Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia 2015

Dorota Żabicka1, Anna Baraniak2, Elżbieta Literacka1,

Marek Gniadkowski2, Waleria Hryniewicz1

1. Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków

2. Zakład Mikrobiologii Molekularnej, Narodowy Instytut Leków

Pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae

U pałeczek jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae najczęściej występują karbapenemazy

KPC (klasa A), metalo-β-laktamazy VIM, NDM (MBL, klasa B) oraz (OXA-48 (klasa D).
Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) zgodnie z
rekomendacjami EUCAST zaleca wykrywanie karbapenemaz u wszystkich izolatów
Enterobacteriaceae,, wykazujących obniżoną wrażliwość na którykolwiek z karbapenemów:
ertapenem, meropenem lub imipenem. Właściwe wartości graniczne karbapenemów, które
należy użyć aby zakwalifikować szczep do fenotypowych testów przesiewowych w kierunku
wykrywania karbapenemaz zamieszczono w Tabeli 1.

Dla wszystkich szczepów spełniających kryteria zawarte w tabeli nr 1 należy wykonać testy:
1. test Carba NP (metodyka dostępna na stronie KORLD) oraz
2. fenotypowe testy przesiewowe (metodyka w załączniku 1):
a. test z EDTA w kierunku MBL (Lee, 2003)
b. test z kwasem boronowym w kierunku KPC (Doi, 2008)
c. test z krążkiem z temocyliną 30 µg w kierunku OXA-48 (Glupczyński, 2012, van
Dijk, 2013)
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Algorytm wykonywania testów przesiewowych przedstawiono na rycinie nr 1.

Dodatni wynik testu Carba NP potwierdza występowanie karbapenemazy w badanym izolacie
bakterii ze 100% pewnością. Wykonanie testu Carba NP przyspiesza wydanie wyniku na
Oddział i do Zespołu ds. Kontroli Zakażeń Szpitalnych oraz podjęcie właściwych procedur
zapobiegających rozprzestrzenianiu się szczepów wytwarzających karbapenemazy.

Tabela nr 1.
Kliniczne wartości graniczne oraz wartości odcięcia stosowane do wyboru szczepów do
fenotypowych testów przesiewowych w kierunku wykrycia karbapenemaz u pałeczek
Enterobacteriaceae (zgodnie z metodologią EUCAST); (EUCAST, 2013).

Karbapenem Wartości MIC (mg/L) Wielkość strefy zahamowania

wzrostu, krążek 10 µg (mm)
Kliniczna Wartość Kliniczna Wartość
wartość odcięcia dla wartość odcięcia dla
graniczna testów graniczna testów
przesiewowych przesiewowych
Meropenem1 ≤2 >0,12 ≥22 <252
Imipenem3 ≤2 >1 ≥22 <23
Ertapenem4 ≤0,5 >0,12 ≥25 <25
1
Meropenem wykazuje najlepszą czułość i specyficzność jako wskaźnik obecności karbapenemazy.
2
W przypadku niektórych producentów OXA-48 wielkość strefy zahamowania wzrostu może dochodzić do
26 mm; w przypadku ognisk epidemicznych wywołanych przez szczepy OXA-48 można używać wartości
odcięcia <27 mm, ale następuje wtedy obniżenie specyficzności testu.
3
Nie zaleca się wyboru szczepów do badań przesiewowych na podstawie wyniku oznaczania wrażliwości dla
samego imipenemu , ze względu na brak wyraźnej granicy wartości MIC i wielkości stref zahamowania wzrostu
pomiędzy szczepami dzikimi i szczepami wytwarzającymi karbapenemazami.
4
Ertapenem wykazuje wysoką czułość wykrywania karbapenemaz, ale niską specyficzność.

Wszystkie szczepy z interpretacją „dodatni” w fenotypowych testach przesiewowych dla

którejkolwiek z karbapenemaz (interpretacja: algorytm rycina nr 1) należy niezwłocznie
przesłać do potwierdzenia do Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości
Drobnoustrojów (KORLD) w celu potwierdzenia występowania karbapenemazy
metodami referencyjnymi.

Do potwierdzenia należy wysyłać zarówno szczepy wyhodowane z zakażeń jak

i z kolonizacji. Jeśli w tym samym czasie od jednego pacjenta zostaną wyhodowane
szczepy z zakażeń i z kolonizacji, to do potwierdzenia należy wysłać pierwszy szczep
wyhodowany z zakażenia.
W przypadku wyhodowania szczepów w ognisku epidemicznym do potwierdzenia
w KORLD należy przesłać wszystkie szczepy wyhodowane w ognisku.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 2 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Rycina 1. Algorytm wykonywania testów przesiewowych w celu wykrycia karbapenemaz u Enterobacteriaceae.

Układ krążków do wykrycia karbap enemaz Wykrywanie karbapenemaz u Enterobacteriaceae

metod ą fe notypową
KPC
wszystkie izolaty spełniające następujące kryteria:

MEM 10 Kar ba pe ne m Wa rtość MIC Wie lk ość stre fy zahamowania wzrost u

OXA-48 (mg/L) krą żek 10 µg (mm )
MEM 10 +
TEM30
kw. boronowy merop en em >0,12 <25
imi pen em >1 <23
2 cm 2 cm
e rtape nem >0,12 <25
CAZ 30 EDT A IPM 10

MBL jednocześnie

Aga r Mue lle r-Hi nton Test Carba NP

Wynik d odatni Wynik ujemny

szczep wytwa rza szcze p nie wytwa rza
Testy fenotypowe karb ap ene ma zę ka rba pen emazy
MBL / OXA-48 / KPC
Wyn ik wątpliwy
powtó rzyć test
strefy zah amow ani a wzrostu wo kół
p owi ększe nie strefy wo kół strefa zaha mowan ia krą żków zaw iera jących
krążka C AZ i/lu b IMP w w zrostu wokó ł krążka
MEM + kw. boronowy / MEM
stro nę krążka EDTA TEM wy nosi ?1 0 mm
różnią się o 4 m m (lub więce j)

MBL+ OXA-48+ KPC+ Inform acja na Oddzia ł

Oprac owanie: Zak ład E pidemi ologii i Mi krobiologii Kli nicznej, Zak ład M ik robi ol ogi i M olekularnej, Narodowy I nst yt ut Lek ów, Warsz awa, 2015r.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 3 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Pałeczki niefermentujące z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter

Pałeczki niefementujące Pseudomonas spp. najczęściej wytwarzają karbapenemazy klasy B czyli

MBL, natomiast Acinetobacter spp. karbapenemazy klasy D (karbapenemazy z rodziny OXA).
Pojawiły się również doniesienia o występowaniu u tych drobnoustrojów karbapenemaz klasy A -
KPC. Wykrywanie karbapenemaz u pałeczek niefermentujących należy wykonywać w przypadku
szczepów spełniających następujące kryteria:
• Pseudomonas aeruginosa: izolaty niewrażliwe (średniowrażliwe lub oporne) na karbapenemy
(imipenem, meropenem lub doripenem) i oporne na tikarcylinę z kwasem klawulanowym
• Acinetobacter spp. i pozostałe gatunki Pseudomonas spp.: izolaty niewrażliwe
(średniowrażliwe lub oporne) na karbapenemy

Dla wszystkich szczepów spełniających powyższe kryteria należy wykonać test Carba
NP/CarbAcineto (metodyka dostępna na stronie KORLD) oraz fenotypowe testy przesiewowe
z EDTA w kierunku wykrycia MBL oraz test z kwasem boronowym w kierunku KPC (metodyka
w załączniku 1). Testów fenotypowych w kierunku OXA nie wykonuje się. Algorytm wykonania
testów przesiewowych dla Pseudomonas spp. przedstawia rycina nr 2, natomiast dla Acinetobacter
spp. rycina 3. Metodykę wykonywania testów przesiewowych podano w załączniku nr 1.

Do potwierdzenia przez KORLD należy przesyłać wszystkie szczepy wyhodowane z zakażeń,

niewrażliwe na karbapenemy i wykazujące dodatni albo niejednoznaczny wynik testu
w kierunku MBL lub dodatni wynik testu w kierunku KPC.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 4 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Rycina 2. Algorytm wykonywania testów przesiewowych w celu wykrycia karbapenemaz u pałeczek Pseudomonas spp.

Ukła d krążków do wykrycia Wykrywanie karbapenemaz u Pseudomonas spp.

karbapenemaz MBL / KPC metodą
fenotypową
P. aeruginosa: izolaty niewrażliwe (I/R) na MEM i/lub IMP
oraz opo rne (R) na TIM (tikarcylin a);
inne Pseudomonas sp p.: niewrażliwe (I/R) n a MEM i/lub IMP

jednocześnie

Agar Muel ler-Hinton Test Carba NP

Wynik d odatni Wynik ujemny

szczep wytwa rza szczep nie wytwa rza
Testy fenotypowe karb apene ma zę karba pen emazy
MBL / KPC
Wynik wątpliwy
powtó rzyć test
str efy zah amow ani a wzrostu wo kół
p owi ększe nie strefy wo kół krą żków zawi erających
krążka C AZ i/l ub IMP w
MEM + kw. boronowy / MEM
stro nę krążka ED TA
różnią się o 7 mm (lub więce j)

MBL+ KPC+ Informacja na Oddział

Opracowanie: Zakład E pidemi ologii i Mi krobiologii Kli nicz nej, Zak ład M ik robi ol ogi i M olekularnej, Narodowy I nst yt ut Lek ów, Warszawa, 2015r.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 5 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Rycina 3. Algorytm wykonywania testów przesiewowych w celu wykrycia karbapenemaz u pałeczek Acinetobacter spp.

Ukł ad krążkó w do wykryci a

karbapenemaz MBL / KPC metodą Wykrywanie karbape nemaz u Acine tobacter spp.
fenotypową

izolaty niewrażliwe ( I/R) na MEM i/lub IMP

jednocześni e

Test CarbAcineto
Agar Mueller-Hinton

Wynik dodatni Wynik ujemny

szczep wytwa rza szcze p nie wytwa rza
Testy fenotypowe karb ap ene ma zę ka rba pen emazy
MBL / KPC
Wyn ik wątpliwy
strefy zah amow ani a wzrostu wo kół powtó rzyć test
p owi ększe nie strefy wo kół krą żków zawi era jących
krążka C AZ i/lu b IMP w MEM + kw. boronowy / MEM
stro nę krążka EDTA
różnią się o 7 m m (lub więce j) Informac ja na Oddział
MBL+ KPC+
Uwaga:
Sz cz ep, dl a kt órego test CarbAcineto j est dod atni oraz wyniki test ów fenot ypowych w
kierunku MBL i KP C są ujemn e, raporto wać j ako szczep wytwarz ający n abytą
karbapenemazę, najprawdopodo bniej z grupy OXA.

Opracowanie: Zak ład E pidemi ologii i Mi krobiologii Kli nicznej, Zakład M ikrobi ol ogi i M olekularnej, Narodowy I nst yt ut Lek ów, Warsz awa, 2015r.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 6 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Literatura

1. Europejski komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST). Tabele interpretacji

wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref
zahamowania wzrostu. Wersja 5.0, obowiązująca od 1 stycznia 2015r.. Strona
internetowa Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości
Drobnoustrojów www.korld.edu.pl (2015)

2. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistance of

clinical and/or epidemiological importance. Version 1.0, July 2013. Strona
internetowa European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
www.eucast.org (2013)

3. M. Gniadkowski, D. Żabicka, W. Hryniewicz. Rekomendacje doboru testów do

oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Oznaczanie
wrażliwości pałeczek gram-ujemnych. Strona internetowa Krajowego Ośrodka
Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów www.korld.edu.pl (2009)

4. Lee K., Y. S. Lim, D. Yong, J. H. Yum, Y. Chong. Evaluation of the Hodge test and
the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-
producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J. Clin. Microbiol.,
41, 4623-4629 (2003)

5. Doi Y., B.A. Potoski, J.M. Adams-Haduch, H. E. Sidjabat, A. W. Pasculle, D. L.

Paterson. Simple disk-based method for detection of Klebsiella pneumoniae
carbapenemase-type β-lactamase by use of a boronic acid compound. J. Clin.
Microbiol. 46, 4083-4086 (2008)

6. Glupczynski Y., Huang T.D., Bouchahrouf W., Rezende de Castro R., Bauraing C.,
Gèrard M., Verbruggen A-M., Deplano A., Denis O., Bogaets P. Rapid emergence and
spread of OXA-48-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in
Belgian hospitals. Int. J. Antimicrob. Agents. 39, 168-172 (2012)

7. van Dijk K., Voets G., Scharringa J., Voskuil S., Fluit A., Rottier W., Leverstein-Van
Hall M., Cohen Stuart J. A disc diffusion assay for detection of class A, B and OXA-
48 carbapenemases in Enterobacteriaceae using phenyl boronic acid, dipicolinic acid,
and temocillin. Clin Microbiol Infect. 20(4):345-9 (2014)

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 7 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Załącznik 1.

Metody wykrywania karbapenemaz – fenotypowe testy przesiewowe

Wykrywanie MBL testem fenotypowym z EDTA (Lee, 2003)

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z metodyką EUCAST.

• Sterylne krążki bibułowe o średnicy 6 mm nasączyć 10 µl sterylnego 0,5M roztworu
EDTA, pH 7,3-7,5.
• Na podłoże Mueller-Hinton agar nanieść zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 McFarlanda
w 0,9% NaCl
• Ułożyć krążek z EDTA i po jego obu stronach krążki z ceftazydymem 30 µg
i imipenemem 10 µg, w odległości 2 cm od krążka z EDTA (między środkami
krążków).
• Płytki inkubować w 35°C ± 1°C przez 18 ± 2 godz.
• Wynik dodatni testu: pojawienie się i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka
z ceftazydymem i/lub karbapenemem od strony krążka zawierającego EDTA,
inhibitora MBL (obraz podobny do dodatniego wyniku oznaczania ESBL metodą
dwóch krążków).

Wykrywanie KPC testem fenotypowym z kwasem boronowym (Doi, 2008)

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z metodyką EUCAST.

• Przygotować krążki meropenem + kwas fenyloboronowy. Krążki meropenem 10 µg
nasączyć 300 µg kwasu fenyloboronowego (20 µl roztworu o stężeniu 15 mg/ml)
i zostawić na 30 min w temperaturze pokojowej.
• Na podłoże Mueller-Hinton agar nanieść zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 McFarlanda
w 0,9% NaCl.
• Ułożyć krążek meropenem 10 µg i w odległości nie mniejszej niż 3 cm krążek
meropenem + kwas fenyloboronowy
• Płytki inkubować w 35°C ± 1°C przez 18 ± 2 godz.
• Wynik dodatni testu, podejrzenie produkcji KPC:
pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae: różnica (powiększenie) wielkości
średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z meropenemem
w stosunku do krążka meropenem + kwas fenyloboronowy o 4 mm lub więcej;
pałeczek niefermentujących z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter: różnica
(powiększenie) wielkości średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka
z meropenemem w stosunku do krążka meropenem + kwas fenyloboronowy
o 7 mm lub więcej.

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 8 z 9
 Wykrywanie karbapenemaz – zalecenia KORLD 2015

Wykrywanie OXA-48 testem z krążkiem z temocyliną 30 µg (Glupczyński, 2012, van

Dijk, 2013)

Oznaczenie wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z metodyką EUCAST.

• Na podłoże Mueller-Hinton agar nanieść zawiesinę bakterii o gęstości 0,5 McFarlanda
w 0,9% NaCl
• Ułożyć krążek z temocyliną 30 µg
• Płytki inkubować w 35°C ± 1°C przez 18 ± 2 godz.
• Wynik dodatni testu i podejrzenie produkcji OXA-48: średnica strefy zahamowania
wzrostu mniejsza lub równa 10 mm.

Izolaty Enterobacteriaceae produkujące karbapenemazę OXA-48 wykazują wysoki poziom

oporności na temocylinę (MIC od 128 do >256 mg/L) oraz oporność na piperacylinę
z tazobaktamem (Glupczynski, 2012).

Szczepy kontrolne:
• Escherichia coli ATCC 25922 - kontrola jakości oznaczania lekowrażliwości, służy
także do kontroli jakości oznaczenia ESBL jako kontrola ujemna
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - kontrola jakości oznaczania lekowrażliwości
służy także do kontroli jakości prawidłowej zawartości Ca2+ i Mg2+ w podłożu MHA
• Pseudomonas aeruginosa MIKROBANK 13.001 - służy do kontroli jakości
oznaczania MBL (kontrola dodatnia, szczep MBL+).

Szczepy kontrolne do wykrywania karbapenemaz metodami fenotypowymi, zalecane

przez EUCAST (2).

Szczep Mechanizm

K. pneumoniae NCTC 13440 kontrola dodatnia MBL+

K. pneumoniae NCTC 13438 kontrola dodatnia KPC +

K. pneumoniae NCTC 13442 kontrola dodatnia OXA-48+

K. pneumoniae ATCC 25955 kontrola ujemna (szczep wrażliwy na karbapenemy)

Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Narodowy Instytut Leków

Strona 9 z 9