Molekularna genetika

4. metodska cjelina

Prof.dr.sc. Ivan-Krešimir Svetec, iksvetec@pbf.hr

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Zavod za biokemijsko inženjerstvo
Pierottijeva 6
Laboratorij za biologiju i genetiku mikroorganizama
Kršnjavoga 25, 10.000 Zagreb

 Promjene genetičkog materijala - mutacije

⚫ vrste promjena genetičkog materijala
• prerasporedi genetičkog materijala
• genetička rekombinacija, transpozicija
• epigenetičke promjene
• Mutacije
⚫ mutacija nije oštećenje DNA!
⚫ vrste mutacija
• genomske, kromosomske i genske (točkaste) mutacije
⚫ vrste točkastih mutacija
• pomak okvira čitanja
• zamjena para baza (tranzicija, transvrrzija)
• nonsense, missense i tihe mutacije
⚫ povratne (reverzne) i supresorske mutacije
⚫ intragenske i intergenske supresorske mutacije
• Ames-ov
• test i test fluktuacije
• učestalost (frekvencija) mutacija (mutanata)
• stopa (brzina) mutiranja
⚫ detekcija (otkrivanje) mutacija – „replica plating”

1
 Vrste promjena genetičkog materijala

 podjela na temelju mehanizma koji je odgovoran za nastanak promjene

⚫ prerasporedi genetičkog materijala
• nove kombinacije postojećih sljedova nukleotida
• genetička rekombinacija
⚫ mutacije
• de novo promjene redoslijeda nukleotida
• u pravilu ne nastaju reorganizacijom i rekombinacijom
postojećih sljedova nukleotida

 međutim, mutacijom se često naziva svaka promjena genetičkog

materijala bilo na razini jednog ili više nukleotida, cijelog kromosoma ili
cjelokupnog genoma bez obzira na mehanizam nastanka genetičke
promjene

Epigenetske promjene

 nasljedne promjene fenotipa koje nisu posljedica promjene

redosljeda nukleotida – epigenetika
⚫ genetika eukariota (diplomski studij molekularne biotehnologije)

2
 Mutacije Mutacija nije oštećenje DNA ! ! !
Mutacija se ne popravlja! Popravlja se oštećenje!

 oštećenje DNA
⚫ jednolančani lom
• pucanje fosfodiesterske veze u jednom lancu DNA
⚫ dvolančani lom
• pucanje fosfodiesterske veze relativno blizu u oba lanca DNA
⚫ AP-mjesta
• apurinska i apirimidinska mjesta, zbog pucanja N-glikozidne veze
⚫ kemijska modifikacija
• nukleinskih baza ili deoksiriboze
• kovalentno povezivanje baza . . . . . .
 mutacija
⚫ uobičajena DNA (bez oštećenja) ali promijenjen redosljed nukleotida

ATTATCGTCT ATTATC TCT ATTATCCTCT

TAATAGCAGA TAATAGCAGA TAATAGGAGA

Mutacije

 mutacijom se često naziva svaka promjena genetičkog materijala bilo na

razini jednog ili više nukleotida, cijelog kromosoma ili cjelokupnog genoma
bez obzira na mehanizam nastanka genetičke promjene

 mutacije mogu uzrokovati promjenu na razini:

⚫ genoma – “genomske mutacije”
• poliploidija – promjena broja “setova” kromosoma
• aneuploidija – promjena broja pojedinačnih kromosoma
⚫ kromosoma – “kromosomske mutacije” (“kromosomske aberacije”)
• delecije, duplikacije, inverzije, translokacije
⚫ gena – “genske mutacije” (pogađaju pojedine gene?!?)
• insercija, delecija ili zamjena jednog ili više parova baza
• insercija, delecija ili zamjena jednog para baza – “točkasta
mutacija”

3
 Mutacije – izvor varijabilnost

Haploid, monoploidi i euploid

 haploidni broj kromosoma

⚫ broj kromosoma u gametama
⚫ haploid nije uvijek monoploid

 monoploidi
⚫ organizmi koji imaju samo jedan set (garnituru) kromosoma,
odnosno osnovni broj kromosoma (x)
⚫ npr. trut – razvija se iz neoplođene jajne stanice

 euploidi
⚫ organizmi s uobičajenim brojem kromosoma
• npr. čovjek
• 1n = broj kromosoma u spolnim stanicama (gametama) = 23
• 2n = broj kromosoma u zigoti i somatskim stanicama = 46

4
 Poliploidija i aneuploidija

 poliploidi
⚫ nastaju duplikacijom cijelog seta kromosoma (odnosno svih kromosoma u
jednom setu)
⚫ imaju 3 ili više setova kromosoma; triploidi, tetraploidi, pentaploidi . . .
 aneuploidi
⚫ broj kopija nekih homolognih kromosoma nije jednak ploiditetu, npr.:
• 2n-1 - monosomija (monosomična stanica)
• 2n-1-1 - stanica s dvije monosomije
• 2n-2 - nulsomija (nulsomična stanica)
• 2n+1 - trisomija (trisomična stanica)
• 2n+2 - tetrasomija (tetrasomična stanica)
• 2n+1+1 - stanica s dvije trisomije
 Uobičajeni broj kromosoma u somatskim stanicama nekog diploidnog
organizma je 12. Što možete reći o stanici ovog organizma koja ima:
- 1n+1 a) 7 kromosoma
- 2n+1 b) 13 kromosoma

Ploiditet, osnovni broj kromosoma?

5
 Poliploidija u biljaka

 DSMB - GMO u proizvodnji hrane

⚫ poliploidija relativno česta i korisna
⚫ mehanizmi nastanka poliploida
⚫ triploidi – plodovi bez sjemenki

Uzroci aneuploidije

 pogrešna segregacija kromosoma tijekom mitoze

metafaza anafaza

diploidna 2n-1 2n+1

stanica

2n = 4 monosomija trisomija
x=2 “crvenog kromosoma” “crvenog” kromosoma”

6
 Uzroci aneuploidije prikazan je jedan par homolognih
kromosoma; sestrinske kromatide
prikazane su istom bojom
 pogrešna segregacija tijekom mejoze

replikacija

mejoza I

mejoza II

dvije disomične i dvije jedna nulsomična, jedna disomična i

nulsomične gamete dvije normalne gamete

Genomske mutacije u životinja

 DSMB – Genetika eukariota

7
 Kromosomske mutacije (kromosomske aberacije)

 velike promjene u strukturi jednog ili više kromosoma

 uzrok
⚫ dvolančani lomovi DNA
 vrste
⚫ inverzije
⚫ delecije a a b
b b a
⚫ insercije
⚫ translokacije
⚫ recipročne translokacije inverzija
⚫ duplikacije

(kružni kromosom)

delecija

Kromosomske mutacije (aberacije)

delecija inverzija insercija

translokacija recipročna translokacija

duplikacija

8
 Kromosomske mutacije (aberacije)

 posljedice
⚫ gubitak genetičke informacije (delecije)
⚫ gubitak heterozigotnosti (LOH) – ispoljavanje recesivnih mutacija
⚫ promjene u regulaciji ekspresije gena
⚫ fuzija dvaju različitih gena (pojava hibridnog proteina)
⚫ nasljedne bolesti

Genske mutacije

 pogađaju pojedine gene

⚫ mutacije u kodirajućoj DNA (ORF)
⚫ ali i u nekodirajućoj DNA (operatori, promotori, terminatori,
introni, pseudogeni, satelitska DNA, centromere, telomere,
ishodišta replikacije . . ., odnosno bilo gdje u genomu)
⚫ zahvaćaju relativno malu (kratku, diskretnu) regiju DNA

 glavni izvor genetičke varijabilnosti

 mogu imati različite biološke posljedice

9
 Genske mutacije – točkaste mutacije

 mutacije na razini jedog para baza

⚫ ispuštanje (delecija) jednog para baza
⚫ umetanje (insercija) jednog para baza
⚫ zamjena (supstitucija) jednog para baza drugim parom baza

ATACATAGGA
TATGTATCCT

ATACCATAGGA ATAATAGGA ATAGATAGGA

TATGGTATCCT TATTATCCT TATCTATCCT
insercija delecija supstitucija

mutacije koje uzrokuju promjena samo jednog kodona

pomak okvira čitanja (CAT u GAT)
(“frame-shift” mutacije)

Točkaste mutacije

 mutacije supstitucije para baza

⚫ tranzicija - zamjena (supstitucija) purinske baze purinskom i
pirimidinske baze pirimidinskom ( npr. AT u GC)
⚫ transverzija - zamjena purinske baze pirimidinskom i pirimidinske
purinskom (npr. AT u TA)

A C

G T

10
 Točkaste mutacije – obzirom na njihove posljedice

 “null” mutacija – uzrokuje potpuni gubitak funkcije proteina

⚫ “frame-shift” mutacija (insercije i delecije)
⚫ pojava STOP kodona (zbog FS mutacije ili supstitucije) – “nonsense” mutacija
 “missense” mutacije – zamjena jedne aminokiseline s drugom u
polipeptidnom lancu (mogu ali i ne moraju uzrokovati promjenu fenotipa)
 mutacije koje ne uzrokuju promjenu fenotipa
⚫ neke “missense” mutacije (npr. konzervativna zamjena aminokiselina)
⚫ tihe (“silent”) mutacije – uzrokuju promjenu kodona u DNA ali ne i promjenu
aminokiseline u polipeptidu
⚫ mutacije u nekodirajućim dijelovima genoma (ali ne sve)
 uvjetne (kondicionalne) mutacije – očituju se samo u određenim
okolnostima
⚫ npr. pri povišenoj temperaturi (termosenzitivni mutanti, ts-mutacije)
 povratne mutacije
 supresorske mutacije

Frame-shift mutacije

3’---TACACCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)
insercija
GC
5’---AUGUGGCUCCCUGAUUAU---3’ - mRNA

NH2---Met-Trp-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH

3’---TACACCGGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)

NH2---Met-Trp-Gly-Gly-Thr-Asn---COOH
promjena slijeda svih aminokiselina “nizvodno” od mutacije,
a može se pojaviti i STOP kodon

11
 Nonsense mutacije

3’---TACACCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)
tranzicija
CG u TA
5’---AUGUGGCUCCCUGAUUAU---3’ - mRNA

NH2---Met-Trp-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH

3’---TACATCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTAGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)

NH2---Met-COOH
prekid sinteze polipeptidnog lanca zbog pojave STOP kodona

Missense mutacije

3’---TACACCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)
transverzja
AT u CG
5’---AUGUGGCUCCCUGAUUAU---3’ - mRNA

NH2---Met-Trp-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH

3’---TACCCCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGGGGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)

NH2---Met-Gly-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH
zamjena jedne aminokiseline drugom
(može ali i ne mora imati utjecaj na aktivnost proteina)

12
 Tihe mutacije

3’---TACACCGAGGGACTAATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCTCCCTGATTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)
tranzicija
AT u GC
5’---AUGUGGCUCCCUGAUUAU---3’ - mRNA

NH2---Met-Trp-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH

3’---TACACCGAGGGACTGATA---5’ - nekodirajući lanac (kalup)

5’---ATGTGGCTCCCTGACTAT---3’ - kodirajući lanac (kao mRNA)

NH2---Met-Trp-Leu-Pro-Asp-Tyr---COOH
zamjena jednog kodona drugim, ali aminokiselinski sastav polipeptidnog
lanca ostaje isti jer oba kodona (GAC i GAT) kodiraju za Asp

Povratna mutacija

 sinonimi – retromutacija, reverzna mutacija, reverzija

⚫ stanice u kojima se dogodila takva mutacija – retromutanti, revertanti

ATACATA
TATGTAT
insercija delecija supstitucija
mutacija GC CG CG sa GC

ATACGATA ATAATA ATAGATA

TATGCTAT TATTAT TATCTAT
delecija insercija supstitucija
povratna mutacija GC CG GC sa CG

ATACATA ATACATA ATACATA

TATGTAT TATGTAT TATGTAT

 povratna mutacija poništava mutaciju jer ponovno uspostavlja

redosljed nukleotida koji je postojao prije mutacije (a time uspostavlja
i prvobitni fenotip stanice)

13
 Supresorska mutacija

 poništava (suprimira) djelovanje prethodne mutacije (uspostavlja

prvobitni fenotip), ali ne uspostavlja prvobitni redoslijed nukleotida
 supresorska mutacija (supresija) može biti:
⚫ intragenska supresija
• mutacija i supresor mutacije (supresorska mutacija) nalaze
se u istom genu
⚫ intergenska supresija
• mutacija i supresor mutacije nalaze se u različitim genima
• mutacija u jednom genu poništava (suprimira) djelovanje
mutacije nekom drugom genu

Intragenska supresija nije reverzija

mutacija (insercija GC)

3’--TACACCGGAGGGACTAATA--5’ reverzija (delecija GC)
5’--ATGTGGCCTCCCTGATTAT--3’
3’--TACACCGAGGGACTAATA--5’
NH2---Met-Trp-Gly-Gly-Thr--- 5’--ATGTGGCTCCCTGATTAT--3’
inaktivni protein
NH2--Met-Trp-Leu-Pro-Asp---
supresorska mutacija (delecija 1 pb) aktivni protein
3’--TACACCGGGGGACTAATA--5’
5’--ATGTGGCCCCCTGATTAT--3’

NH2---Met-Trp-Pro-Pro-Asp---
aktivni protein
- supresorska mutacija ponovno je uspostavila ispravan okvir čitanja pa je u
novonastalom proteinu samo jedna amnokeislina zamijenjena drugom, a to
ne mora utjecati na aktivnost proteina
- supresija može biti i djelomična (nepotpuna)

14
 Reverzija, intragenska i intergenska supresija

fenotip i genotip divljeg tipa

reverzija

m
fenotip i genotip mutanta

intragenska supresija intergenska supresija

mm m

fenotip divljeg tipa m

fenotip divljeg tipa

Intergenske supresorske mutacije

 infromacijske supresorske mutacije

⚫ neposredna (direktna) supresija nonsense ili missense mutacija
⚫ supresorska mutacija u genu za neku tRNA
• supresija mutacije koja je uzrokovala pojavu STOP kodona ili zamjenu
jedne aminokiseline drugom koja uzrokuje promjenu antikodona
 funkcionalne supresorske mutacije
⚫ posredna (indirektna) supresija
• supresorska mutacija utječe na količinu proteina (mutacije u
promotoru, transkripcijskim faktorima . . )
• supresorska mutacija ponovno omogućava interakciju dvaju proteina
• supresorska mutacija omogućava ponovnu interakciju proteina i DNA
(jedna mutacija u regulatirnom proteinu, a druga u operatoru) - oba
gena/proteina/sekvencije uključene u isti proces
• proteini uključeni u različite procese (npr. mutacija u genu za laktoza
permeazu koja omogućava transport maltoze)

15
 Dominantne i recesivne mutacije

 Recesivne – mutacija uzrokuje gubitak nekog svojstva

⚫ primjerice inaktivacija nekog enzima
⚫ mutacija se neće izraziti u fenotipu ako postoji drugi funkcionalni
gen za isti enzim
⚫ heterozigot ima fenotip dominantnog alela (svojstva)

 Dominantne – mutacija uzrokuje pojavu novog svojstva:

⚫ primjerice pojačana ili izmijenjena aktivnost nekog enzima

Koliko često se događaju mutacije?

 Spontane mutacije
⚫ bez utjecaja vanjskih faktora
⚫ ovise o preciznosti replikacija DNA
⚫ učestalost oko 10-9

 Učestalost mutacija može se povećati izlaganjem stanica

mutagenim agensima

 Mutatori
⚫ stanice/organizmi u kojima je povećana učestalost pojave mutacija
(mutator fenotip)
⚫ imaju mutacije u genima odgovornim za „preciznost replikacije DNA”
(mutator mutacije)

16
 Detekcija/otkrivanje mutacija

 Molekularno-genetičke metode – Genetičko inženjerstvo

 Mikrobiološka metoda – auksonografska analiza metodom repliciranja

auksotrofni mutanti
(„replica plating”)

preslikane kolonije na
podloga s kolonijama novim podlogama
za analizu kompletna minimalna
(„master plate”) (kontrola)
obično kompletna

otisak kolonija na
sterilnom baršunu

Preslikavanje moguće na više različitih

podloga – određivanje fenotipa

Ames-ov test

 test za detekciju kemijskih mutagena

 koriste se bakterijski sojevi, auksotrofni mutanti ovisni o histidinu
⚫ auksotrofni mutanti ovisni o histidinu – imaju točkastu mutaciju u
jednom od gena potrebnih za biosintezu histidina (frame-shift mutaciju
ili zamjenu para baza)
 sojevi se uzgoje u kompletnoj tekućoj podlozi do stacionarne faze rasta
(2∙109 st/mL), a zatim nacjepljuju na krute hranjive podloge:
⚫ podloga bez histidina
retromutanti (spontani)
⚫ podloga bez histidina + ispitivana kemikalija
 ako na podlozi s ispitivanom tvari ima retromutanti
(spontani + inducirani)
značajno više kolonija (retromutanata)
ispitivana tvar je mutagena
 ako tvar uzrokuje pojačanu reverziju sojeva koji imaju FS-mutaciju,
ispitivana tvar je mutagen koji uzrokuje FS-mutaciju (analogno za mutaciju
supstutucijom para baza)

17
 Mutacije – varijabilnost – adaptacija!?

 bakterijski sojevi koji se koriste za Ames-ov test su auksotrofni mutanti

ovisni o histidinu, ali neke stanice ipak izrastu na podlozi bez histidina
⚫ Zašto?
⚫ Jer se u tim stanicama dogodila reverzija mutacije.
⚫ Da li bi se ta mutacija dogodila i da stanice stanice nisu bile
nacijepljene na podlogu bez histidina?
• Da?!
• Ne?!

Salvador Luria i Max Delbrück (1943.)

 bakterija E. coli (TonS) osjetljiva je na bakteriofag T1

⚫ ako se podloga u kojoj se nalazi bakteriofag T1 nacijepi sa:
• 100-300 bakterijskih stanica – niti jedna stanica neće formirati
koloniju (fagi su inficirali i lizirali sve bakterijske stanice)
• 107-108 stanica – na podlozi će se formirati nekoliko kolonija –
nekoliko stanica postalo je rezistentno na fag T1 (postale su TonR)

107-108
stanica E. coli

100-300 podloga s bakteriofagom T1

stanica E. coli (1010-1011)

TonR
podloga s bakteriofagom T1
(1010-1011)

18
 Salvador Luria i Max Delbrück (1943.)

TonS TonR
mutacija

 Da li se mutacija dogodila zbog kontakta s bakteriofagom?

⚫ Da?!
inteligencija?!
⚫ Ne?!
 Da li se te mutacije događaju i u bakterijama koje nikada nisu i nikada
neće doći u kontakt s bakteriogagom T1?
⚫ Da?! zašto?!
⚫ Ne?!

 odgovor na temelju rezultata eksperimenta – test fluktuacije

S. Luria i M. Delbrück – test fluktuacije

epruvete nacjepljene s ~1.000 stanica E. coli (TonS)
(pojedinačne kulture)
E. coli (TonS)
108 st/mL

uzgoj

~108
stanica

podjednak broj
TonR kolonija na
podloge koje sadrže fag T1
podlogama koje
sadrže fag T1
broj rezistentnih kolonija: A) podjednak?!
B) različit?!

19
 Test fluktuacije

 (A) podjednak broj TonR kolonija

⚫ na svaku podlogu nacjepljen je podjednak broj osjetljivih stanica
koje s određenom vjerojatnošću postaju rezistentne – mutacija koja
je odgovorna za rezistenciju na fag nastaje zbog kontakta sa fagom

Test fluktuacije

 (B) različit broj TonR kolonija

⚫ mutacije se događaju prije kontakta s fagom, tijekom uzgoja u
tekućoj podlozi
⚫ ako se mutacija dogodi ranije, tijekom uzgoja nastat će više
rezistentnih stanica pa će na podlozi s fagom izrasti i više kolonija
⚫ mutacije se događaju bez obzira na kontakt s bakteriofagom

20
 Test fluktuacije

 stvarni rezultati (S. Luria i M. Delbrück, 1943.)

⚫ broj rezistentnih kolonija (TonR) na podlozi s bakteriofagom

1 0 3 0 0 5 0 5 0 6 107 0 0 0 1 0 0 64 0 35 fluktuacija

 frekvencija (učestalost) mutacije (točnije, frekvencija mutanata) (f)

f = n/N (n – broj mutanata; N – ukupni broj stanica (108)
⚫ različita za različite pojedinačne kulture (srednja vrijednost?)
 stopa mutiranja (stopa mutacije, “mutation rate”, brzina mutiranja)
⚫ vjerojatnost da se tijekom jedne diobe stanice (replikacije DNA)
dogodi određena mutacija
a = m/N (m – broj mutacija; N – broj replikacija)
N = (konačni broj stanica) – (početni broj stanica)

Učestalost mutacije i stopa mutacije

broj generacija 4 4 4
početni broj stanica 1 1 1
konačni broj stanica 16 16 16
broj replikacija 16 – 1 = 15 16 – 1 = 15 16 – 1 = 15
broj mutanata 4 4 3
broj mutacija 2 1 2
učestalost mutacije 4/16 4/16 3/16
stopa mutacije 2/15 1/15 2/15

21
 Izračunavanje stope mutacije

 20 pojedinačnih kultura, svaka nacjepljena s 1000 stanica i uzgajane do

108 stanica
 cjelokupni sadržaj svake pojedinačne kulture nacjepljen na svoju
selektivnu podlogu na kojoj mogu rasti samo mutanti
 broj kolonija na selektivnim podlogama:
1 0 3 0 0 5 0 5 0 6 107 0 0 0 1 0 0 64 0 35

 stopa mutacije (a) izračunava se iz udjela kultura u kojoima se nije dogodila

niti jedna mutacija na temelju Poisson-ove razdiobe
P0 = e-aN pa iz toga slijedi da je a = (-ln P0)/N
(P0 – udio kultura u kojima se nije dogodila niti jedna mutacija; N – broj replikacija)
P0 = 11/20 = 0,55
N = 108 – 1000 = ~108
a = (-ln 0,55)/108 = 5,978 ∙10-9 po replikaciji (diobi stanice)

Joshua i Esther Lederberg (1952)

• Bakterija E. coli osjetljiva je na fag T1

• TonS

E.coli podloga s fagom T1

107 • Mali udio bakterija može postati

kolonija rezistentan (TonR)
• zbog kontakta s fagom?
• prije kontakta s fagom?

• Bakterije su postale rezistentne prije

kontakta s fagom
• mutacije nastaju slučajno tijekom
diobe stanice

22