irregular. Zona opaca alrededor dela colonia sin zona clara alrededor E. faecium Escaso Igual al anterior ‘Micrococcus Escaso Colonias marrones a negro. 2-Agar EMB = utillzado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de répido desarrollo y lo de todas las especies de la escasas exigencias nutricionales. Permite el desarroll familia Enterobacteriaceae. Fundame paces de utilizar Ia lactosa y/o s9car0sa, Y aquellos La diferenciacién entre ‘organismos Cal or los indicadores eosina y azul de metileno .n incapaces de hacerlo, esta dada ps que sor n efecto inhibitorio sobre muchas bat éstos ejercen ul cterias Gram positivas. y Gitrobacter spp. Presentan un caracteristico brillo ‘oseen centro oscuro con periferi Este medio permite el Muchas cepas de Escherichia coli cepas que utilizan la lactosa a azulada metalico. La fe las que no lo hacen son inc \coloras. ‘o rosada, mientras qu mo colonias rosadas y puntiformes; la siembra en srococcus SPP. miento de Candida spp. Co! ‘mite el desarrollo de clamidosporas en €. albicans. Enter -omo colonias puntiformes creci profundidad per Crece en este medio mientras y__ transparentes, 8 Escaneado con CamScanner(ODIOLOGIA DE ALIMENTOS -CIA Joriea de elle Rul Fanalabacler sppey otras bacterlas oxidativas pueden dar colon lavanda. ‘nterpretacién de resultados Microorganismo Taracteristia dela colonia Enterobacter, Klebsiella spp. Color rosa mucosa ro azulado Escherichia coli Verde con brillo metalico Y centro negi Proteus, Salmonella, Shigella | Incoloras formes Candida spp. incoloras< rosadas, secas, puntifor Acinetobacter spp. “azul lavanda, pequerias a mediana : BAgar PCA Recuento en placa agar. Medio recomendado para el recuento de colonias en aguas, aguas residuales, productos acteos y otros alimentos Fundamento La productividad de este medio esté basada en el alto contenido nutricional de sus componentes que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. 4-Agar Cetrimida. Medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del género. Fundamento La formula de este medio esta desarrollada para favorecer la seleccién de P. aeruginosa y in de pigmentos. Escaneado con CamScanner__—_____MIcROpIOLOGIA DE ALIMENTOS -CTA Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera resultado postive ta observacién de fluoresceina, que es un plgmento de color amarillo, amarlio verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extlende por todo el medio de cultivo debido a fenémenos de difusién. 5Agar Sabouraud Glucosado Este medio puede ser usado para el aislamiento, identificacién y conservacién de hongos patégenos y saprofitos. Puede ser usado en placas 0 en tubos con clerre hermético, Fundamento Medio de cultivo recomendado para el cultivo y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cuténeas (piel, pelo). No tienen agentes selectivos los que pueden ser agregados al medio de cultivo. El bajo pH favorece el crecimiento de hongos sobre bacterias. ;almonella Shigella Es un medio selectivo para el alslamiento de Shigella y Salmonella de heces, alimentos y otros materiales, Es formulado para diferenciar fermentadores de la lactosa de los que no la fermentan, con inhibicién de organismos coliformes sin restringir el crecimiento de bacilos Gram negativos Shigella, Salmonella. Los pocos organismos que fermentan la lactosa que desarrollan se diferencian facilmente. Fundamento La selectividad de este medio se basa en la elevada concentracién de tiosulfato, citrato, sales billares y el verde brillante, que inhibe las bacterias coliformes. Este medio de lactosa que son capaces de diferencia los pocos microorganismos fermentadores cidifican el medio desarrollar, de los no fermentadores de lactosa. Los primeros a‘ haciendo virar al rojo el indicado shigella y otros microorg yr de pH. Las colonias son rosadas © rojas sobre un anismos no fermentadores de lactosa, fondo rojizo. Salmonella, ulfhidrico a partir de dan colonias transparente. Los microorganismos formadores de st 10 Escaneado con CamScannerCO Toa Tae MucnoMIOLOG| a Alosulfato dan colonias con centro reat In solectividad, se recomlenda \ncubar previamente la muestra en caldo selenite clstina. {Interpretacién de Resultados Microorganismo Colonias Salmonella spp. (SH2-), Shigella Incoloras, transparentes Salmonella spp. (SH2 4), Proteus. ‘SPP. ‘Transparente, centro negro Escherichia colt Rosadas 0 rojas Enterobacter, Klebsiella spp. Rosada cremosas 0 mucosa Enterococcus spp, Incoloras, muy escaso crecimiento. ‘LAgua Peptonada Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos U otros: materiales de interés sanitario, \damento Recomendado para ser utilizado en lugar de solucién fisiolégica para recuperar células de enterobacterias dafiadas por proceso fisicoquimicos a que ha sido sometido el alimento. 8:Caldo Lauril Sulfato Medio recomendado para deteccién de coliformes en agua, aguas residuales y alimentos. Fundamento El alto valor nutritivo de este medio permite un répido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa atin de los de fermentacién lenta. Esta fermentacién se detecta con ‘la campana de Durham. El lauril sulfato sirve como inhibidor de la flora acompafiante. u Escaneado con CamScanner______MICROnIOLOGIA DE AUMENTOS.-CTA ‘9-Caldo Verde Brillante Este medio esti recomendado para el recuento de coltformes totales y fecales, por la técnica del niimero mas probable, Fundamento s componentes de este medio favorecen el crecimiento de bacte la bilis al 2.9% y el verde brillante inhiben gran parte de la flora Lo as coliformes, mientras que acompafante. La fermentacién de la lactosa con produccién de gas caracteriza a los coliformes. Considerar como coliformes fecales positivos aquellos que producen gas a partir de la lactosa. 10-Agua Triptona. Medio liquido recomendado para enriquecimiento y para verificar la produccién de indol por los microorganismos. Fundamento £1 agua triptona, por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, debido a su alto contenido de tritfano, es un buen sustrato para Ia produccién de indol. 11-Bacillus Cereus Selectivo Ag: Medio diagnéstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en alimentos. Fundamento Bacillus cereus, ha sido implicado en toxiinfecciones alimentarias, particularmente asociado al consumo de arroz contaminado, y también en algunos procesos infecciosos en seres humanos y animales. En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%), y la adicién de piruvato de sodio y emulsién de yema de huevo mejora el aislamiento y esporulacién de esta bacteria. Para verificar la utilizacién del manitol, se usa un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio es selectivo, por el agregado del suplemento para Bacillus cereus (cédigo BO3-606-32) con el que se obtiene una concentracién final de 100 U de Polimixina B por ml de medio. 2 Escaneado con CamScannerMedio selectivo cuando se usa de enterococos con suplement imicina para alslamlento are lemento Kanamicina par Fundamento 1 medio contine los componentes inhibdores slectivos sulfato de kanamicina y 22160 Sédica. También contiene un sistema de in crecimiento de los adores para detectar el estreptococos que hidrolizan la esculina, zonas Negras Estos microorganismos producen alrededor de las colonia por a formacién de compuestos fenélics con el herr, derivados de la hidrélisis de la esculina y el hierro ferroso, Considerar el resultado positivo para enteracocos cuando erezcan colonias rodeadas por halos de color negro. : . |13:Agar Mac Conkey / Este me se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fécil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir de muestras de aguas y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentacién de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcién en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Interpretacién de los resultados fetmentadores de lactosa: colonias rosadas-rojizas. Puede observarse! “halo de precipitacion bila. B Escaneado con CamScannerMIOLOGIA DEAUMENTOS CTA Jacroorgansmos To Termentadores de lactosa: colonlas det color del medio, Incoloras, A4-AgaeXLD Medio selectivo para el alsiamiento de Salmonellas y Shigel Fundamento las de allmentos. La xilosa es incorporada al medio ya que todos los patégenos entéricos son fermentadores pertenecientes al género Shigellae, lo de este carbohidrato, excepto los microorganismos cual permite con gran faciidad diferenciar las especies pertenecientes a este género. « adicionada basicamente para permitir la diferenciacién de microorganismos La lisina e: ya que sin isina los microorganismos pertenecie ntes a este género del genero Salmonella, losa y serian indistinguibles de las enterobacterias no fermentarian répidamente la xil patogenas que son fermentadoras de xilosa, lr (Tiosulfato de sodio y Citrato mnalmente al medio le fue incorporado un indicadl ras de H2S. permitr a identificacién de cepas productor Desoxicolato de Sodio como agente selectivo De esta forma el medio Adicio férrico de amonio) para EI medio también es adicionado de pera inhibir todas las especies de microorganismos Gram positivos. es diferencial para las especies de Salmonella y Shigella. Interpretacién de los resultados ‘Organismos: specto E.coli ‘Grandes, planos, de color amarillo. Puede haber algunas cepas inhibidas. Enterobacter/Klebsiella ‘Mucoides, amarillos Proteus De rojo a amarillo. La mayoria de las cepas tienen centros de color negro. De rojo.a amarillo con centros de color negro. ‘Salmonella, positiva 0 H2S ‘Shigella, Salmonella, negativas a | Rojo Has Pseudomonas Rojo Bacterias Gram positivas Crecimiento escaso 0 nulo (15: Selenito Cistina Medio utiizado para el enriquecimiento selectivo de ‘Salmonella spp. @ partir de alimentos y otros materiales de importancia santaria. 14 Escaneado con CamScannerFundamento En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrlentes necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoria de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubacién, la Lei ina es el agente reductor y la FDA propuso que se agregue a la formulacién del Selenito Caldo porque reduce la toxicidad del selenito de sodio llevando asi a una mayor Tecuperacién de especies de Salmonella. ‘TEMPERATURAS Y TIEMPOS DE INCUBACION [ Microorganismos Temperatura y tlempo de incubacion — Aerobios mesofilos Bs Mohos,levaduras A2S°C durante 3 a7 dias Coliformes Totales asic durante zens a 45°C durante 48 hs a 45°C durante 48 hs Coliformes Fecales Escherichia .coli ‘a 37°C durante 48 hs Stretococcus, Clostridium Sulfito Reductores Pseudomonas Auriginosas, Salmonella, ‘a 37°C durante 48 hs Stapylococcus Aureus. Escaneado con CamScanner