svibanj, 2021.

SKRIPTA IZ GENETIKE 2
 svibanj, 2021.

GENSKE MUTACIJE I MEHANIZMI POPRAVKA

MUTACIJA
MUTACIJE
 Trajne i nasljedne promjene slijeda nukelotida u molekuli DNA
 Kromosomske mutacije (uočljive mikroskopom)
o Promjene brooja kromosoma (aneuploideije, poliploidije)
o Promjene u strukturi kromosoma (inverzije, translokacije)
 Genske mutacije-promjene u samo jednom nuklotidu (točkaste) ili u manjem
broju nukleotida
o Supstitucije
o Delecije
o Adicije
Točkaste mutcije (eng. point mutations) mogu nastati :
o Spontano (replikacijske rašlje ili spontana oštećenja baza)
o Inducirano (kemijski mutageni)
Točkaste mutacije mogu nastati u :
 Generativne stanice prenose na potomstvo (ozračivanje prije spolne
zrelosti)
 Somatske stanice Mogu rezultirati kimerizmom (genskim
mozaicizmom) npr. Raznobojna šarenica oka, nasumična X inaktivacija,
kimere
Kako nastaje mozaicizam?
 Npr. Boja oči
 Ako je osoba heterozigot i ako dodje do disfuncije alela B (smeđe oči)
nastaje homozigotna recesivna stanice bb
 Ako se to dogodi ranije u razvoju ta će se stanica umnožiti sovoljno puta da
se u oku vidi šarenicu sa plavim sektorom

1. Supstitucija
 Zamjena jednog nukleotidnog para
 svibanj, 2021.

 Kroz diobu se te promjene se fiksiraju i nasljeđuju

 Tranzicija  zamjena purina drugim purinom tj. pirimidina pirimidinom
o Promjena adenina tako da kao svoj komplementarni par veže
citozin umjesto timina i nakon replikacije se veže gvanin kao
fiksno nasljeđeni nukleotid na toj poziciji
 Transferzija  zamjena purina piridinom i/ili pirimidina purinom
Ishodi točkastih mutacija
 Supstitucija
1. Istoznačna (samesense) mutacija ili tiha (silent) mutacija
2. Pogrešna mutacija (missense)-dovosi do promjene kiseline
3. Nonsense mutacija – uvodi preuranjeni STOP kodon, preuranjena
terminacija
 Adicija i delecija
o Pomak okvira čitanja  frameshift
o Indel (insertion and deletion)
o Proflavin uzrokuje adiciju i deleciju

Srpasta anemija : Glu (GAG)  Val (GTG) – supstitucija

Southern(DNA), Northern(RNA) i Werstern (proteini) hibidizacija (blot je najlonsa
membrana)
1. razdvajanje molekula (DNA, RNA ili proteina) po veličini u električnom
polju (gel elektroforezom)
2. prebacivanje makromolekula na najlonsku membranu (blot) kapilarno,
tlakom ili elektroforezom
3. hibridizacija jednolančanom DNA probom koja je spacifična za gen,
transkript ili protein od interesa, sondom  Southern & Northern; ili
antitijelom Western
 svibanj, 2021.

Možemo dobiti transkript drukcije duzine nego divlji tip

 introni
 ako se napravi mutacije prije splice mjesta npr. Tranzicija
 spliceosom greskom tretira tu mutaciju kao splice mjesto
 b) se događa transverzija
 egzon ce biti duzi ili kraci
 svibanj, 2021.

Oštećenja baza
 događaju se spontano
1. depurinacija baza
-nukleotid izgubi svoju bazu jer gikozidna veza između dušićne baze i
droksiriboze puca
-stvara se apurinsko/ pirimidinsko mjesto ili abazično mjesto
-mogu se popraviti, ali ako se prije popravka dogodi replikacija nasuprot
apurinskog mjesta se ugrđuje bilo koji od nuklotida, najčešće adenin

2. deaminacija baza
-2 mogućnosti
-deaminacija citozina aminoskupina se uklanja i dobiva se keto skupina
uracil
-DNA polimeraza nasuprot uracila se ugrađuje adenin, onda se u 2.
replikaciji ugrađuje timin 2 CIKLUSA REPLIKACIJE
- deaminacija adenina  hipoksantin ponaša se u smislu vodikovih veza kao
gvanin  AT par se prevodi u GC par 2 CIKLUSA REPLIKACIJE

3. oksidativna oštećenja
-uzrokuju reaktivne vrste kisika tj. _slobodni radikali (ROS- eng. reactive
oxigen species): O2.- (superoksid ion) i H2O2 (vodikov peroksid)
-timin i timidin glikol
- derivat gvanina se ponaša kao da je timin događaju se transverziije

4. tautomeri
-rijetke alternativne forme standardnih baza
-rijeđe imaju drugačija svojstva sparivanja sa komplementarnim bazama
-A i C češće imaju AMINO , a rijeđe IMINO formu
-G i T češće imaju KETO, a rijeđe ENOLNU formu
-IMINO A se sparuje s C, a C s G
-ENOLNI G se sparuje s C, a T s G

5. replikacijsko proklizavanje
-imamo replikaciju, ali je supstrat repetitivan dinuklotidna ponavljanjađ
-takve sekvence su nezodne
-ako polimeraza proklizi ugrađuje se nukleotid viška
 svibanj, 2021.

-ovaj tip pogreške se događa u mikrosatelitna ponavljanja

-DNA finger printing
-određivanje identiteta osobe-19 lokusa
-određivanje sorti

 inducirane mutacije
o nastaju kao posjedica neuspjesnog popravka oštećenja izazvanim
različitim fizikalnim ili kemijskim mutagenima
1. zračenje
-ionizirajuće  jača: X-zračenje, radioaktivno i kozmičko zračenje
-velika prodornost: uzrokuje dvolančane lomove DNA
- neionizirajuće  UV zračenje, manje je prodorno: uzrokuje pirimidinske
dimere

 Primjena zračenja je velika u oplemenjivanju biljaka

 Točkaste mutacije uzrokuju : X i gama zrake, etilmetansulfonat, 5-
bromourail, 2-aminopurin
 Atomic fruits  crveni grejt, patuljsta papaja, kruska tporna na bolesti, jeam
tolerntan na slana tla
2. Kemijski mutageni
a) Alkilirajući agensi : supstitucije ili apurinska mjesta
N-metil-N-nitrozourea
etilmetansulfonat (EMS)
- etiletansulfonat
- nitrozogvanidin
b) Analozi baza : uzrokuju supstitucije
5-bromouracil  analog pirimidina - 2-
aminopurin  analog purina

EMS
 Etilnu skupinu dodaje na dušićne baze
 Omiljeni target gvanin i ponaša se kao adenin
 svibanj, 2021.

 2 cillusa replikaije GC u AT
Na Arabidopsisu – sjeme mutageniziramo sa EMSom
 Nasadimo iz i dobijemo M1 generaciju koja nema mutaciju usvim
staniama
 Biljak j ekimerna u pogledu mutacija
 Samooplodna stanice ce imati određeni obrazac točkastih mutacija
 M2 generacija u određenim djelovima u genomu imamo
homozigotne mutacije  ako su mutacije recesivne vidi se fenotip
 Da bismo bili sigurni da je taj fenotip stabilan tj da je bas od te
mutacije M3 generacija bi opet trebala imat opet te mutacije
 M3 biljk ima jos niz mutacija moramo se rijesit vih ostalih to se
radi s povratnimm krizanje  genetičko ispiranje
 Na kraju dobije mo mutant za taj lokus
c) Nitritna kiselina
 HNO2
 Deaminacije C A G
d) Akridinske boje
 Ugrađuju se iumeđu parova baza u lanncu
 Insercije i delecije  frameshift
 Akridin narančasta
 Proflavin
 Etidij(ev)-bromid (EtBr)- liječenje tripanosomijaza kod domaćih zivina
3. Biološki mutageni
 Insercijska mutageneza
a) Nasumična ugradnja T-DNA u genom
 Moze se saznati za razliku od kemijskih saznati di se ugradila
 Radi se da kod sekvenciranih genoma tako da ih se saturira tj. moze se
dobiti kolekciju mutanata di je mutiran svaki gen te vrste
 naručivanje sjemenki mutanta iz repozitorija
 potvrda mjesta ugradnje T-DNA (PCR)
 proučavanje fenotipa nastalog ugradnjom T-DNA
Reverse genetics”- prvo imamo informaciju o genu, a tek onda istražujemo
fenotip koji nastaje njegovom mutacijom
Klasičan genetički pristup (za usporedbu):
 svibanj, 2021.

„Forward genetics”- prvo proučavamo fenotip dobiven mutagenezom, a tek

onda istražujemo koji je gen mutiran.
 Potvrđivanje mjesta ugradnje T-DNA
 Najčešće su biljke heterozigotne za inserciju tj. hemizigotne
 Uz same sjemenke dobije se i sekvencu gdje se T-DNA prelazi u
gensmsku DNA tj. junction  mjesto diranja T-DNA i genoma
 Onda se dizarnijaju primeri
 Dobijete primer koji j ekomplementaran za T-DNA, a dizajnira se
primer koji je uzvodno od T-DNA koji je karakterističan za gen u
kojeg se T-DNA ugradila
 to će umnožiti mutirani alel
 kod alela divlejg tipa koristi se pirmer 3 u kombi s primerom 1 kako
bi dobili amplikon za funkcijonalni alel
 zasto ne koristimo kombinaciju 1 i 3  udaljenost je prevelika
 za svaku liniju rade se ove 2 PCR reakcije nanosite ih na istu stazu i
npr. 1. dobije se amplikon za 1 i 3  to znači da je linija divlji tip i da
nema kopiju mutranog alela
 2. ako se vidi 2 fragmesta  1 divlji : 1 mutant hetero/ hemi zigot
koji moze i nemora imat fenotip
 3. samo s primerom 2 i 3 ta jednika je homozigotna, postoje 2 alela s
T-DNA, najcesce ima fenotip


Forward (klasična) & reverse (nakon sekvenciranja organizma) genetika
 Klasična : krecemo s fenotipom I zelimo odrediti gen koji je odgovoran za
taj genotip
o Mutageneza -_> fenotip  gen / sekvenca
o Lociranje gena pomoću molekularnih markera
 svibanj, 2021.

oImamo mutanta kojeg smo dobili nasumičnom mutagenezom

ohit5 ponaša se normalno na temp. 22°C
omutacija koja uzrokuje da biljke uginu na 37°C
oonda se radi genetičko kartiranje  dolazimo do gena koji je
odgovrsn
o gen je zapravo beta podjedinica farneziltransferaze
 Reverzna genetika
o imamo neku kolekciju insercijskih mutanata npr. T-DNA ili
transpozonskih linija
o mozemo izabrati gen nepoznate funkcije
o sekvenca / gen  fenotip  funkcija
o PCR potveđuje se da je homozigot, pogleda se fenotip
o Povezuje se funkcija
o npr. mlo2(mildew resistance locus)  2 insercije u genu
o 2-5 nas zanima potvrđuje se mjesto ugradnje
o Divlji tip je osjetljiv na pepelnicu , mutant je otporan
Kao i za Arabidopsis postoji kolekcija mutanata za druge vrste
1. Branchypodium distachyon
 34.310 gena
 Broj T-DNA linija u kolekciji : 23.649
 Jedinstvena mjesta insercije TDNA : 25.977
2. . Medicago truncatula (buretasta lucerna)
 kolekcija ima  21.700 linija s ukupno 500.000 Tnt1 insercija
 kolekcija mutanata dobivena insercijskom mutagenezom s
retrotranspozonom duhana Tnt1
 transformacija kalusa lucerne s T-DNA koja nosi aktivni Tnt1
 kolekcija insercijskih mutnata „pokriva” 90% gena lucerne
 Tbt je aktivan transpozon

3. Knock-out miševi
 Mutacija u odabranom genu
 Prije od biljnih su nastali
 Gene targeting u biljaka slabo funkcionira
 svibanj, 2021.

 Mišje stanice se precizno modificiraju

POPRAVAK DNA
1. Izravni / direktin popravak (fotoreaktivacija)  odnosi se na pirimidinske
dimere
 UV inducira kovalentne veze između ugljika 2 susjedna timina
 Enzim fotolijaza se veže na mutaciju  ne cijepa se fosfodiesterska
veza
 Sustav dijeluje kod prikariota ali i eukariota
 Fotolijaza prepoznje timidinski dimer kao svoj supstrat
 Plava svjetlost kao izvor E cijepa kovalente veze
 Čovjek popravlej te greške Ekcizijskim popravkom
2. Ekcizijski poravak (greške u 1 lancu)
a) Izrezivanje krive baze
 Izrezivanje apurinskog mjesta
 Npr citozin j edeaminacijom preso u uracil
 DAN lgikolijaza prepoznaje mismatch kao supstrat i cijepa vezu
između baze i deoksiriboze nastaje apurinsko mjesto
 To apurinsko mjesto je supstrat za endonukleazu koja cijepa
fofodiestersku vezu
 Onda dolazi sljedeci enzim deoksiribozafosfodiesteraza cijepa i 2
fosfdietersku vezu i tako fali cijeli nukleotid
 DNA polemeraza ugrađuje ukleotid i ligaza koja lijepi nukleotid za
lanac
b) Izrezivanje nukleotida
 2 enzima uvrABC endonukleaza i zvrD hemikaza
 Endonukleaza oko mjesta napravi nasumično fosfodiesterske veze
 Helikaza miše taj dio
 Jednolančani dio koji je ostao nadopunjuje DNA polimeraza i ligaza
c) Izrezivanje krivo sparenih baza
 Mismatch repair
 Krivo sparena baza nakon replikacije
 Stanica prepoznaje kalupe od novih lanaca po tome što su kalupi
metilirani - GATC
 Prema tome se orjentiras ta je tocno a sta krivo
 Enzimi koji sudjeluju su : MutS, MutL, MutU (UvrD), MutH
 svibanj, 2021.

 Kompleks HLS je veze na mjesto krivog sparivanja i pomoću H

podjedinice sijepa fosfodiestersku veze
 Pomoću helikaze i endonukelaze uklanja se jednolančani dio
 Gap se nadopunjuje s DNA pol 1 i ligaze
3. Rekombinacijski poprevak (dvolančani lomovi)
 Uzrokovai ionizirajućim zračenje
 Popravlaj se pomoću homologne sekvence na homolognom kromosomu
 Alternativno se popravlja samo stvaranje sintetir+ziranjem
fosfodiesterskim vezema neprecizan popravak jer se događaju male
adicije i delecije
 Cas9 nkleaza ubaciju na zeljenom mjestu unosi mutaciju i onda se
pomoću ovog alternativog puta ubaciju delcije i adicije
Ames-ov test
 Test za prijesvega kemijske mutagene
 Salmonella koja je auksotrof za his
 Soj ima mutacije u genima za popravak
 Propusnija stijenka
 Krece se od aukotrofa tretira se s mutagenom i biraju se jedinke koje su
postale his+(revertanti)
 Koristi se i ekstrat jetre štakora jetra napravi od nekog metabolita
kancerogeni spoj
 svibanj, 2021.


Bimedicina
 Xeroderma pigmentosum
 Recesivna autosomalna bolest
 Sustav popravka pirimidinskih dimera je disfunkcionalan
 Posljedica: hipersenzitivnost na UV
 Veliki rizik od razvoja mealnoma
 svibanj, 2021.

REGULACIJA EKSPRESIJE GENA U

PROKARIOTA
 Početak transkripcije: vezanje RNA polimeraze na promotor
 Iskljucivo sa sigma kompleksom prepoznaje promotor
 Postoji sigma podjedinica
 Mehanizmi regulacije transskripcije laktoznog, triptofanski i arabinozni
operon
Osnovni modeli:
Pozitivna regulacija ekspresije  postojanje aktivaotra
 Veze se uzvodno od preomotora ili ga djelomično pokriva
 Nulto stanje je on, nakon vezanja imamo početak transktipcije
Negativna regulacija  vezanje represora
 Veze se na dio promotora ili nizvodno od promotora
 Sprečava početak transkripcije
 Da bi doslo do ekspresije represr se mora maknut
 Nulto stanje off
Da bi se aktivator vezao tj. da bi represor disocirao  ligandi(efektori) se vezu na
njih i mjenjaju konformaciju i tako omogućuju dis/asocijaciju
 Aktivator moze biti u aktivnoj i neaktivnoj formi , početno stanje je
isključeno a ciljno je uključeno
 Operonska organzacij više lokusa, strukturni geni se nalaze nizvodno od
promotora
Tipovi ekspresije gena
1. Konstitutivna  za staničen strukture i osnovni metabolizam stalna
2. Inducibilna geni su u bazičnom stanju isključeni , katabolizam šećera,
popravak DNA  poz i neg
3. Represibilna  osnosno stanje gena je aktivno, sinteza nukleotida i
aminokiselina  poz i neg
Negativna inducibilna represija
 Konstitutivna ekspresija represora tj. on je stalno prisutan
 svibanj, 2021.

 U nedostatku liganda se veze za b+vezivno mjesto u regulatoru

 Kada se pojavi ligand za represor mice se i dolazi do ekspresije
 Kada se supstrat potpuno prevede u produkt , nema vise supstrata na poziciji
i ponocno se prekida transkripcija
Pozitivna inducibilna represija
 Na početku se operon ne eksprimira
 Aktivator se tek pojavom supstrata veze na promotor
 Kad se supstraat prevede u produkt aktivator disocira
Negativna represibilna ekspresija
 Sustav u kojem se na početku RNA pol transkribira strukturne gene
 Kada produkt bude u suvisku veze se na sktivno mjesto represora i veze se
na mjesto perona i gasi transkripciju
 Kad se produkt potroši mice se s represora i on disocira s promotora
Pozitivna represibila ekspresija
 Aktivator je aktivan
 U nedostatku tj. bez liganda je vezan na vezivno mjesto
 Transkripcija se događa
 Kada se produkt nadje u suvišku veze se za aktivator i discira i RNA se
znatno slabije veze
 Alternativni šećeri :Kada glukoza nij eprisutna u podlozi postoje razni
operoni za različite šećere
 Operon je skup gena koji imaju zajedničku regulaciju ekspresije
 Promotor ima konsenzus -35 regiju i -10TATA ko e coli
 Operator je mjesto gdje se veže lac represor
 Sam transkript ne počinje odmah nego nesto nizvodnije
 Operator zahvaća sekvence uzvodno i nizvodno od -1


 svibanj, 2021.

Laktozni operon – lac

 laktoza je prirodni induktor / supstrat
 IPTG - isopropil beta-D-1-tiogalaktopiranzid
 oba induktora se mogu vezati na represor laktoznog operona
 lacY laktoza permeaza – membranski protein kroz kojeg laktoza ulazi u
stanicu
 laktoza – glu + gal (beta 14)
 beta galaktozidaza – 1. prevođenje beta (14) veze u beta (16)
glikozidnu vezu Alu laktoza i ona predstavlja induktor, 2. cijepanje na
gal i glu

 galaktozid transacetilaza -štiti od negativnih međuprodukata

metablizma same laktoze
 transkripcijom lac operona nastaje policitronska mRNA
 u nedostatku laktoze u mediju  aktivni represor na koji nije vezan
ligant (alulaktoza)
 u slučaju da je alulaktoza prisutna eže se za represor
 laktozni represor je tetramer
 svibanj, 2021.

Kako je moguće da laktoza uđe u stanicu ako je potreban lacY?

 Neiducirano stanje ipak ima minimalan broj laktoznih transporterau
membrani (lac operon je leaky)
 Kada se u okolišu pojavi laktoza ulazi u stanicu
 Sintetizira se jako puno alu laktozr i strukturnih gena
 I imamo situaaciju di se sva laktoza iz okoliša potroši
Nobelova nagrada 1965.
 Za medicinu i fiziologiju
 Francis Jacob, Jaques Monod, Andre Michel Lwoff
Represor laktoznog operona
 Tetramer
 DNA vezujuća domena – veže operator
 Vezna mjesta za induktor koji veze alulaktozu ili IPTG
Mutanti
 Divlji tip : operon je zatvoren bez induktora, RNA se evže na promotor,
represor na operator
 Da imamo laktorzu ona se veže na mjesto represora, DNA se mjenja

1. Konstitutivni mutant Oc
 Represor se ne moze vezati na operator jer je doslo do promjene
sekvence u operatoru, represor ne prepoznaje
 Stalna ekspresija strukturnih gena-konstitutivna ekspresija
 Kod merozigota je mutacija dominantna Oc>O+
 broj mutacija koje se mogu doboditi je različit, ako se dogodi neka od
njih dobvamo mutirane alele koje označavamo s c
 parcijalni diploid = merozigot O+/Oc
 ekspresiju represora 2 alela koji se jedna veze za operator divljeg tipa
a jedna se ne moze vezati
 operator djeluje in cis = cis-acting

 represor moze biti mutiran u DNA vezujućoj domeni i- ili u djelu

koji veze induktor(laktorzu/alulaktozu)is
2. Konstitutivni mutant I -
 svibanj, 2021.

 Zbog mutacije u DNA vezujcoj regiji  promjena a.k. slijeda u

represoru
 Kod merozigota I+/I- imamo situaciju da su promotor operator i
strukturni geni kod oba alela divljeg tipa
 Represor koji se trankribira s I + lokusa difundira na oba operatora i
omogućava da je ekspresija inducibilna tj. divljeg tipa
 Represor djeluje in trans
3. Konstitutivni mutant I s
 Vezno mjesto za laktozu se promjenilo
 Mutacija u tom slijedu a.k.
 Normalno vezanje za operatora ali ostaje trajno vezan
 Dominantna mutacija kod merozigota Is> I+
 Is mutant ne može rasti na laktozi, samo glukoza
 2 represora : superrepresor se veze na oba operatora , induktor ga ne
moze maknut s operatora
 Ako bi se represor divljeg tipa se moze vezati na oba operatora, kad u
sustavu bude laktoze on disocira, ali se kasnije veze superrepresor i
onda vise ne disocira
 Superrepresor isto dijeluje in trans
F` plazmid
 Ima komponentne laktoznog operaona divljeg tipa osim laZ je mutiran,
nema funkcionalnu beta galaktoozidazu (laktaza)
 Na bakterijakosm kromosomu se opet sustavima sve komponente divljeg
tipa osim sto represor nije funkcionalan
 Funkcionalni se moze vezat na oba p akao da je rijec o divljem tipu
 Oc i O+ & lacZ- i lacZ+ što znači da se stvaraju represori divljeg tipa no oni
se nece moci vezati na Oc koji se nalazi ispred funkcionalnog lscZ+ imamo
konstitutivnu represiju
 3. superrepsor li se stavra i obični- reprsor je prvotno vezan ali se kad dodje
laktoza disocira
 U kombinaciji Oc i Is imat cemo dominantno
 Superrepresor se ne moze vezat na konstitutivni operaotr i imat cemo
konsitutivnu represiju sustava bez obzira dla je prisutna laktoza ili ne
pangenom
 svibanj, 2021.

 Ako uzmemo vise sojeva necemo imati istu sekvencu na operonu

 Ustanovilo se da represor kao teramer moze vezati sa 2 podjedinice jedno
operatrsko a s druge dvoje drugo operatosko mjesto
 Varijanta o1 i o2 stvara izbočenje DNA lanca, o3 i o1 stvara se omča
 U toj petlji se nalaze konsenzus sekvence -1i -35 i to vise nije dostupno za
RNA pol
 CAP protein koji je vezan unutar petlje za promotorsko mjesto
 Kad se e ccoli da glu i vise laktoze do kraja uvijek koristi glukozu i u srzi je
to zbog CAP
 Glukoza koči katabolizam laktoze preko CAP-a
 Kada imamo visko konc. glu onda adenilat ciklaza nije aktivan
 Adenilac ciklaza i cAMP bitni su je se cAMP se veze na CAP
 U tom kompleksu postaje transkripcijski faktor koji se veze na promotor
operon

cAMP-CAP kompleks je transkripcijski faktor

• CAP djeluje na vise od 100 promotora
• CAP = eng. Catabolite Activator Protein (aktivator
katabolizma laktoze)
 svibanj, 2021.

• sinonim za CAP je i CRP: eng. cAMP receptor protein

• CAP aktivira transkripciju sa > 100 promotora
- da bi vezao DNA CAP mora biti u kompleksu s cAMP
- na različitim promotorima ne djeluje uvijek na isti način
- može djelovati kao aktivator i kao represor transkripcije
• CRP se ne veze na mjesto RNA pol nego do-RNA je efektivna
• Da bi imali ekspresiju nesmije bit glukoze
• CRP se veze kao posljedica nedostatka glukoze
Na koji način CAP regulia laktozni operon
• Ako nema glu ni lac onda ce se CAP vezanti I RNA pol isto ali fizicki ce
bit sprijecena jer postoji repressor
• Ako ima pun olac I glu, nema represora, RNA plo ce se s malim
afinitetomveze na promotor
• Ako imamo glu a ne lac I dalje imamo inhibiciju jer je repressor I dalje
vezan na operator

• Samo vezanje CAP uzokuje savijanje DNA molekule pospješuje RNA pol
vezanje
Regije na koje se veze RNA pol i represor
• Tzv. Footprint eksperientu
 svibanj, 2021.

• Nespecifična endonukleaza , što duže imate inkubaciju DNA je na sve manje

fragmente slomljena
• Pomješana DNA i perotein(represor / RNA pol)
• Onda je dodana Dnaza
• U 1. stazi imamo samo DNAzu bez regulatornog proteina
• 3. In viroreakcija s represorom , dio je zaštećen od djelovanaj DNA ze
• U 2. jos vise zanticen

•
• Ako se gleda sekvence tza koje se veze represor koji je tetramer
• 2 podjedinice vezu 1 operatorsko mjeto
• Ono je zapravo simetrično, os ismetrije je GC par baaz lijevo i desto se vezu
podjedinice
• Riječ je o inverznim repeticijama
• Te sekvece nisu potpuno iste—reverzni komplement
• Sekvenca gledana u zrcalu
• To je sve u divljem tipu
• Kod mutanata je vec opisana mutacije prethodno kad se represor ne moze
vezati na operaotor
lacP prmotor : P- mutanti
 svibanj, 2021.

• Promjene slijeda nukleotida u lokusu lac P

• Promotorska regija
• 2 kategorije: blagi efekt žuto, smeđe puno jače

•
EcoCyc E.coli Database: laktorzi operon
• Okruženje laktoznog operona
• Orjentacija suprotno orjentirani geni
• Geni u linearnom zapisu buduci da znamo da se geni prepisuju 53 crtano
• Ukosnica rho enovisna terminacija
• Lac operon sa sigma 70 podjedinicm
• Terminacija je rho neovisna
Upotreba Lac operona u labosu: plavo-bijela selekcija
• Radi se smutantom u lacZ genu
• 1 delecija uzrokuje nedostatak 30 ak ak
• Nepotpuni lacZ se zove omegapodjedinica
• Kad dodamo IPTG koji se veze za represor, ali nema aktivne beta
galktozidaze
• Alfa podjedinica reagira s omega i imaju svoju katalitičku funkciju
• Supstrat mora bit kromogeni da mi mi vidili  xGal
• Beta galaktozidaza  tetramer
• Omega i alfa podjedinice mogu međusobno samo dimere stavrat ali kad se
doda alfa dolazi do tetramera lataza  plavo obojenje funkcionalni
enzim
 svibanj, 2021.

•
• Plavo – bijela selekcija
o Plazmid koji ima alfapdjedinicu alfa betagalaktozidaze
o Ampicilinski marker
o U jednoj varijanti nema induktor
o xGAl je supstrat
o imat ce induktor i supstrat
o ako ima ampicilina rastu samo lave kolonije

Arabinozni operon
• dvostruka uloga regulatora AraC
 svibanj, 2021.

• strukturni geni : ara BAD prevode arabinozu i ksilulozu

• regulatorna regija od 2 operatra ara o i I
• regulatorni protein Ara C
• alternativni izvor ugljika kad nema glukoze
• kad nema arabinoze on djeluje kao represor
• veze se na Ara i i O
• kad doadmo arabinozu ona se veze na jendu od ta 2 mjesta
• araC ostaje vezan za AraI operator ali disocira sa AraO operaotra
• da bi doslo do ekspresije treba stanica biti gladna
• arabisnozni operon veze CAP u kompleksu s cAMPom
• detaljnije : nije riječ sam oo jednoj mol AraC nego imamo 2 molekule
• jedan je vezan na Ara I operator drugi je vezan na Ara O operator i oni
međusobno reagiaju pomoću interakcijske domene
• ona veze i arabinozu
• CAP isto prikazan
• Kad se poajvi Arabinoza i nema vise interakcije pa se struktura otvara
• CAP se veze na svoje veze promovira vezanje RNA pol

• Zanimljiv u odnosu na lac operon

• Ovdje se regulatori i strukturni geni prepisuju u suprotnim smjerovima
• Nisu na istom lancu
 svibanj, 2021.

• Među koraci u metabolizmu arabinoze

• Indukcija arabinoznog operona
• Cijeli arabinozni opero je na plazmidu
• Taj plazmid se sastoji od AraC koji se konstitutivno eksprimira i momo
promotor divljeg tipa a umjesto strukturnih gen aimamo fuloresventni
protein
• Ekspreiment se radi da se kombinira ara i glu
• Ako ima glu nema fluorescencije
Trp operon
• Sastoji se od : Strukturni geni kojih ima vise koji prevode korizmat do
triptofana  konstitutivno se eksprimira trp
• Negativna represibilana ekspresija
• Kako osjeca da ga ima previse?
• Imamo regulatornu regiju koj posjeduje L leader i A attenuator dio (od 5
prema tri je prvo L pa A)
• Klasična regulacija putem gena represora i triptofana kao regulatora
• Dvojaki sustav  preko represora i preko ovih sekvenci

1. Represor regulacija
a) Niska razina trp, represor se ne veže
b) Kad ima trp, reperesor se veže na operator, ekspresija je spriječena
 Negativno-represibilna ekspresija
 svibanj, 2021.

2. Regulacija trp ekspresije atenuacijom

 Slijed trpL je leading peptide
 Atenuacijska sekvenca karakterističnan alternatvna sturuktura
sekundarnog transkripta
 Početak transkripcije na 5`- rozo
 Leader peptid kreće s metioninom i završava stopom
 Ima 2 trp kodona uzastopce koji je bitan podatak kada nema trp u
stanici
 Ukosnica 1 i 2 imaju homologne parove
 One kontroliraju sam nastavak ili zaustavljanje transkripcije
 Na kraju atenuatorskog slijeda imamo regiju bogatu uridinom koji
olakšava disocijaciju transkripta s DNA što je defakto terminacijska
sekvenca
 1. a.k. od 1. gena u biosintezi trpE
 Obzirom na poziciju metionin 5` UTR je sve to prikazano

 Alternativne sekundarne strukture

o Ako imamo puno triptofana događa se stvaranje vodikovih veza
između regija 3 i 4 pričemu se stavara ukosnica, kasnije između 1 i 2
o Uzrokuju terminaciju transkripcije jer triptofana ikma dovoljno
 svibanj, 2021.

o Da ga nema tj. malo dolazi do formiranja vodikovih veza između

regija 2 i 3, i ukosnica omogućava dase transkripcija nastavlja jer je
trp potreban stanici

NEMA TRIPTOFANA
a) Malo triptofana, počinje transtripcija s RNA pol, transkribira 1 i 2
b) U tijrku transktripcije regija 2 kreće translacija regije 1 tj. leader peptida
c) Transkripcija se nastavlja i ribosom dolazi do mjesta u leading sekvenci koja
ima 2 triptofanska kodona i tu staje jer nemože ugraditi triptofan
d) Ta stanka omogućava da se transkripcija nastavi, sprečava interakciju regije
1 i 2 , formira se omča 2 i 3 , dobiva se potpuni transkript i onda ribosom
može krenuti sa sintezom 1. a.k u trpE lokusu
 svibanj, 2021.

IMA TRIPTOFANA
a) Kreće transkipcija
b) Kreće 2 i translacija 1
c) Nastavlja kad dodje do 2 trpa i fizički pokriva 2
d) Interakcija između 3 i 4 i u kombi s polU nakon regij 4 dolazi do terminacije
transkripcije, RNA Pol disocira i ne prepisuje se strukturni gen
 svibanj, 2021.

 Mutanti ne mogu stvaratu sekundarne strukture jer se gube vodikove veze

 Ako u regiji 3i 4 bude mutacija ukosnica se ne može fomirati čak i akda
triptofana ima
 Posljedica trp u suvišku  biotehnilogija
e.coli baza
 Trp operon , trpL i ztvodno se nalazi trpR
Ovakva regulacija re koristi i za druge aminokiseline
 Npr. Phe i His

 Osim operona postoje 2 pojma

 Operon  regulon  modulon
 Veće razine regulatorne ekspresije
 Područja sistemske biologije urjecaj jednog gena na drugi
 Modulon su oni koji imaju najvise poveznica s drugim točkama, reguloni
nešto manje


 svibanj, 2021.

Regulon
 SOS ogovor
 Heat-shock odgovor
Modulon
 Skupina koja je regulirana CAP proteinom
 Induktor  niska konc.glukoze cAMP
Post-transkripcija regulacija  kod prokariota
Antisense RNA
 ompF kodira za membranski kanal vanjske membrane
 kad je u okolišu niska osmolarnost ne smeta im ulazak vode
 viska osmolarnost problem stanica bi gubila vodu
 mRNA ovog lokusa regulirana drugim transkriptom koji je u antisense
orjentaciji s okusom micF i sprecava da se rivosom veze na transkript
 bez obzira na osmolarnost omp se konstitutivno transkribira
 ali u uvijetima niske osmolarnosti se normalno translatira i dobivamo memb.
Poru
 u visokoj osmolarnosti događa se interakcija
 micF i ompF su daleko u genomu
Riboprekidači / roboswitches
 4% bakt gena
 Interakcija metabolita i sekundarne strukture transkriptaž
 U slučau da nemamo vitamina B1 njegov transkript poprima određene
sekundarne strukture  stvara se antiterminacijska ukosnica
 Kad ga ima B1 u suvišku onda on stupa s transkriptima pa se formira
teminatorska struktura koja sprečava završetak transkripcije i time ne
sintetiziraju biosintetski proteini iza vitamin B1
 Ovo je na razini transkripcije regulacija

2.primjer
 svibanj, 2021.

 Riboswitches se obično nalaze na 5UTRu i opcenito imaju bgatu sekundarnu

RNA strukturu
 Kad ima dosta B12 onda od regulatornih preoteina stupanje u interakciju s
transkriptom i pomaže transkriptu da formira sekundarnu strukturu koja
omogućuje vezanje ribosoma, U nedotatku B12 ostvaruje se alterntivna sek.
Struktura i translacija se mpže dogoditi
3.primjer
 Sigma podjedinice 32
 U kompleksu s RNA pol
 RNA termometar kod trenskripcije hest shock proteina
 Ekspresija sigma pod je regulirana viskom temp. I to 2° strukturomnjenog
vlastitog transkripta
 5UTR za sigma32 ima ukosnicu GC parovima baza i denaturira se na višim
temp
 Kad je niska temp. Je u sekundarnoj strukturi i vodikovim vezama se skriva
vezno mejsto za ribosom


 Autokatailitičko djelovanje transkripta kada se ponaša kao ribozim
 Imamo glmS gen  glutamin-6-fosfat amidotransferazi
 Njen transkript poprima 2°strukturu ne sprecava uspjesnu translaciju
 Produkt glukozamin-6-fosfat
 Konači produkt enzima se veže na transkript i to vezaanje mjenja
2°strukturu
 svibanj, 2021.

 I onda sam transkrip sebe ciijpa

Regulacija lizogenog ciklusa lamda faga

 Genom lampda faga je linearna u njegovoj glavi
 Kad uđe u E.coli se cirkularizira
 Lizogeni cikuls geni na lijevoj strani, litiči na desnoj
 cro i cI represor
 svibanj, 2021.

 ekspresijom lamda repreosra promoira se lizgeni ciklus

 afinitet za represore nije jedna
HTH domena
 veze DNA
zink prsti
 Ulaze u ontakt stupa uinterakciju s velikim utorom
Leucinski zatvarac
 Leucinski dimer
 Di je puno elucina tu se događa interakcija
Represor lalktorznog operona
 HTH domena koja prepoznaje operator
 svibanj, 2021.

REGULACIJA EKSPRESIJE GENA U

EUKARIOTA
 Skok u budućnost
 Časopis nucleic acid research
 U kontekstu istrazivanja visoke protočnosti mogu se pregledati baze
podataka
 Regulacija gena se zasniva na činjenici da imamo veliki broj gena
 U datom tkivu, razvojnoj fazi su samo neki geni aktivni
 Diferenccijalna ekspresija gena
 To regulira okoliš, točke razvoja i genetička uvjetovanost

 Kao i kod prokarita imamo transkrripcijeke faktore

 Ali ovdje imamo i kromatinski kontekst definiran nukleosomima tj. na koji
način pakiraju DNA
 Molekula DNA moze biti metilirana i to onda definira
 Alternativno prekrajanje
 RNA editing
 RNA molekule osim intemedijer ili u ribosomima postoje i one koje
kontroliraju ekspresiju gena , utječu na mRNA stabilnost
 Imamo određeme kovalentne modifikacije proteina koje imaju utjecaju na
funkciju i fenotip
Regulatorni elementi eukariotke ekspresije
 Promorori – mjesta uzvodno o dsekvence
 Dodatne sekvence DNA fizički udaljenije
 Cis acting elelmenti koji bitni za kontrolu ekspresije
 Trans acting odnosi se na trp. Faktore koji se eksprijmiraju na jednom
djielu genoma i difundiraju do mjesta djelovanja tj. regulatorne sekvenca
Konsenzus sekvence u promotoru
 Uzvodno od pocetka transkripcije TATA box, ..
 Ako zelim oistraziti vaznost tih elemenata uvodimo točkaste mutaciije
 Ako nas zanimju promotorske sekvence koje su najbliže +1
 svibanj, 2021.

 Kada se dodje do regulatornih elemenata oni ne toleriraju promjenu

sekvence
 Imamo pad ekspresije <
 Neke pozicije nisu negativno mutirane  imamo pojačana rad
Terminologija ekspresije
 Generalni transpripcijski faktori  2D (okosnica, sadrži TATA
box binding proteine)
 Ti transkripcijski faktori su u kompleksu s medijtorom koji opet
veliki kompleks
 Grupa faktora koji su fizicki vezani za osnovni promotor stupaju u
interakciju s proteinima koji su fizicki udajeni aktivatori/
represor
 Oni su isto vezani na neku DNA
 Aktivatori na enhencers (cis djelujuće sekvencije)
 Represori na silencere
 Bazično stanje ekspresije  curenje ekspresije
 Bitno je da nakon što se aktivatori vezu na osnoven faktore
pojačava se regulacija upregulation
 Smanjenje trenskripcije dowm regulation
 Regulatorna sekvenca se nalazi daleko od osnovnog promotora, ali
oni tupaju međusobno u kontakt
 Kad aktivatori i ekspresori imaju isto mjesto vezanja onda njihova
konc. određue razinu vezanja
 Pojačivači i uišivači se mogu nalaziti uzvodno i nizvodno od
samog gena kojeg reguliraju
 Kompeticija aktivatora i represora u vis+še načina
o Kad se vežu na zajednički domenu
o Bazalni proteini su osnovni transkripcijski faktori ili
medijator
o 2. kategorija kad aktivator ima DNA vezuču domenu
međutim postoji represor koji prepoznauje RNA vezuću
regiju i sprecava vezanje aktvatoraa
o Mnogi aktivatori imajju aktivacijsku domenu koja je
potrebna za veznanje za bazalni preotin
 svibanj, 2021.

o Ako se represor veze za takvu domenu , moze se vezat za

DNA ,ali se na veze na generalnu transkripcijsku mašineriju
p ane moze nista

 Dvije uloge aktivatora

o Aktivator se veže za pojačivać preko medijatoa se veže za
transkripcijesk elementa
o Ili kad se enhacer veze faktore nužne ze relaksaciju DNA i time
promociju transkripcije
 Dvije uloge represora
o Veže se na pojačiva i spreči vezanje aktivatora
o Ili on služi kao mjesto vezanja korepresora i time promovira vise
stupnjeve kondenzacije kromatina
svibanj, 2021.
 svibanj, 2021.

Eukariotska transkripcija
 RNA polimeraza u kompleksu s generalnim transkripcijskim faktorima
(GTF)
 2 aktivacijska kompelksa : medijator i SAGA
 Mediator- posreduje u interakciji RNA polimeraze II i aktivatora
 SAGA- utječe na strukturu kromatina („otvara” kromatin)

 Skupina trans faktora koji uključuje TBP (TATA box binding protein)i
TAF (TATA box asociated factors) i RNA pol II uvijek potiču ekspresiju
ali u niskoj razini
 Kad se ppojavi aktiacijski protein potiče ekspresiju
 Mediator i SAGA su kompleksi trns faktora?
 svibanj, 2021.


 Transkripcijski faktori imaju domene za cinkove prste, helix-loop-helix,
leucinski zarvarače
 Ako se nađu te domene u nekoj sekvenciji onda se moze zaključiti da je
riječ o potencijealnom trans faktoru
Još jedna razina regulacije
 Ligand
 Metabolit s emže vezati na aktivator / represor

 Kod nekih vezanje za DNA događa se kao posljedica vezanje homo ili
heterodimera transkripcijskih faktora
 Ekspresija amonomeramoze bit podešena

 Kako će se identificirati pojačivač /aktivator kad imamo

sekvencirani genom?
 svibanj, 2021.

o Analiza sekvenci
o Ponavljanja
o Regulatorne regije
o Sekvence koje su nekodirajuće kod srodnih vrsta su slične
 kandidati za regulatorne sekvence
o Uzmemo regulatornu sekvencu za koju mislimo da
regulatorna i kloniramo je ispred GFP-a i imamo određeno
razinu ekspresije
o Ciljanom mutagenezom u regulatornoj regiji možemo
mjeriti pad ekspresije
o Ako regulatorna regija nije zapravo to mutacije neće utjecati
an ekspresiju reporter gena
o Ako to nije regulatorna ekspresija GFPa nece bit velika
Identifikacija pojačivaća i aktivatora (sekvec. genom)
 Mutanti sa smanjenom ekspresijo reporter gena  mogući geni
kandidati za aktivatore
 Traže se trans regulatorne sekvence
 Sustav nam se sastoji od stanica divljeg tipa i dodan je plazmid
 Mozemo ocitati jačinu GFPa u divljem tipu
 Mutant nema aktivan kedan aktivator pa bi ekspresija trebala biti
smanjena
 Pad ekspresije bi vidjeli jednako za crveni i plavi mutirani
 Ako bi mutanti bili nevezan iza anhancere nebi imali slabiju GFP
 Ako sva 3 smanjuju ekpresiju mogu se raditi kombinacije
„Lov“ na pojačivačke sekvence u genomima
 Ideja lova je da T-DNA konstrukt ubacimo nasumično u genom
 U blizini nekog mjesta insercija bi trebala biti pojačivačka sekvenca
 Detektiramo je pomoću reporter gena – beta -glukuronidaza
 lacZ gen
 indingo
 Gus ima nepotpuni promotor virusa mozaika cvjetače
 Ekspresije nema ili je minimalna
 svibanj, 2021.

 Ako se taj konstrukt ugradi pored nekog pojačivača on će se eksprimirati

pojačano
 Sekvenciranje na mjestu ugranje ce nam otkriti koje su cis regulatorne
sekvence koje nas zanimaju
Gene traps
 Zamka koja hvata pojačivače
 Naš konstrukt se negdje nasumično ugradio
 Nizvodno od gena na slici ali mogo je i gore?
 Enhances promovira ekspresiju oba položaja promotora
 Plavo obojenje u biljci  sekvenciranje uzvodno i nizvodno od T-Dna
Varijante c i d
 Reporter gen nema promotorsku sekvencu niti minimalnu pa je njegova
ekspresija moguća samo ugradnjom u genom
 Reporete gen ima SA sekvencu – dovođenje reportera s SA mjestom
omogućuje mu altenativni spliceing gdje se to događa između SD i SA
mjesta reporter postaje dio prvog egzona

 Geni uključeni u starenje

 svibanj, 2021.

 Vidimo da se taj gen pali tek kasno u razvoju biljnih organa

 Eksprimiraju se samo u nekim organima
 Eksprimiraju se u korijenu, gen pored kojega se ugradio Gas vidimo
plavo

Kvasac : eukariotska E.coli

 1996. sekvencirani genom kvasca
 Regulacija ekspresije gena – katabolizam galaktoze
 Strukturni geni u ovom sustavu koji se kod eukariota ne naziva
operon , kroz nekoliko koraka daju glukozau 6 fosfat
 Reulatorni geni  transkripcijski faktori –> Gal3, Gal4, Gal80
Gal2  ulazak
Gal4,80,3  međusobno povezani i utječu na ekspresiju svih
strukturnih gena

 Sustav je razbacan po genomu

 Imamo najviše strukturnih gena na 2
 svibanj, 2021.

 Na 13 je Gal5 , a na 12 je Gal2
 UAS – upstream activaton sequencekod svakog gena
pripadajući pojačivać
 Na njega se veže gal4
 Crvena crtaica 17 parova baza i ponavlja se određeni broj puta
 Nije 100% konzervirana
 Pojačivač je uAS dodaanje galaktoze potiče trankripciju
 Galaktoza je induktor i supstrat
 Sam Gal4 sastoji se od DNA vezujuće domene(prepoznaje
UAS) i aktivacijske domene
 Mutant je otkriven gal4 mutant nije rasto na glukozi
Gal80
 Mutant eksprimira strukturne gene iako galaktoze nema u
sustavu
 Konstitutivna ekspresiju
 Kod WT ide ekspresija jedino ako ima glaktoze, a kkod
gal80 mutanta je isla i bez  represor
 Stalno prisutan
Gal 3
 On čak i kada ima galatoze ne moze eksprimirati gal
gene
 Funkcij avezanje galaktoze i promoviranje ekspreisje
 Gal 3 veze galaktozu mijenja svoju konformaciju i veze
gal80
 svibanj, 2021.

 Interakcija osnovnih trans faktora i medijatora i samog Gal 4 nije moguća jer
gal80 smeta
 To je samo teoretski
 Vezanjem galaktoze na gal3 zapravo gal3 veze gal80 i mice ga s aktivacijske
domene gal4 i onda gal4 moze stupiti u kontakt s mediijatorom i trans
fakrtorima i potaknuti transkripciju
Modularna struktura trans faktora
 dio koji je specifičan za pojačivač i dio koji reagira s medijatorom i
osnovnom trans mašinerijom
 ako imamo reporter gen (laktaza)
 kada je intaktan gal4 on može potaknut ekspresiju s o minimalnog
promotora ili pr ispred lac Z
 kada imamo samo DNA vezucu domenu nemamo ekspresiju
 uvodimo novi transkripcijski faktor lexA -odgovor na DNA štećenja
 ima iato DNA i aktivacijsku domenu
 isto kao i kod gal 4 ako ima samo DNA domenu nema ekspresije
 ako napravimo HIBRID s aktivacijskom domenom od Gal4 i lexA DNA
vežuće domene imamo ekspresiju
 svibanj, 2021.

 razvooj sistema proučavanja proteinskih interakcija  sustav kvašćevih

hibrida –rascijepkamo Gal 4 na 2 dijela na dna vezuči i aktivacijski dio
 napravimo 2 fuzijska proteina
 1. je bait mamac  N teminalno Gal4 , na C terminalno doajemo C
 2. prey – protien koji nas zanima i koji C terminalno ima gal4 terminacijsku
domenu
 Crne crte  interakcija , veze moraju biti čvrste
 Kad se desi interakcija dobiva se funkcionalni Gal 4 i daje ekspresiju gena
 Inače je sustav auksotrofan , pa se stavi gen koji će opet napravit i prototrofa

Kako Gal4 privlači transkripcijsku mašineriju?

 svibanj, 2021.

1. Gal4 veze preko SAGA kompleksa TFIID

2. Gal4 veže RNA pol II preko mediator kompleksa
Zaključno: transkripcijski aktivatori u eukariota se ne vežu direktno za
promotore, nego za udaljenije sekvence i pomažu vezanje transkripcijske
mašinerije na promotor
2.Primjer regulacije ekspresije
- određivanje spola kvasaca
 Mitozom se dijele
 Spore će storiti diploid
 Stresnim uvijetima dolazi do mejoze s dvije alfa i dvije a spore
 U haploidu postoje lokusi koji su specifični za MAT-alf ili za MAT-a
haploid
 Receptori kodirani s STE2 (moze ga kodirati samo MATa) i STE 3
(MATalfa)
 Receptori služe za vezanje feromona -oligopeptida
 MATa sintetizia samo plavi i on se veže samo za receptor MATalfa i
obrnuto
 Kada jedna i druga vezu recipročni feomon zaustavljaj se ciklus i dollazi do
kuzije
 Diploid je karakteerističan je ne eksprimira receptore ni feromone
 Reguliran s 4 vrste regulatornih proteina  MCM1 A1 Alfa 1 Alfa2
Haploid MAT alfa
 Eksprimiranje MCM1 koji je prisutan i u ostalim
 2 specifična alfa 2 i 1
 Alfa 2 djeluje kao korepresor ,zaustavlja ekspresiju STE2,receptro kojeg
eksprimira ga MATa
 Alfa 1 djeluje kao aktivator gen za STE3
 Svi drugi geni se konstitutivno eksprimiraju
Diploid
 A1
 Alfa 2 kao i prije
 svibanj, 2021.

 Alfa 1 se ne eksprimira panema STE3  heterodimer A1 Alfa 2 djeluje

kao represor gena tog trans faktora
Haploid MATa
 MCM1 i A1


Kromatin
 Pakiran u različitim stupnjevima
 Nema ekspresije dok je pakiran  mora doći do relaksacije
 Građa kromatina nukelosom se satoji od OKTAMERA
 2 histo od vrtse : 2H3, 2H3B, 2H4 , 2H2A, izvan H1
 11nm  transkripcijski aktivan kromatin
 30nm utišana forma kromatina
 Kromatin je dinamična struktura
 Kromatin je dinamična struktura i promjenom konformacije omogućena
je transkripcija
 Interakcija DNA s histnskim rpoteinima je dinamična
 Kromatiski „profil“ nasljedno nakon mitoze, takvo staanje se za određena
tkiva pamti i replicira
 SWI-SNF kompleks : switch (promjena spola kod kvasaca) i sucrose non
fermenting)
 Kako je otkriven kompleks koji regulira organizaciju kromatina?
 svibanj, 2021.

o Mutagneneza – mutansti koji ne mogu rasti na saharozi kao divlji

tip SNF (snif) mutanti
o Nefunkcionalni mating type system  otkriveno je nekoliko
lokusa mutirani alela  Swi 1,2,3
o Nekoliko alela iz ta 2 različita sistema su jedan te isti gen
o Katabolizam saharoze i sistem spola povezani?
o Protein je dio multiproteinskog kompleksa koji uz utrošak ATP-a
mijenja interakcije DNA i nukleosoma
Swi/Snf modelirajući kompleks
 Omogućuje slideing nukleosoma  oslobađa se dio DNA
 Uklanjanje nukleosoma iz kromatina
 Mogućnost zamjene histona
o H1°, macroH2A, H2A.Z,...  različite funkcije i drugi geni
o H1° kompaktinija građa kromatina
o macroH2A sudjeluje u inaktivaciju X kromosaoma kod ženki
sisavaca
o H2A.Z  blizu pozicija +1
o H2A.X ulaga u poravku DNA
o CenH3 centromerni histon, epigenetička oznaka centromere
o H3.3  oznaka za iotvoreni kromatin koji se trenutno eksprimira
Epigenetika  nasljeđivanje koje ne uključuje promjenu sekvncije DNA
, nositelj promjene fenotipa je promjea pakiranja kromaitna
Alternativne forme histona
 Preko kovalentnih ointerakcija na histonima nejednako
 Histone fold domain HFD
o Vrlo konzervirana domena
o Stupa u interakciju s DNA
 N terminalni rep  nositelj / supstrat za kovalentne promjene i one
imaju utjecaj na kromatinsku strukturu i na ekspresiju gena
o Na repovima se odgađaju modifikacija Lys i Arg 
omogućavaju kovalentno dodavanje acetilne ili metilne
skupine
o Ubikvitinacija lizina
 svibanj, 2021.

o Nukleosom ima 8 repova i svaki moze biti promjenen

Kovalentne modifikacije histonskih repova
 Acetilacija na lizinu
 Metilacija na liz i arg
 Fosforilacija na ser
Hipoteza “histonskog koda”: različiti obrasci modifikacije repova  različito
reguliraju ekspresiju gena
Reijeđe modifikacija
 Ubikvitinacija lys
 SUMOilacija Lys
 ADP ribozilacija -Glu

 Modifikacija na Lys i Arg


Acetilacija Histona
 Lizinski lanac s amino skupninom
 Acetil-CoA a acilnom skupinom
 svibanj, 2021.


 U principu Lys nosi + naboj postaje neutralan
 To utječe an interakciju s DNA
 Rahli kromatinkso pakiranje


 Postoje enzimi koji dodaju acietilnu skupinu  histonska acetil-
transferaza HAT
 Reverzibaian proces, kao što se histonu mogu acilirati mogu se i
deacilirati  deacetilazaHDAC
Metilacija histona
 Na Lys I Arg
 Histonska metiltransferaza HMT  dodaje jednu po jednu metilnu
skupinu na amino
 1 , 2 ili 3skupine moze dodati
 Jedan od faktora trans represora  HP1 prepoznaje metilirani
histon H3 i inducira stvaranje heterokromatina
 Pomoću demetilaza je moguće demetilirati histone
 HP1 represor prepoznje metilirane histone
 Enizimmi koji metiliraju DNA
 svibanj, 2021.

Kako se mogu istreživati interakcije DNA i histona?

 ChIP-Seq  kromosomska imunoprecipitacija i sekvenviranje
 Imamo animalne stanice u kulturi  nakon određenog vremena znaima na
kakvo je stanje kromatina  1. zelimo fiksirati interakciju histona i DNA
dodaje se formaldehid 2. dodaje se DNAza mikrokokalna nukelaza cijepa
onu koja nije u kontaktu s proteinima u uzorku se zeli sekvencirat samo
jedno pomoću antitijela se hvataju to sto želite koje su sekvence vezane
na DN Ase dodaju linkeri i onda se skvencionira
 svibanj, 2021.

 Kod replikacije ispred replikacijskih raslji moramicar histone i onda opet ih

savljat
 Postojeći histone se dijele na pola kod novonastalih lanaca
 Kod diobe se za određenetkivo se te histonske modifikacije kopiraju
Metilacija DNA
 svibanj, 2021.

 Metiliraju se na kratkim CpG otocima (p je fosfat)

 Metilacija na tim pozicijama DNA metil transferaza (DNMT)
 Metilacija CpG otoka zatvaraa kromatin  nema transktipcije
 Izostanak metilacija
 Hemimetilirana metilacija
 Oba citozina u CpG sekvenci metilirana
 Nakon diobe metilacijski obrasci se u ustnaciama kcerima uspostavljaju
kao i kod stanica majke
 Samo emtilacija nije opći eukariotski fenomen (beskralješnjaci i kvasac)
Utjecaj metilacije
 Ukoliko je sam promotor ili regij ono enhancera onda to sprečava
vezanje ativatora
 Ako je CpG otok metiliran prepoznaje se od proteina MeCPs on se
veže i privlači histon deacetilazu koj adodatno deacetilira histone i
pospješuje nastanak heterokromatina
IZOLALTORI
 DNA sekvencija
 Kontrolira susjedne regije genoma koje imaju suprotne kromatinske struktur
 Koegzistencija eu i heterokromatina
 Regije kromatina koja je otvorena i okružena s dvije zatvorene regije
 Omogućuju dappojačivač djeluje na ekspresiju gena a, a ne gena b
 svibanj, 2021.

 Izolatori onemogućuje djelovnaje enhancera 2 na gen a i obrnuto


 Eksperimentalni sustav
o Kandidat sekvenca za izolator
o Na plazmidu imamo sekvencu pojačivaća i lijevo i desno su 2 reporter
gena
o Stanice koje eksprimiraju GFP i rFP pod utjecajem pojačiva
o A vidjeti kao žute
o Izolator stavimo između pojačivaća zelenog i crevenog

 Smatra se da CTCF koji prepoznaje inzulatorsk i sekvencu

 Formira petlje
 Pojačivać ima svoj aktivator koji se veže -> pozivivna regulacija GFP-a, a
RFP nema nikakvu ekspresije RFP-a
 Izokator omogućava da unutar petlje zavraši enhancer i reporter gen
 svibanj, 2021.

Kako možemo dobitii recesivni fenotip iako je WT?

 Crvena boja očiju na sutosomalnom kromosmu
 Dvolančani lom je uzorkovan
 Kuglice označavaju heterokromatinsk i sektor
 Fragement doživljava reorjentaciju za 180°
 Sad se nalazi bliže centromeri
 U pojedinim stanicama heterokromatin ne prelazi granicu lokusa za
rvenuboju očiju i takve stanice su crvene 4međutim u pojedinim stanicama
heterokromatin zahvaća i područje lokusa za boju očiju w+ se ponašao
recesivno
 Sekveence su jednake ali fenotipski izgkeda recesivno
 Ekspresija alela ovisi o kromatinskom kontekstu i prenosi se na stanice kćeri
 Stanje kromatina oko alela za boju očiju nasljđuje
Kako geni kontroliraju širenja heterokromatina?
 Genetička analiza
 Uzme se mutanta i ponovo ga mutirate da se dobije još eksptreminiji fenotip,
mozda se otkrivaju jos koji geni otkriju koji korteoliraju samo nasljeđivanje
epigenetičkih obrazaca
 Supresuorke muracije  nelaze se uu genima koji su potrebni za stvaranj
kromatinskih struktura višeg reda
 svibanj, 2021.

 One bi bile ogovorne za suprsiju i dovedeno je u vezu s heterokromatinskim

proteinom
 H3 metil transferaza (HMTaza)
Impritning
 Za neke lokuse se geni eksprimiraju ovisno potiču li od oca ili od majke
 Oba alela od roditelja su divljeg tipa jedan je epigenetički utišan
 Npr. insulin growth factor2 (Igf2) i H19 kodira dugačku nekodirajuću RNA
 U zigoti se eksprimira majčin H19 i očev igf2
 Pojačivač pozitivno uječe na ekspresiju H19 , a zbog izolatora na kojega je
vezan CTCF protein ovaj enghancer ne potiče ekspresiju lgf2 kod majke
 Kod oca imamo metiliranu regiju oko izolatora pa se tu ne veže CTCF ,
ali i metiliranost zahavaća promotor H19 promotor i on se ne eksprimira
dok zbog nedostatka izolatora i priradajućeg proteina ovaj pojačivać sad
djeluje na igf 2 oca koje se eksprimira
 Ukoliko nemamo mutaija sve okej
 Ako imamo igf mutaciju kod majke isto okej
 Ako se lgf2 mutira kod oca dolati do sindroma Prader Willi sindrom- dlecija
briše očeve alele
 Angelman sindrom gdje doalzi do delecije na majčinokm kromsoomu i igf i
H19
Inaktivacija X kromosoma
 Kompenzacija genetičke doze
 Lokus oddgovoraa : X inaktiacijski centar – Xic
 Stvara dugu nekodirajuću RNA (lncRNA): Xist (X-inactivation specific
transport
 metilacija hostona H3
 hipoacetilacija histona
 metilacija DNA
Rani embrionalni razvoj
 Oba su aktivna
 Na oba se vežu faktori polipotencije
 S oba se transkibira Tsix mRNA molekula koj apromovira ostanak
nekomprimiranog stanja
 svibanj, 2021.

 Nakon toga se vežu protein koji veže izolatore CTCF

 U razvoju se nasumično prebaciju faktori polipotenciju i CTCF na
jedna od 2 x
 Taj X i dalje eksprimira Tsix mRNA
 Ovaj drugi kreće transkribirati exist mRNA
 Transkripcija je intezivna
 Sama RNA privlači enzime koji pospješuju hetheerokromatizaciju
 Privlačenje histonskih deacetilaza i histonskih metilaza koji stavraju
visok stupanj kondenzacije
 U msisu nasljeđivanja epigentičkih ozanak--> brušu se i opet se
usposzavljau nakon stvaranje zigote i prvih dioba
 Jedan od histonskih varijanti  makro H2A karakteristična za histone
unutar heterokromatiniziranog X-a tj Barrovog tijela
 Vezu se histonske metilaze i trensacetilaze koje pospješuju
hetrokromatinizaciju
mRNA stabilnost
 Pomoću mirkoRNA (miRNA) i malom interferencijsom RNA (siRNA)
 I jedna i druga se označavaju s RNA i = RNA interferencija
 Regulairju ekspresiju na temelju komplementarnosti
 miRNA nastaju oz endogenih lokusa, nakon obrade 21-24 nt
 jedan transkript je taget za nekoliko miRNA
 ili jedna moze vezati više transkripata  skup gena bi bio o“eukariotski
operon“
kako je otkrivena RNA interferencija?
 Na obliću
 Na lokusu unc-22 koji reguira kretanje
 Pokušalo se dobiti mutanta pomoću antisense RNA koja bi bila
kompementarna prirodnome transkriptu
 Kontrolne reakcije s sense i dsRNA
 Pokazalo se da dsRNA najjače je potakla utišavanje unc-22
 Drugi sustav na biljakama
 Trnasformacija petnunija s T DNA
 Konstitutivno se eksprimirao jedna od enzima antocijana  nisu dobivene
tamnoljubičaste nego s bijelim sektorima ili potupno bijeli cvjetivi
 svibanj, 2021.

 Trnas geni koji se tu nalazio je istoo bio utišan

 Sekvencija endogeni gen anije bila mutirana
 Treći tip intraživnja ekspresija jednog virulnog gena i duhanu
 Biljke koji su eksprimirale gen postale su otporne
 dsRNA je bila postresnik u stvaranju tog fenotipa
mehanizam nastanka miRNA
 sa vlastitih lokus prepisuje iz RNA pol II
 primarni transkirip Pri-miRNA ima strukture s djelomičnom
komplementarnošću
 Drosha je nedonukleaza koja uklanja jenolančane djelove
 Takva Pre-miRNA ide u citosol i veže se Dicer
 On ukljanja petlju i imamo dsRNA i prihvaća ju Argonaut
 Uklajnja se crveni di o SSRNA
 Osrvaal je zelena koja se zove RISC (rna INDUCED SILENCING
COMPLEX)koji interagira s homolognih sekvencama trnasktipata
 Uloga risca: . razgrađuje mRNA; 2. blokira translaciju; 3. opstriura
transkripciju


 u slučaju potpune komplementarnost cijepanje transkripta
 djelomična komplementarnoost  otežana ili potpuna inhibicija
translacija
 najčešča komplementarnost na 3` UTR kraju
 svibanj, 2021.

 mehanizmi inhibicije transklacije

o vezanje kape
o elongacija
o spajanje 60S i40S ribosomskih podjedinica
o cijepa polA rep

Si RNA = RNAi
 ne potječe od vlstitih gena
 virus ili od trnaspozona, laboratorijski
 dvostrano prepisivnja vlastitog gena
 isti meh za miRNA
 na koji način se koristi ulabosu RNA interferencija
 imamo vektor koji se sastoji od promotora i teminatora
 trbamo imati cijeli gen tip akilobazu ali onda je on s jos jednom kraćom
sekvensom se nastavlja u antisense
 Sense sekvenca i reverse complement
 Na taj se način potpuno inaktivira
 ??????????????????????????????????
 svibanj, 2021.

RNAi lijekovi  FDA

 Obiteljska amiloidoza
 Utišava se protein transtireni  prenošenej tiroksina kroz krv
 Stabilna lipidna čestica u kojoj se nalazi dsRNA
Zajedniče komponentne miRNA i siRNA

 RITS (RNA induced transktiptional silencing)

Pi RNA
 Piwi interacting RNAs
 Transkripstis se procesiraju u krakte RNA molekule 26 do 30 nukelotida
 Djeluju i kompleksu s Piwi porodicom protinafunkcionalno srodnih
porodica Argonaute (Ago)
 piRNA u kompleksu s Piwi proteinom blokira transkripciju transpozona i
sprječava translaciju pripadajućih mRNA, naručito u germinativnoj liniji

GENETIČKO INŽENJERSTVO
 kombinacije gena koji u prirodi nisu moguće
 genetičko inženjerstvo (eng. genetic engineering)
 genetičko inženjerstvo = moderna biotehnologija
 genetičko inženjerstvo = tehnologija rekombinantne DNA  (eng.
recombinant DNA technology)
 svibanj, 2021.

 kolokvijalno: genetičko inženjerstvo  kloniranje (gena)

 otkriće restrikcijskih enzima tj. restrikcijskih
 endonukleaza omogućilo je razvoj genetičkog inženjerstva
1973. Stanely Cohen (Stanford) i Herbert Boyer (UCSF) _objavili su uspješno
“prekrajanje” DNA molekula
 In vitro prekrajanje molekula
 1980. dobili su patent: “Process for producing biologically _functional
molecular chimeras.”
 2 eksperimenta
o u 1 uzeli 2 plazmida svki jeimao po 1 EcoR! eestrikkcijsko mjesto
o Jedan rezistencija na tetraciklin a drugi na streptomycin u
sulfonamid
o Spojili ih jer sui h izrezali s enfonuleazama
o U 2pomiješali eukaritski gen I pomiješali u plazmidu
o Gen I Xenopus laevis
Sustav zaštite bakterija od bakteriofaga
• bakterijske restrikcijske endonukleaze (RE) cijepaju DNA faga
• svaka RE prepoznaje jedinstven kratki slijed nukleotida (4-8)
• bakterijska DNA zaštićena je metilazom (metilira ciljnu sekvenciju
pozicija C ili A)
svibanj, 2021.
 svibanj, 2021.

 prepoznaju palindromski slijed i _najčešće cijepaju asimetrično

 5' ili 3' stršeći krajevi (protruding overhangs)
 5' ili 3' uvučeni krajevi (recessed ends)
 tupi krajevi (blunt ends)
 Palindromeprepoznaju restrikcijski enzimi čitaju se jednako na oba lanca
u 5’3’ smjeru:
 Grequent cutter 4 nukelotida prepoznacju endonukčešće, rare cutter 6
nukelotidarijeđe
 Izračunavanje broja fragmenata pomoću 1 recstr. Ednonuk.
 Koja je vjerojatosst da će se pojavitsekvenca o d4 nukleotida (¼)4 = 1/256
 Koja ce bit vjerojasnost z a6 nukleotda  (1/4)6 =1/ 4096
 Za 8  1/35536

Kloniranje gena: ugradnja DNA fragmenta u plazmid/vektor

• plazmid i genomska DNA se poreže/pocijepa:
a) istim restrikcijskim enzimom isti ljepljivi krajevi
 rezanje s Hind III
 vector spajamo s fragmentom I dobivamo hibridni slučaj di imamo
komplementaronost stršećih endonukelaza
 spajamo vector I fragment imao komplementarnost
 događa se da ligaza ponovno spaja vector je r imamo slobodno
fosfornu skupinu , fizički su blizu
 rejsavamo problem  fragment u suvišku
 pomoću fosfataze se maknu fosfati na vektoru I ligaza nema supstrat I
nema zatvaranj vektora
 fosfati su na fragmentima ali se staničnim ezimima popravlja
 svibanj, 2021.

b) s dva različita enzima koji daju kompatibilne (komplementarne) ljepljive

krajeve
 2 restrikcijska mjesta koja imaju različite ciljne sekveence
 Nisu kompatibilni krajevi
 Ali se asimetrično cijepa I dobivamo CG stršeće krajeve
 Mogu se ligirati
 To rest. Mjeto ne mogu prepoznati Cla 1 I BstB1 jer iamju druagčiji gen
 Ali 3 enzim prepoznaje tu novu sekvenciju Taq

c) istim ili dva različita enzima koji daju tupe krajeve

 cijepaju tupe krajeve simetrično
 Novi moze bilo koji nukeotid
 Kloniranje pomoću EcoEV I Smal
o I genom se cijepa s eco r pili Smal Ili kombu
o Os nvo ligiranim mjestima necete vise s njima moc prerezat
 svibanj, 2021.

 Ako se želi klonirati putem tupih krajeva a nemate odgovarajući enzim onda
možete 3 i 5 stršeći kraju možete ga učiniti tupim velike podjedinice polI
 Ona je malo promjenjena krnja Dna pol  klenow fragment
o 1. 5’3’ polimerazna aktivnost
o 2. 3’5’ egzonukleazna aktivnost
o nema 5’3’ egzonukleaznu aktivnost
 1 varijanta EcoRi-HF dodavanje nukelotida
 2 varijanta je Pac 1 micanje nukleotida

Jos jedan primjer

 Gen od interesa na poziciji prije i početka kraja gena nemo egzonukleazu
 Koristi se PCR
 Viskoprocesivne i DNA polimeraze
 Genom je plavo ali vam trebaju ljepljivi krajevi a vi dodate restrikcijsko
mjesto i koju bazu više
 Primer 3 crtano dijelom je komplemetaran s genom a 5 strši
Željeni DNA fregment klonira se u plazmid:
 Plazmid pogodan za kloniranje gena mora imati
1) Mjesto pogodno za ugradnju gena : tzv poliklonsko mjesto (polylinker;
MSC- multiple cloning site)
2) Gen za otpornost na antibiotik (selektivni biljeg / marker)
3) Mjesto za početak replikacija (ori)
 svibanj, 2021.

Plavo bijela selekcija (regulacija gena kod prokariota):

 Plazmid koji ima alfa podjedinicu beta glatizidaze koji se ubacije u soj Ecoli
s omega podjedinicom
 Takav soj s plazmidom cini funkcionalni enzim
 Plavo obojenje s supstartom
 Poliklonsko mjesto se nalazi posred lacZ
 Ako ugrdio gen od interesam u bilo koje od restrikcijskih mjesta necemo
dobiti funkcionalnu podjedinicu
 svibanj, 2021.

Restrikcijska mapa
 Da biste mogli klonirati i prebacivati gene iz genoma u vektore nužno je
gdje se u sekvenci naalaze restrikcijsk amjesta sekvencioniranje
 Nekad pozicije i udaljenodst su se određivale :
 2 enzima od interesa i napravili bismo jednosturku i dvostruku digestiju
 Kod linearene s jednom restikcijskiom jedan više fragment nego
restrikcijskih mjesta
 Kod kružne jendak broj jfragmenata kao i restrikcijskih mejsta
 Linearna DNA i 3 reakcije 1. EcoRi, BamHI i skupa
 EcoRI 4 fragmeta
 BamHI 3 fragmeta
 Skupa 6 fragmenta
 Za digestiju EcoRI postoje 3 restikcijska mjesta
 Za BamHI 2 fragmenta
 Uzmemo EcoRI kao bazu i usporedujemo raspored s ova 2 pomješana
 svibanj, 2021.

E.coli je biološka tvornica za mnažanje plazmida

 Prirodni plazmid
o su nezgrapno veliki >10kb
o Low copy/ high stringency malo u stanici i broj kopija j estrogo
reguliran
 Laboratorijski plazmidi
o Mali
o High copy / low stringency
o pBR322 mali broj kopija po stanici reguliran rop lokusom
o pUC18/19 – beta laktamaza, nema rop lokus
Elekrofooreza
 vizualizaciija – etidij bromid, Syber Safe, Gel-Red, Gel Star

 bento lab

Ekspresijski vektor
 ima odgovarajući promotor (inducibilni ili konstitutivni)
 svibanj, 2021.

 do sad smo pričali o vektorima za kloniranje – ubacimo gen od interesa i

umnozimo
 to svojstvo se ne treba eksprimirati u genomu
 selektivni marker
 zelimo eksprimirat gen od interesa inducibilno ili konstitutivno
 umjeto strukturnih gen aubacijuemo gen od interesa
 osim promotorkse regije ubacujemo
 ekspresijski vektor za sisavce  konstitutivni virusni promtor i terminator
 virusi su adaptirani na ekspresiju u stanicama sisavaca
 ako želimo jako puno naseg proteina eksprimirati onda idemo na te jake
kontitutivne promotore
 poren poliklonskog mjesta je intron : obično se klonira cDNA, kod
eukariota se zeli ??????????????
 citomegalnooviirusni promotor i pojačivač
DNA biblioteka
 riječ je o tome da cijeli genom dijelimo na fragmente malih veličina
 genomse i cDNA
 cijeli genompodjelimo na fragmente malih veličina i ukolniramo u neki
vektor
 genom se fragmentira enzimatski ili npr. ultrazvukom, fragmenti se
ligiraju u neki od vektora
 vektori se ralikuju po kapacitetu tj. veličini DNA fragmenata koje mogu
primiti
kako se izrađuju bibloteke
 bibloiteka u lambda fagu
 alat koji nam omogućuje da generiramo podskupove
 genom od iteressa i lamda fag
 uklanjamo gene za lizgenu cuklus
 ono što radimo ostaju nam krajevi
 na žuto mjesto ubacujemo fragmenta
 porezali sm oBamH!
 S druge strane imamo digestiju s Sau3A koja je Percijalna digestija
 Zašto ? ne zelimo presitne fragmete
 svibanj, 2021.

 Zašto komba tih egzo  komplementarni krajevi

 Izoliraju se fragment određene veličine npr. 15 kb
 Ligacija palvi djelovi se ukloniraju
 Mjesta na lambda fagu se zovu kos mjetsta
 U svaku glavu invitro po jedan dio geoma?
 Ukupan kapacitet je 45kb mi imamo 23 kb
 In vitro fomirani virusi za inferkciju
 Plakovi odgovaraju klonivima biblioteke
 Korišetenje bibloteke izoliramo gen /palk i ugrađujemo ga u nov plazmid
Izolirani gen koristi se dalje za istraživanja funkcije: npr. konstrukcija
kimernih/fuzijskih proteina (lokalizacija) ili za komplementaciju

4 cutter LIZOGE
NI
CIKLUS

23 kb
 svibanj, 2021.

Drugi tip bibloteke  kozmidna bibloteka

 Ukloni se sve osim kos mjesta
 Oni su sastavni di okozmidnog vektora
 Ima jedno restrikcijsko mjesto BamHI
 Isto gnom s Sau3A
 Ligacijom fragmenata koje mozemo frakcionirati po veličini
 Mozemo puno duže do 45 kb
 In virko formiranje čestica faga
 Između 2 kos mjesta ide u jednu glavu faga
Lambda vs Kozmidna
 Kod lambde koristimo fage na bakterijskoj livadi i dobijemo plakove koji su
dio bibliotke
 Kad se kod kozmidne ubaci u bakteiriju ali nema gene za litički cikuls pa se
lineaarni genom omeđen s cos mjestima ubaci u e.coli i idobije se cirkularnu
molekulu i toj je sada plazmid
 svibanj, 2021.

Kako pretražuejmo genomsku ili cDNA biblioteku?

„colony lift“
 Podologa na koljoj imamo plakove/bakteijre
 Dodajemo nitrocelulozni filter i pllakovi / nakterije se preslikaju na filter
 Kwmikalijama razaramo virusne čestice , denaturiramo DNA i fiksiramo za
filter
 Pomoću odgovarajuće probe koja je hibridizirana na filter
 Kad eksponiramo film dobije se signal
 Prekolopi se membrana s pločom i identificiraju se plakovi/ kolonije od
interesa
Chromosome walking
 Traženje susjednih klonova u DNA bibloteci
 Vezani geni
 Cistična fibroza
 Kreće se od neke pozicije u genomu koja vam je poznata- molekularni
marker koji segregira u genomima ljudi koji imaju citičnu fibrozu
 U biblioteci ljudskog genoma znamo da klon A
 Proab komplementarna kraju gena klona A je korištena za nalaženje
preklapajućeg klona B
 svibanj, 2021.

 Iz rodosljova se definira da je gen na q kraku kromosoma 7

 Između lokusa met u D7S8
 Imamo 2 djela između poznata  D7S340, D7S122
 Možemo se kretat u oba smjera
 Kad se pokrije genom pomoću fragmenata kontinuirano
 Postoje 4 otvorena okvira čitanja (plavo)
 Bilo koji od ta 4moze bit gen za cističnu
 Po svojoj funkciji ne mogu biti kandidati
 Konačna potvrda je kosegregacija
 Skevneciramo ih i usporedimo kod zdarvih i bolesnih
 Tehnika uključuje probe, bibloteke, sekvenciranje
 Danas se može napraviti eksperimnet : uzme se osobe iz rodoslovlja i
sekvencira se potpuno genom i gleda se ralika u sekvencijama
 GWAS (genome -wide association studies) – statistički analiza sekvencija i
polimorfizama s fenotipom
Lamba 23 kb, kozmidna 45 kb, plazmidi 15kb
BAC (bacterial artificial chromosome) 100-300kb
 Genomska DNA se uzme digerira na fragmente
 Ugrađuje se u vektor
 Pohranjen genom u odsječcima
 Kako izgleda vektora?
 RepE  kontrolira veleičinu
 Par lokusi  pravilna podjela u stanice kćeri
 Cmr biljeg
 Selektivni markeri koji nam govore dali se ugradio
 Polklonska mjesta sobje strane
 Ljudski genom pomoću ovoga
 Bac klonovi u kontinuirani slijed
 CONTIG- kontinurisani slijed DNA dobiven preklapanjem pojedinih
BAC klonva
 Otrkili su susjedne – veliki DNA agarozni gel na kojem je stajao puno
BAC kolonova i svaki od BAC klonova je porezan istim rest. Enzimom i
gledalo se koji BAC klonovi sadrže iste fragmete jer to ukazuje na
srodnost
 svibanj, 2021.

YAC (Yeast artificial chromosome)

 u stanicama kvasca
 100kb -3Mb
 YAC klon
 1 . plazmid - Imamo mjesto u kojega cemo uklonirati slijed
 BamHI mjesto odmah uz telomernu sekvenciju
 Između je selektivni marker – prije kloniranja je vektor prototrof za his i ura
 Kad porežemo s BamHI mičemo his i omogućuje nam selekciju
lineariziranog vektora
 Centromerna sekvenca koja će omogućit mitotski diobu
 YAC biblio od linearnih KLONOVA
 Rezanje može biti potpuno i nepotpuno – parcijalna digestija
 Vektor ima Bam mjesto koje se poreže i dobijamo 2 linearne molekule koje
se kombiniraju s geomskom DNA
 Funkcija biblioteka – izolirno gen o dinteresa i dobivamo klon
Kako brzo umnožiti željeni plazmmid ili DNA slijed?
 svibanj, 2021.

 Izrezivanje i ugradnja u plazmidni vektor

 Pomoću 2 primera PCR

 Transgenične linije
 DR5: GFP = sintetski promotor + GFP = auksinski „biosenzor“
 Od čega se sastoji sintetski promotor: minimalni 35 S promotor
(konstitutivni promotor biljaka) pozicije promotora -90 do +1, uzvodno
od -90 se alazi 9 punoa ponovljena sekvencija TGTCTC, konsezus
 svibanj, 2021.

sekvneci promotora onih gena koji se inače transribiraju kada u medij

dodate auksin

Komplemantarna DNA  cDNA

 Dobivanje gena bez introna
 Transkripst kojeg smo pretvorili u DNA
 mRNA s poli A repom  koristimo oligo T primer
 pomoću RT je DNA ovisna polimeraza i ona sitetizira do kraja tj.
početka transktipta i to je 1. lanac cDNA
 i pomoću DNA pol se sint. Drugi lanac
sinteza 1. lanaca 3. načina
1. oligo T
2. specifični primer koji je koplementaran s sekvencom nepostredno
od poli A repa specifični
3. random primeri koji se vežu na više mjesta u genomu , u prosjeku
u reakciji imamo 1 vezanje hksamera na neku poziciju u trankriptu
što bliže 3 kraju
sinteza 2. lanca
 ako umnažamo samo jedna lokus dodaje se 2 primera
 svibanj, 2021.

1. ciklusu je mRNA cDNA heterodupleks na koji se veže samo jedan primer

jer primer nen ide na mRNA
2. ciklus se umnaža eksponencijlno oba lanca cDNA
 ako se želi umnožiti sve cDNA nekog transkripta (cDNA biblioteka)
1. pomoću oligo-dTa dobivamo 1.lanac
2. ako koristimo amvRT sposobna je inicirati sintezu od 3 crtano kraja na način
da rad ipetlju
3. moramo se rjesit jednolančanog dijela pomoću S1 nukleaze ali tu gubimo
nekoliko nukelotida s 5 kraja transripta

1. prvi cDNA lanac i dodajemo oligo G s terminalnom transferazom na 3 kraj

2. oligo C kao primer sintezu 2 lanaca

1. heterodupleks i dodajemo Rnasa H koja cijepa na vise mjesta i oslobađa Oh

skupine na 3 kraju kao početnice
2. pomoću Klenowa i DNA pol i ligaze se sintetiziraju poput Okazaki
fragmenata
 svibanj, 2021.

Primjena : usporedbom cDNA i genomske DNA dobiva se preklapanje i

identificiramo introne
DNA mikročipovi
 regulacija ekspresije kod eukariota
 simultano praćenje ekspresije svih gena kod eukaripta
 prvo kontolni uzorak i ekpsrimentalni uzorak
 staklena pločica soligonukleotidima i komplementarni su s jednim od gen au
genomu (u svakoj jazici jedna vrsta oligonuk)
 geni koji na m nisu poznati nemozemo kvatificirati
 iz uzoraka 1 i 2 izolira se mRNA i prevodi se u cDNA koja se obillježi
zeleno , a drugi se uzorak obilježi crveno
 hibridizacija na oligonuk ne događađ iistovreneno!!!!
 1. cDNA npr. zeleno pa se očita
 2. ispere se jer su vodikove veze u pitanju i nanese se uzorak crvene
 3. preklapanje slika i dobivanje slike
 svibanj, 2021.

 Interpretacija signala
 Preduvijet  sekvencirani genom da bi imali čip, da bi vidjeli ekpresiju
treba se eksprimirati taj gen u tkivu
 Crno  nema ekspresije
 Žuto  količina cDNA divlji tip i mutatna je pdjednaka
 Zeleno  količina cDNA koja se vezala ima više zelenih transkipata
 Crveno  količina je veće kod mutanata

 Problem : DNA čip tehnologija detektira ekspresiju samo onih gena čiji
su komplementarni oligonukleotidi pričvršćen na sam čip
 „neuhvatljivo” za DNA čip: neopisani geni (nisu anotirani), male RNA,
virusne RNA u uzorku…
 rješenje: RNA sekvenciranje korištenjem sekvenciranja nove generacije
(next generation sequencing)
 ne sekvencira direktno RNA
 potrebno je RT RNA u cDNA dodati barkodove i adaptere
 barkod je vrst aadaptera ciju sekvencu smo mi detektirali i označili
uzorak
RNAseq
 8 staza s milijonima jažica
 Savak jažica se u svakom ciklusu čita
 Simultano čitamo nukleotid
 Primeer bi se vezao za adapter i sekvnenciranje ide prema gore
 Trenutno se čita ATG
 svibanj, 2021.

 Ideja je da se prvo dodaje fuloresc. Adenoin u sve jažica i gleda se di

se vezao , pa se dodaje T,C i G
 Opet se dodaju sva4 da se pročita 2. pozicija
 Coverege transkriptoma  broj očitanih nukelotida
Primjena genetičkog inžinjersva u prksi :
1. U zelenoj tehnologiji je puno preciznije od klasičnog oplemenjivanja,
ubacujemo u biljku neke gene koje neželimo
2. Nema ograničenja koa kod klasičnog opleme. Klasično se mogu dodavati
dsamo geni srodnih vrsta

 Trangenične biljek na tržištu : otpornost na herbicide,inekte (BT toksin),

velike kompanije
 Otpornost na viruse – na temelju kapside omotača
 Ekspresija jednog virusnog gena
 svibanj, 2021.

 Estetska svojstva
 Otprnot na smeđene, smanjeni udio akrilamida
 Odgođeno smeđenje
„FlavrSavr“
 1994. prvi gentiči modificiran org. Rajčica
 Uporeno mekšanje ploda i zrioba jer je deaktiviran gen za poligarakturonazu
 Spriječava se razgradnja pektina
 To omogućuje branje potpun ozerlih polodova koji ne mekšaju odmah
Zlatna riža
 Iam sve gene za sintezu beta karotena
 U endospermu nisu svi geni aktivni
 Nakuplja je geranilgeranil difostat
 Fale enzimi
 Teško ih se aktivira
 Ali su dodani 2 gena iz narcisa i bakterijski gen

 Od novijih proizvodi namjenjene malim potrošačima  ne smeđi u

presjeku
 svibanj, 2021.

 Samnjena ekpresij apolifenol oksidaze (PPO) upotrebom RNA

interferencije
 U sok od jabuka se dodaju antioksidansi
 Krumpiru se isti enzim utišava
 Samnjena sinteza asparagina i šećera jer povišenoj temp. Stavrajz puno
aktilamida koji je kancerogen
 Majarova reakcija
 Globalni rast sadnje GM kutura-2015/6 plato

Načini unošenja strane DNA i labosu

 Agrobact., virus
 Zavrsava se s transgenoom koji je postao dio genoma
 Najčešće imamo neciljanu ugradnju  opasnost od mutacija
 Genska terapija prva je pala u vosu jer je nasumična ugrandanja

Agrobacterium tumefaciens: prirodni “genetički inženjer”:

 Biljka po ranjavanju otpušta acetosiringone u tlo, a oni potiču ekspresiju vir
gena u agrobakterijama.
 svibanj, 2021.

 Rana je na biljci između korijena i stabljike i uzrkouje se tumor je

eksprimiraju gene za virulenciju
 Geni za virulenciju ugrađuju DNA
 Auksni i citokini tumor
 Opini hrana za agrobakterije
 T DNA koja se prebacuje i ugrađuje nasumično
 Postoje biljni gen ikoji posreduju ugradnji
 Na mjestima u genomu gdje prirodno nastaju dvolančani lomovi i
poprevkom se slučajno ugrađuje T DNA
 Mutant polimeraze koji nemože transformiranti u T DNA bakteijr?????????
 Sustav agrobakteija sastoji se od 2 vektoea : helper i binarni vektor jer bi
inače bili preveliki
 Selektivni marker i gene of interest
 Između L i RB s enalazi dio koji se ugrađuje u genom
 Pomoću selektivno biljega identificiramo
 Konstitutivni promotor koji eksprimira gen od interesa
 Terminator
 Kariptip rajčice 2 homologa krmosoma u kojeg je ugrađena T DNA
 Životinje:
 transgenični losos (brži rast)
 transgenične akvarijske ribice(fluoresciraju u akvariju pod UV-om)
 transgenična koza (proizvodi ljudski antitrombin u mlijeku)
 transgenična kokoš (proizvodi ljudsku lizosomsku lipazu u jajima
 50 različitih protein a su se proiizveli u mlijeku međutim se transgen ubciju
je genokm u nefunskcionaln ikazeinski lokus i specifično se eksprimira
samo u mlijeku koza/krava
 Samo trangenične koze su in
PRIJE CRSPR CASa
 Zn finger nuleaze 2003
 2 zn fingera, moze prepozanti 2nukelotida i slaganjem vise zn se
rpeopznaje
 TALE nukelaze 2010.
 Proteni iz bakt ksantomonas
 svibanj, 2021.

 Bakterija koristi za napad domaćina moze se sinttetizirati nizovi

nukeltida
CRISPR-Cas9
 Protinski dio je Cas9 nukleaza
 Dizajnira se guide RNA –ne mjenja se sekundarna struktura nego 5 `
sekvence od 20ak nukeotida koje prepoznaju sekvencu u genomu
 Bilo koji ali s 3 strane mora imati PAM slijed NGG sliejd
 Simetričan dvolančani lom na tom mjestu
 Većina primjene dvolančani lom se popravlj nespecifično nehomolognih
sparivanja krajeva
 Kod tog poprevaka se unose adicije/delecije  mutageneza
 Ulazak u doba gen inž. 2.0 modifikacija IN VIVO
 U ciljnom orhanizmu smo dosadašnjim promjenama radili ansumično ovo je
ciljano
 Selektivni bilejzi nisu potrni
 Kako možemo detektirati dobili dvolančani lom di smo zeljeli
 Zabere se gen i mjeszto di zelimo lom
 Uzvodno je PAM sekvenca o d20 nuk
 Blizu PAM sekvece je Hinf1 mjesto
 Ukoliko se dogodi lom on će biti unutar 5 nuk. Uzvodno od PAM sekvence i
time će Himf1 će se inaktivran
 Pomoću tog e promvjerava
 Uzmu se 2 primera koji omeđuju to mjesto i dobiva se frament neke većičine
 PCR i ampplikoni  porezani i neporezani PCR
Varijanta Cas9
 Jendo katalitičko mjesto mutirano nikaza jednolančani lomnCas9
 Nema katalitičku aktivnost ali se je označi s GFPom dCas9
svibanj, 2021.
 svibanj, 2021.

Pitanja
1. Dva načina na koja se može umnožiti DNA
a) In vivo – E.coli
b) In vitro – PCR
2. Mutagen koji specigično modificira jednu bazu

 Uzrokuje tranziciju adenina u gvanin

3. Sinteza funkcionalne laktaze ili permeaze. Svi sojevi su uzgajani bez glukoze
i genotip su I+. Obratite pažnju da su 2. i 4. soj merozigoti.

a) 1. - + - +
b) 2. - + - +
c) 3. + + + +
d) 4. + + - +
4. EcoRI je restrikciijska endonukleaza koj acijepa između G i A. Kako će
izgledati fragmenti koji su tretirani Klenowim fragmetom ?
5` NNGAATT 3`
3` NNCTTAA 5`
5` AATTCNN 3`
5` TTAAGNN 5`
5. Koja su 3 osnovna zahtjeva kod konstrukcije ekspresijskog vektora za
uspješnu ekspresiju nekog ljudskog proteina u E.coli?
 Promotor, pojačivač, terminator
6. Eukariotska regulacjia ekspresije: Aktivatori se vežu na tzv. pojačivače/
enhancers. Represri se vežu na utišivače/silecers. Izolatori omogućuju
konzistenciju eukromatina i heterokromatina.
7. Što označavaju oznake H3K9me2 i H3K9ac ?
 svibanj, 2021.

 Oznake priakzuju koje su se modifikacije dogodile na histonima.

Oznaka se čita tako da prvi znak u ovom slučaju H3 govori o kojem je
tipu histona riječ, poziciju tj. udaljenost modificirane aminokiseline
od N terminusa, i treća pokazuje koja se modifikacij adogodila i
koliko puta je neka skupina dodana na aminokiselinu.
 H3K3ac - upućuje na modifikaciju H3 histona na lizinu na poziciji 3
od N terminusa, na koju se dodala acetilna skupina
 H3K9me2 - modifikacija na H3 tipu histona , na linzinu koji je na 9
poziciju od N terminusa dodale su se 2 metilne skupine
8. Dali se samesense, missense ili non sense mutacije mogu detektirati na
Northern blotu?
 Samesense mutacija kojom se mijenja nukleotid, ali i taj novonastali
kod daje istu aminokiselinu
 U slučaju missense mutacije imamo zamjenu jednog nukleotida i
imamo promjenu aminokiseline. Promjena u dužini transktripta se
nije dogodila pa ne možemo vidjeti razliku između WT i mutanta.
 Kod nonsense mutacije kada zbog mutacije dolazi do preuranjenog
stop kodona. Ne skraćuje se transkript pa se ne vidi drugačiji signal
na Northern blotu, ali na Westernu se događa prmjena jer se stvara
kraći peptid.
 Kod delecija i adicija dolazi do pomaka okvira čitanja, ali transkrip
ostaje iste dužine pa se na Northern blotu ne vidi promjena dok na
Westernu postoj i više ishoda  ako se dogodi Stop kodon prije
orginlnog biti će dolje, ako se dogodi prolazak kroz stop kodona
translacija ce se zaustviti na seljedećem kodonu i stvoriti će se veći
peptid.
 Mutacije mogu promjeniti mjesto izrezivanaj introan te se onda
događa promjena duljine transkripta koja će se očitati na Nortern
blotu.
9. Koja je osnovna razlika u promjenama na DNA koji uzrouju kemijski
mutageni u odnosu na fizikalne mutagene? Kakve mutacija uzrokuje
tautomerizacija dušićnih baza, kakve replikacijsko proklizavanje?
 Tautomerizacija uzrokuje supstitucije.
 Replikacijsko preoklizavanje uzrokuje insercije i delecije
 svibanj, 2021.

 Kemijski mutageni uzrokuju supstitucije, insercije, delecije i

deaminacije dok fizikalni uzrokuju dvolančane lomove i pirimidinke
dimere
10. Koje su 3 najčesće kovalentne modifikacije histonskih repova (histone
tails)?
 Acetilacija, metilacija, fosforilacija
11. EcoRI cijep aizmeđu G i A. Nacrtajte ljepsljive krajeve i 5 4 označite
 NNGAATTCNN
 NNCTTAAGNN
 5` NNG 3` 5` AATTCNN 3`
 3`NNCTTAA 5` 3 ` GNN 5`
12.Koliko očekujemo fragmenata DNA nakon potpune digestije genoma vinove
loze (oko 500 Mb) restrikcijskom nukleazom HindIII koja prepoznaje
palindromski slijed AAGCTT?
 5 * 106 pb / (1/4)5 =
13.Nabrojite 3 osnovne regije plazmidnih vektora za kloniranje koji se koriste u
labosu i objasnite njihovu ulogu
Ori – mjesto za početak replikacije
MSC (Multiple Cloning SIte) – mjesto pogodno za ugradnju gena,
poliklonsko mjesto
Selektivni biljeg - potvrđuje ugradnju gena, gen za otpornost na atibiotik
14. Nabrojite 5 klasa DNA bibloiteka poredanih od najveće prema najmanjoj
obzirom na kapacitet . Zašto se kod fragmentiranja genoma za izradu
genomskih biblioteka često koristi parcijalna digestija?
 YAC (Yeast artificial Chromosome) > BAC(Bacterial artificial
chromosome) > Kozmidna > Lambda fag > plazmid
 100 kb -3 MB > 300 kb > 45kb > 23kv > 15kb
 Potpunom digestijom dobit ćemo premale fragmente.
15. Opišite sustav binarnih vektora koji se koriste za transformaciju biljaka
(funkciju svakog plazmida). U koji dio genom će se ugraditi DNA?
 Prirodni vektori su prilično veliki i sam je proces transformacije
neefikasan. Podjelio se na vir helper i binarni vektor. Na binarnom
vektoru se nalazi selektivni mareker i gen od interesa između LB i
RB sekvence koji se ugrđuje u genom. Vir helper sadrži gene
potrebne za uspješnu ugradnju.
 svibanj, 2021.

 T DNA se nasumično ugrađuje u genom, ali se češće događa na

mjestu nastajanja prirodni dvolančanih lomova DNA biljke.
16.Kako se lezije izazvanje UV (pitimidinski dimeri) popravljaju kod
prokariota, a kako kod eukariota? Koja ja nasljedna genska bolast kod ljudi
posljedica nefunkcionalnosti puta popravka pirimidinskih dimera?
 Fotoreaktivacija (fotoliaza), Ekscizijski popravak (uvrABC:
endonukleaza uvrD: helikaza), Xeroderma pigmentosum
17. Zamislite da je u dolje navedenoj sekvenci došlo do 2 dvolančana loma te da
je prije popravak a došlo do inverzije srednjeg fragmenta (bold font).
Prikažite istu sekvencu DNA nakon popravke (oba lanca, označite polarnost
lanaca).
 5`-ATGTACCGCTACTATACGGG-3`
 3`-TACATGGCGATGATATGCCC-5`
 5`-ATGTCATCGCCATATACGGG-3`
 3`-TACAGTAGCGGTATATGCCC-5`