TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.

HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO MÔN HỌC

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Mã lớp học phần: PRFT415350_23_2_10CLC

GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
Nhóm thực hiện: Nhóm 03
1. Trần Phương Vy 21116139
2. Bùi Trọng Tấn 21116113
3. Nguyễn Minh Tâm 21116111
4. Lê Bích Hà 21116062

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2024

Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
ĐIỂM SỐ

TIÊU CHÍ NỘI DUNG TRÌNH BÀY TỔNG

ĐIỂM

Nhận xét của giáo viên:

...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................
...................................................................................................................................

Ngày 03 tháng 04 năm 2024

Giáo viên chấm điểm

2
 BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ
MÔN HỌC: THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ LÊN MEN Mã học phần: PRFT415350_10CLC
HỌC KỲ II – NĂM HỌC 2023- 2024
Thời gian học: từ 28/2/2024 đến 20/3/2024

Giảng viên: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn

Sinh viên 1: Trần Phương Vy MSSV: 21116139
Sinh viên 2: Nguyễn Minh Tâm MSSV: 21116111
Sinh viên 3: Bùi Trọng Tấn MSSV: 21116113
Sinh viên 4: Lê Bích Hà MSSV: 21116062

Thời gian thực hiện

Nội dung thực hiện SV1 SV2 SV3 SV4
(từ…tới…)

Tổng hợp word, phần kết luận x 28/2/2024 – 20/3/2024

Phần tổng quan nghiên cứu, nguyên liệu

x 28/2/2024 – 20/3/2024
và phương pháp nghiên cứu

Phần kết quả và bàn luận x x 28/2/2024 – 20/3/2024

Edit video x 28/2/2024 – 20/3/2024

Powerpoint x 28/2/2024 – 20/3/2024

Thuyết trình x x x x 28/2/2024 – 20/3/2024

Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NHÂN GIỐNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ
(A3-B3-C1-D3 (10%) -E1/E2/E3-S1d-M1d-F1)
Trần Phương Vy, Bùi Trọng Tấn, Lê Bích Hà, Nguyễn Minh Tâm
Trường Đại học Sư phạm Kỹ Thuật TP.HCM (HCMUTE)
Khoa Công nghệ Hóa học và Thực Phẩm
Bộ môn Công nghệ thực phẩm
_____________________________________________________________________
TÓM TẮT
Saccharomyces Cerevisiae là một phần thiết yếu trong ứng dụng công nghệ sinh
học và nó được sử dụng rộng rãi trong quá trình lên men thực phẩm và đồ uống, trong đó
nó có ý nghĩa thương mại cao. Một số nghiên cứu đã tìm hiểu và chỉ ra trong quá trình lên
men có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến động học sinh trưởng của vi sinh vật như là nhiệt
độ, cơ chất, hoạt độ nước, pH,... và thời gian nhân giống cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn
đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men. Mục đích quá trình thí nghiệm chính
là tìm ra khoảng thời gian tối ưu nhất cho sự phát triển của chủng Saccharomyces
Cerevisiae. Trong thí nghiệm, chủng giống Saccharomyces Cerevisiae sẽ được nhân giống
trong ba khoảng thời gian 12h, 24h, và 36h ở nhiệt độ 30oCtrong môi trường pH=6. Kết
quả cho ở thời gian nuôi cấy 12 giờ thì sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật là
tốt nhất. Qua một số thông số động học, chúng ta sẽ có cách nhìn trực quan về sự phát triển
của chủng Saccharomyces Cerevisiae ở các thời gian nuôi cấy khác nhau qua thực nghiệm.
Dựa trên những dữ liệu thu thập được, áp dụng vào trong quy mô công nghiệp, phục vụ cho
những quy trình sản xuất thực phẩm một cách tân tiến nhất.
Từ khóa: Saccharomyces Cerevisiae, nấm men Saccharomyces Cerevisiae, động
học sinh trưởng, ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của chủng giống
Saccharomyces Cerevisiae
I. ĐẶT VẤN ĐỀ định nghĩa bởi Rees vào năm 1870. Tên
Saccharomyces Cerevisiae là một Saccharomyces cerevisiae bao gồm hai
loài thuộc chi Saccharomyces, được phần: Phần đầu tiên “Saccharo” có nghĩa
Meyen giới thiệu vào năm 1838 và được là “nấm đường” trong tiếng Hy Lạp
1
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
Latinh hóa trong khi phần thứ hai
“cerevisiae” có nghĩa là “bia”. Nó có hình
dạng tròn đến hình trứng và sinh sản theo
cơ chế nảy chồi (Feldmann, 2010). Thành
tế bào S. cerevisiae chủ yếu được cấu tạo
bởi một lớp bên trong gồm β-glucan và
chitin, một lớp bên ngoài là những sợi
được cấu tạo từ highly glycosylated liên
kết với protein (mannoproteins) (Soares,
2011).
Nguồn dinh dưỡng của
Saccharomyces Cerevisiae chủ yếu là
carbon từ đường, nguồn nito từ các acid
amine (Foss và cộng sự, 1995). Sucrose là
loại đường quan trọng nhất sử dụng trong
công nghiệp của nấm men Saccharomyces
Cerevisiae. Saccharomyces Cerevisiae có
khả năng phân chia nhanh trên môi trường
xác định. Mỗi tế bào Saccharomyces
Cerevisiae sinh sản bằng cách nảy chồi và
chồi phát triển kích thước trong suốt chu
kỳ tế bào. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy
S. Cerevisiae có thể là loài sinh vật thí
nghiệm dễ sử dụng nhất hiện nay để phân
tích di truyền, sinh lý học và phân tích
sinh hóa của chu trình phân chia tế bào
phân bào ở sinh vật nhân thực (Mitchison,
1971). Các yếu tố khảo sát cơ bản về ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển nấm
men là: pH, nhiệt độ, hàm lượng đường,
2
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
oxi hòa tan, chất thay thế, bổ sung
(Nguyễn Quang Thảo, 2000; Arroyo-
López et al., 2006; D'Amato et al., 2006).
Sinh khối nấm men được sử dụng rộng rãi
như nguồn cung cấp protein cho người và
động vật trong thức ăn chăn nuôi hoặc các
sản phẩm bổ sung cho con người
(Solomon, 2017). Nhiều nghiên cứu đã sử
dụng chủng nấm men Saccharomyces
Cerevisiae để sản xuất protein đơn bào,
glucan, carotenoid (Kwiatkowski, 2012).
Hiện nay, Saccharomyces Cerevisiae là
chủng nấm men không chỉ được ứng dụng
rộng rãi trong ngành lên men đồ uống và
sản xuất protein đơn bào mà còn được bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi (Ngô Thị
Huyền Trang, 2017).
Nhiều phế phụ phẩm công-nông
nghiệp đã được sử dụng làm nguồn cơ
chất để sản xuất sinh khối nấm men trên
quy mô công nghiệp. Trong thực phẩm,
nấm men Saccharomyces Cerevisiae
được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản
xuất bánh mì, lên men bia, rượu...Vì
Saccharomyces Cerevisiae rất dễ nuôi
cấy, dễ dàng phát triển bằng cách sử dụng
các kỹ thuật lên men đơn giản và môi
trường phát triển rẻ tiền, đồng thời sinh
khối cao.
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
Hơn hết, việc lựa chọn thời gian
cấy giống cũng là một trong những yếu tố
ảnh hưởng nhiều đến Saccharomyces
Cerevisiae. Thời gian cấy ảnh hưởng đến
tốc độ sinh trưởng, hiệu suất tạo ra sinh
khối, ảnh hưởng đến lag phase, log phase
trong đường cong sinh trưởng và thành
phần của tế bào nấm men. Việc nghiên
cứu môi trường tối ưu cho nấm sinh
trưởng, phát triển giúp thu lượng sinh khối
lớn với hiệu suất cao đang là vấn đề được
quan tâm. Quá trình nuôi cấy và lên men
Saccharomyces Cerevisiae chịu ảnh
hưởng của nhiều yếu tố khác, tuy nhiên
hàm lượng đường môi trường nuôi cấy
được coi là một yếu tố quan trọng đối với
sự tồn tại và phát triển của nấm men (Fleet
và cộng sự, 1993). Vì vậy, nhóm nghiên
cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời
gian nhân giống lên động học sinh trưởng
của nấm men Saccharomyces Cerevisiae
trong quá trình nuôi cấy mẻ.
II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nấm men
Chủng vi sinh vật vật: Nấm men
Saccharomyces Cerevisiae ở dạng đông
khô được sử dụng để nhân giống vi sinh
vật. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae
sử dụng 0,1g và được hoạt hóa, nhân
3
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
giống trong 100ml môi trường M1d ở
300C trong 24 giờ trên thiết bị có khuấy
từ.
2.2. Thiết bị và dụng cụ
Kính hiển vi BioBlue
Buồng đếm hồng cầu
Micropipette
Máy ly tâm Hettich EBA-21 1004
Khúc xạ kế Atago
Máy đo pH
Máy khuấy từ 120 rpm và một số
dụng cụ và thiết bị khác.
2.3. Chuẩn bị môi trường và nhân
giống
Môi trường nhân giống: Môi
trường nhân giống sử dụng trong nghiên
cứu này được gọi là môi trường M1d với
thành phần gồm: Saccharose (100g/l),
Peptone (1g/l) và dịch chiết giá đỗ
(1000ml). Dịch chiết giá với tỉ lệ giá: nước
cất=1:10 tức 100g giá đã được xử lý sạch
sẽ cần dùng 1000ml nước cất, đun sôi 30
phút sau đó sử dụng dịch trong và bổ sung
nước cất cho đủ 1000ml. Cân đường
sucrose, peptone cho vào erlen 250ml.
Thêm dịch chiết giá vừa đủ 100ml sau đó
tiến hành lắc cho đường hòa tan hoàn
toàn. Tiến hành hiệu chỉnh pH về giá trị là
pH = 6.0 bằng dung dịch H2SO4 0,1 N và
NaOH 0,1N. Sau đó đậy kín erlen bằng
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
bông gòn và giấy bạc để tiến hành tiệt
trùng môi trường ở 1210C trong vòng 15
phút. Môi trường được kiểm tra nồng độ
đường khử hoặc/và đường tổng (hoặc %
sucrose bằng khúc xạ kế) trước khi cấy
giống nấm men. Sau khi tiệt trùng môi
trường được đưa về 300C và tiến hành cấy
0,1g nấm men Saccharomyces cerevisiae
vào môi trường nhân giống. Nhân giống
trong điều kiện nhiệt độ 300C, có khuấy
với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ.
Môi trường lên men: Môi trường
lên men sử dụng trong nghiên cứu này
được gọi là môi trường M1d với thành
phần gồm: Saccharose (100g/l), Peptone
(1g/l) và dịch chiết giá đỗ (1000ml). Được
hiệu chỉnh pH về giá trị là pH = 6.0 bằng
dung dịch H2SO4 0,1 N và NaOH 0,1N.
Sau đó đậy kín erlen bằng bông gòn và
giấy bạc để tiến hành tiệt trùng môi trường
ở 1210C trong vòng 15 phút. Môi trường
được kiểm tra nồng độ đường khử hoặc/và
đường tổng (hoặc % sucrose bằng khúc xạ
kế) trước khi cấy giống nấm men đã hoạt
hóa. Sau khi tiệt trùng môi trường được
đưa về 300C và tiến hành cấy 10% nấm
men Saccharomyces cerevisiae đã hoạt
hóa vào môi trường lên men. Lên men
trong điều kiện nhiệt độ 300C, có khuấy
với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ.
4
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
2.4. Phương pháp
Quá trình nuôi cấy
Sau quá trình nhân giống, bổ sung
20ml nấm men Saccharomyces
Cerevisiae vào 180 ml môi trường M1d đã
được tiệt trùng bình nuôi cấy trước đó và
lần lượt khảo sát thời gian nhân giống là
12 giờ,24 giờ,36 giờ. Quá trình nuôi cấy
phải thực hiện ở nhiệt độ phòng, được đặt
trên thiết bị khuấy từ và cần đảm bảo là
khi khuấy phải tạo một hõm nước trong
bình nuôi cấy. Trong suốt quá trình nuôi
cấy thì tiến hành mục đích thí nghiệm
trong thời gian 12,24 và 36 tiếng. Bắt đầu
từ bắt đầu giờ thứ 0, cứ cách mỗi 1 giờ,
một mẫu của môi trường nuôi cấy sẽ được
lấy để phân tích các chỉ tiêu mật độ tế
bào/ml, tỉ lệ tế bào sống, tỉ lệ tế bào nảy
chồi, hàm lượng đường khử (% sucrose
bằng khúc xạ kế). Thí nghiệm lên men chỉ
kết thúc cho đến khi quá trình sinh trưởng
đạt được 3 điểm ở pha cân bằng hoặc thời
gian khảo sát kết thúc.
Xác định mật độ tế bào nấm men,
tỉ lệ tế bào nấm men sống, tỉ lệ tế bào nảy
chồi bằng buồng đếm hồng cầu
(Hemocytometer)
Xác định mật độ tế bào vi sinh vật
thông qua xác định số tế bào/ml gồm tế
bào sống, tế bào chết và tế bào nảy chồi
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
được xác định trên buồng đếm hồng cầu.
Tế bào bị nhuộm xanh bởi methylene blue
là tế bào chết. Vì methylene blue sẽ đi vào
tế bào và bị phân hủy bởi các enzyme bên
trong tế bào sống và các tế bào này không
bị nhuộm màu, còn tế bào chết không có
khả năng sinh các enzyme đó nên bị
nhuộm màu.
Cách tiến hành
Bước 1: Trộn đều 0.1ml huyền phù
(đã pha loãng) với 50𝜇l dung dịch 0.2%
methylene blue (pha trong D.W) trộn đều
trong 30 giây,sau đó để yên trong 1 phút
.Trước khi lấy mẫu ra cần trộn lại cho
dung dịch đều.
Bước 2: Chuẩn bị buồng đếm
Bước 3: Ngâm sẵn phiến kính
trong nước javen. Lưu ý, 1 tiếng thay nước
ngâm 1 lần
Bước 4: Đặt phiến kính trượt lên
buồng đếm
Bước 5: Dùng pipet lấy 10 𝜇𝑙 mẫu
huyền phù nấm men vào cạnh buồng đếm
(nơi tiếp giáp với lamelle).
Bước 6: Buồng đếm được chuẩn bị
đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa
buồng đếm và lamelle được trám đầy bởi
huyền phù nấm men, còn các rãnh xung
quanh thì không bị dính ướt. Sau đó đặt
buồng đếm dưới kính hiển vi, sử dụng vật
5
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
kính x4 để tìm buồng đếm và vật kính ×10
và ×40 để quan sát.
Bước 7: Kết quả đếm mật độ tế bào
chỉ có giá trị trong vòng 3 – 5 phút sau khi
cho mẫu vào buồng đếm. Thông thường ta
chọn năm ô lớn theo đường chéo (các ô
đánh dấu) để đếm. Lưới đầy đủ trên buồng
đếm có chín ô vuông, mỗi ô là 1mm2. Khu
vực đếm trung tâm có 25 ô vuông lớn và
mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ hơn.
Chất huyền phù phải đủ loãng để các ô
hoặc các phần tử khác không chồng lên
nhau trên lưới và phải được phân bố đồng
đều. Đối với các ô lớn, bạn chỉ cần đếm
các ô bên trong bốn hình vuông góc lớn
(Hình B – E) và hình vuông ở giữa (Hình
A). Đối với huyền phù dày đặc của các ô
nhỏ, có thể đếm các ô trong bốn ô vuông
ngoài và giữa của hình vuông trung tâm
(Hình A) hoặc tạo huyền phù loãng hơn.
Bước 8: Ở mỗi độ pha loãng, sau
khi đếm ta được số tế bào trên năm ô lớn
là a. Số tế bào nấm men (N) trên 1.0 ml
mẫu.
𝑎 400
𝑁= × × 103 × 10𝑛
𝑏 0,1
Trong đó:
N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho
vào buồng đếm a: số tế bào trên 5 ô vuông
lớn
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông
lớn
(16 × 5 = 80) 400: tổng số ô vuông
nhỏ trong 25 ô vuông lớn 0,1: thể tích
(mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm
103: số chuyển mm2 thành ml (103
mm2 = 1 ml)
10n: độ pha loãng mẫu (lưu ý khi
tính độ pha loãng phải bao gồm lượng
methylene blue cho vào mẫu).
Phương pháp định lượng đường
tổng số bằng khúc xạ kế
Nhóm thực hiện định lượng đường
tổng bằng phương pháp khúc xạ kế. Đầu
tiên, cho 1ml mẫu vào ống nghiệm rồi
đem đun cách thủy trong 15 phút để tiêu
diệt toàn bộ nấm men. Sau đó, mẫu được
đem ly tâm (2000 rcf) trong 5 phút để lắng
toàn bộ cặn. Dịch nổi được cho vào khúc
xạ kế để xác định hàm lượng đường tổng
số (% sucrose equivalent). Dùng pipet nhỏ
1,2 giọt vào lăng kính (thủy tinh trong)
của khúc xạ kế và đóng tấm bìa lại. Mẫu
phải trải đều trên bề mặt lăng kính. Lưu ý,
trước đó khúc xạ kế phải được hiệu chỉnh
về oBrix= 0 bằng nước cất. Tiếp đến, nhìn
vào thang chia độ qua thị kính và đọc
thang đo ở vị trí đường ranh giới chắn nó.
Sau khi đọc được kết quả thì dùng khăn
giấy lau sạch kính bằng nước.
6
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
Tính toán các thông số động học
sinh trưởng của nấm men
Hằng số tốc độ sinh trưởng (µ, h-1)
đặc trưng thể hiện sự thay đổi của mật độ
tế bào trong một đơn vị thời gian:
µ = 0.693/td (tính giữa hai thời
điểm)
Hiệu suất tạo thành tế bào trên một
đơn vị cơ chất YN/S (cell. g-1 sucrose):
YN/S = (Nt – No)/ (St – So)
Số thế hệ: n = t/ td
Thời gian thế hệ td (phút): Nt = N0
× 2t/td
Trong đó:
n: số thế hệ
td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời
gian thế hệ) Nt: số tế bào ở thời điểm t
No: số tế bào ở thời điểm bắt đầu
(giờ thứ 0)
µ: hằng số tốc độ sinh trưởng (ở
đây được xem là tốc độ gia tăng số lượng
tế bào trên một đơn vị số lượng tế bào)
YN/S: hiệu suất tạo thành tế bào
(tính theo cơ chất là đường)
St: nồng độ cơ chất (đường) ở thời
điểm t
So: nồng độ cơ chất (đường) ở thời
điểm 0 giờ
III. KẾT QUẢ-BÀN LUẬN
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
3.1. Ảnh hưởng của thời gian nhân tế bào của chủng nấm men theo theo thời
giống đến mật độ tế bào theo thời gian gian khảo sát. Trong đồ thị có thể thấy
được mật độ tế bào đạt cực đại của giờ
nhân giống khác nhau lần lượt là 12 giờ
(17.96 lnN tế bào/ml), 24 giờ (17.85 lnN
tế bào/ml), 36 giờ (17,57 lnN tế bào/ml).
Theo kết quả thì tại thời điểm 0 giờ,
môi trường nhân giống 12 giờ có mật độ
tế bào cao nhất (13,20 lnN tế bào/ml), sau
đó là môi trường nhân giống 24 giờ (13,02
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào
lnN tế bào/ml), thấp nhất là môi trường
của nấm men Saccharomyces
nhân giống 36 giờ (12,72 lnN tế bào/ml).
Cerevisiae theo thời gian nhân giống 12
Tại thời điểm lên men 0 giờ thì chủng nấm
giờ,24 giờ và 36 giờ
men Saccharomyces Cerevisiae đã tiến
Dựa vào kết quả đồ thị có thể thấy
vào pha log của quá trình sinh trưởng mà
được rằng trong thí nghiệm này chỉ thu
không cần trải qua pha lag (pha thích
được kết quả biểu diễn log phase (pha log)
nghi). Sau đó là thời điểm 1 giờ mật độ tế
và stationary phase (pha cân bằng) mà
bào tăng lên nhanh chóng do sự sinh
không có lag pha (pha thích nghi). Điều
trưởng diễn ra mạnh mẽ. Vào lúc 3 giờ thì
này xảy ra bởi vì chuẩn bị môi trường
pha log kết thúc, sự sinh trưởng của tế bào
nhân giống và lên men có độ pH (pH=6)
chủng nấm men Saccharomyces
và lượng nấm men cấy vào (10%) không
Cerevisiae bắt đầu chậm lại tiến vào điểm
thay đổi trong thí nghiệm.
uốn. Tại điểm uốn mặc dù tế bào nấm men
Trong quá trình nuôi cấy chủng
vẫn phát triển nhưng rất chậm bắt đầu từ
nấm men Saccharomyces Cerevisiae
giờ thứ tư đến giờ thứ bảy. Sự sinh trưởng
trong cùng một điều kiện pH không đổi
của tế bào nấm men chậm lại đến giờ thứ
(pH = 6) và lượng nấm men cấy vào
8 thì ngừng tăng mật độ tế bào, tại đây mật
(10%). Sự thay đổi điều kiện thời gian của
độ tế bào đạt đến giá trị cực đại và bắt đầu
môi trường nhân giống lần lượt là 12 giờ,
suy giảm nhẹ sau đó. Nguyên nhân là do
24 giờ và 36 giờ có ảnh hưởng đến mật độ
sự suy giảm của chất dinh dưỡng có trong
7
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
môi trường (saccharose) và sự tích lũy các trường nhân giống 36 giờ này ngắn hơn,
độc tố sinh ra trong quá trình sinh trưởng chỉ diễn ra trong 2 khoảng thời gian là 8
của nấm men. Tại giờ thứ 8 đến giờ thứ 10 giờ và 9 giờ. Sau đó vào giờ thứ 10 đã diễn
nấm men đi vào pha ổn định, mật độ tế bào ra quá trình suy vong.
không còn tăng lên nữa. Sau đó đến giờ 3.2 Ảnh hưởng của thời gian
thứ 11 và giờ 12 mật độ tế bào có xu nhân giống đến tỷ lệ tế bào sống của
hướng suy giảm nhẹ. Điều này là do sự nấm men Saccharomyces Cerevisiae
cạn kiệt chất dinh dưỡng và sự tích tụ độc theo thời gian.
tố tăng lên ngày càng nhiều trong môi
trường lên men do sự sinh trưởng.
Tương tự như môi trường nhân
giống 12 giờ khi nhân giống chủng nấm
men Saccharomyces Cerevisiae trong 24
giờ thì khi đưa vào môi trường lên men
pha log đã diễn ra tại 0 giờ mà không cần
trải qua pha lag. Pha log diễn ra sự sinh
trưởng của tế bào nấm men một cách
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ tế bào
nhanh chóng. Đến khi 3 giờ thì pha log kết
sống của nấm men Saccharomyces
thúc, tiến đến điểm uốn. Điểm uốn cũng
Cerevisiae theo thời gian nhân giống 12
kéo dài từ giờ thứ 4 đến giờ thứ 7, khi này
giờ, 24 giờ, 36 giờ
mật độ tế bào có tăng nhưng rất chậm. Vào
Từ dữ liệu kết quả thu được có thể
giờ thứ 8 thì mật độ tế bào đạt cực đại sau
thấy được tỉ lệ phần trăm tế bào sống của
đó tiến và pha cân bằng nối tiếp ở giờ thứ
chủng nấm men Saccharomyces
9 và giờ thứ 10. Sau đó vào giờ thứ 11 và
Cerevisiae ở 3 điều kiện thời gian nhân
giờ thứ 12 bắt đầu có dấu hiệu suy giảm
giống khác nhau 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ
mật độ tế bào.
đều trên 70%. Với tỉ lệ tế bào sống trung
Ở môi trường nhân giống 36 giờ thì
bình cao nhất ở các điều kiện nhân giống
vào thời điểm 0 giờ vẫn đã diễn ra pha log
có thời gian nhân giống 12 giờ là 91,97%,
và kết thúc pha log vào thời điểm 3 giờ.
Tuy nhiên thời gian pha cân bằng ở môi
8
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
thời gian nhân giống 24 giờ là 87,53% và
thời gian nhân giống 36 giờ là 81,70%.
Với kết quả thu được thì khi đưa
giống từ các giờ nhân giống vào môi
trường lên men, không có sự thay đổi của
pH nên pha log đã diễn ra và tăng mật độ
tế bào mạnh mẽ. Cụ thể ở môi trường nhân
giống 12 giờ tỉ lệ tế bào sống tăng lên từ
79,84% lên 91,97%, môi trường nhân
giống 24 giờ tỉ lệ tế bào sống tăng lên từ
74,33% lên 87.53%, môi trường nhân
giống 36 giờ tỉ lệ tế bào sống tăng từ
73,72% lên 81,70%. Sau đó chúng từ từ
tiến vào pha cân bằng và bắt đầu có dấu
hiệu suy giảm. Điều này xảy ra là vì ở môi
trường nhân giống 12 giờ chủng nấm men
có đủ lượng cơ chất và chưa tích tụ nhiều
độc tố sinh ra trong quá trình sinh trưởng
trong bình nhân giống nên thời gian sinh
trưởng ra nhiều tế bào sống kéo dài đến 7
giờ. Còn ở môi trường nhân giống 24 giờ
và 36 giờ lượng cơ chất trong bình nhân
giống dần cạn kiệt cũng như là nhiều chất
độc hại là sản phẩm từ quá trình sinh
trưởng tích tụ lại làm giảm tỉ lệ sống của
chúng nên chúng có tỉ lệ tế bào sống phát
triển nhanh chỉ đến giờ thứ 5.
Trong quá trình sinh trưởng chủng
nấm men Saccharomyces Cerevisiae cần
phải duy trì được pH nội bào không thay
9
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
đổi. Có nhiều enzyme hoạt động trong tế
bào nấm men trong suốt quá trình tăng
trưởng và trao đổi chất. Chủ yếu chủng
giống Saccharomyces Cerevisiae phát
triển tốt trong môi trường acid. Khi độ pH
ngoại bào lệch khỏi mức tối ưu, tế bào
nấm men cần đầu tư năng lượng để bơm
vào hoặc đẩy ra các ion hydro nhằm duy
trì độ pH nội bào tối ưu (Narendranath và
cộng sự, 2001; Thomas, K. C và cộng sự,
2002). Nên khi phát triển trong môi
trường nhân giống tùy từng khoảng thời
gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ thì tỉ lệ tế bào
sống sẽ có sự chênh lệch do sự sụt giảm
cơ chất có trong bình nhân giống. Khi đưa
qua bình lên men thì tỉ lệ phần trăm của tế
bào sống cũng sẽ phát triển tương tự như
trong bình nhân giống.
3.3 Ảnh hưởng của thời gian nhân
giống đến tỷ lệ tế bào nảy chồi của nấm
men Saccharomyces Cerevisiae theo
thời gian.
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ tế bào
nảy chồi của nấm men Saccharomyces
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
Cerevisiae theo thời gian nhân giống 12
giờ,24 giờ, 36 giờ.
Dựa vào kết quả thu được ta có thể
thấy được tỉ lệ nảy chồi ở điều kiện nhân
giống ở pH=6 có thời gian nhân giống
khác nhau 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ có sự
tăng lên nhanh chóng. Cụ thể trong suốt
pha log đến khi tiến vào pha cân bằng ở
môi trường nhân giống 12 giờ tăng (từ
17,87% lên 39,27%), môi trường nhân
nhân giống 24 giờ (tăng từ 16,15% lên
17,85%), môi trường nhân giống 36 giờ
(tăng từ 15,21% lên 32,27%). Ở tất cả môi
trường, sự sinh sản mạnh của tế bào chồi
tăng mạnh ngay ở những giờ đầu tiên của
pha log, sau đó tăng chậm lại khi vào điểm
uốn vì lúc này lượng cơ chất tồn tại trong
môi trường nhiều, chủng nấm men
Saccharomyces Cerevisiae đã thích nghi
được với môi trường lên men ngay lập tức
nên tích cực sinh trưởng, phát triển và
phân chia tế bào.
Vì tế bào nảy chồi sẽ phát triển
thành tế bào sống mới nên khi tế bào sống
tăng thì có nghĩa là tế bào nảy chồi cũng
sẽ tăng. Sau thời gian nuôi cấy trong môi
trường lên men, khi tiến vào pha cân bằng
chủng nấm men Saccharomyces
Cerevisiae có tỉ lệ nảy chồi bắt đầu suy
giảm. Nguyên nhân là do cơ chất cho sự
10
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
sinh trưởng bắt đầu cạn kiệt, một số chất
độc hại do sự trao đổi chất trong quá trình
phát triển tích tụ nhiều, nên đã kiềm hãm
ngăn cản sự phát triển và phân chia tế bào.
Khi các tế bào nấm men sinh sôi, phát
triển dẫn đến cạn kiệt các chất dinh dưỡng
sẵn có, chúng bước vào giai đoạn ổn định
được đặc trưng bởi sự ngừng chu kỳ tế bào
và những thay đổi sinh lý, sinh hóa và
hình thái cụ thể. Những thay đổi này bao
gồm sự dày lên của thành tế bào, sự tích
tụ carbohydrate dự trữ và khả năng chịu
nhiệt (M Werner-Washburne, et al, 1993).
3.4 Ảnh hưởng của thời gian nhân
giống đến sự thay hàm lượng đường
tổng theo thời gian
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi
của nồng độ lượng đường đến nấm men
Saccharomyces Cerevisiae theo thời
gian nhân giống 12 giờ,24 giờ và 36 giờ
Hàm lượng đường tổng trong môi
trường nuôi cấy có sự ảnh hưởng đến quá
trình sinh trưởng của chủng giống nấm
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
men. Ở pha log, tế bào phát triển nhanh
nên tốc độ trao đổi chất lớn đòi hỏi tiêu
thụ đường saccharose nhiều hơn, vì vậy
hàm lượng đường giảm nhanh để đáp ứng
được nhu cầu cần cơ chất để sinh trưởng
(Liu và cộng sự, 2015). Ở 24h đầu thì hàm
lượng đường giảm mạnh, sau đó thì có xu
hướng cân bằng và giảm từ từ, cuối cùng
khi hàm lượng đường cạn kiệt thì vi sinh
vật sẽ bắt đầu bước vào pha suy vong.
(Siregar và cộng sự,2019).
Từ kết quả thu nhận được có thể
thấy được hàm lượng đường trong các môi
trường nuôi cấy đều giảm. Cụ thể ở môi
trường nhân giống 12 giờ hàm lường
đường giảm nhiều nhất (từ 9,9% xuống
5,9%), môi trường nhân giống 24 giờ
giảm ít hơn (từ 9,8% xuống 6,0%) và giảm
hàm lượng đường ít nhất là ở môi trường
nhân giống 36 giờ (từ 9,9% xuống 6,8%).
Điều này xảy ra là vì đường saccharose là
nguồn dinh dưỡng cho nấm men phát
triển, mà ta thu nhận được kết quả từ mật
độ tế bào ở môi trường nhân giống 12 giờ
là cao nhất và 36 giờ là thấp nhất nên số
liệu hàm lượng đường thu nhận được là
hợp lý. Hàm lượng đường tổng đo được ở
0h không phải 10% là vì chủng nấm men
Saccharomyces Cerevisiae đã tiến vào
pha log nên khi đưa vào môi trường lên
11
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
men đã lấy đi cơ chất có trong môi trường
để tiếp tục sinh trưởng nên mới có sự
chênh lệch (Nguyen Quang Thao và cộng
sự,2016).
3.5 Ảnh hưởng của thời gian nhân
giống đến sự sinh trưởng của tế bào tại
pha log.
Hình 3.5 Đồ thị pha Log của nấm men
Saccharomyces Cerevisiae ở điều kiện
thời gian nhân giống 12 giờ,24 giờ và
36 giờ
Từ kết quả thu được ta có được
đường cong pha sinh trưởng của chủng
nấm men Saccharomyces Cerevisiae theo
từng khoảng thời gian nhân giống 12 giờ,
24 giờ và 36 giờ. Mẫu có thời gian nhân
giống 12 giờ có pha log bắt đầu từ lúc 0
giờ, pha log diễn ra từ 0 – 3 giờ, pha lag
không diễn ra do môi trường nhân giống
và lên men có cùng điều kiện pH cho
chủng nấm men phát triển mà không cần
phải thích nghi với môi trường mới.
Tương tự với thời gian nhân giống là 24
giờ và 36 giờ thì pha log cũng diễn ra ngay
từ lúc cho vào môi trường lên men, diễn
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men
ra trong khoảng thời gian từ 0-3 giờ đầu.
Sau đó tiến vào điểm uốn tại đây, chủng
nấm men phát triển chậm lại và dừng sinh
trưởng khi vào pha cân bằng.
3.6 Các thông số động học sinh trưởng
Từ các thông số thu được, trong cả 3 môi
trường nhân giống cho chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae với thời gian
khác nhau 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ đều
không xuất hiện lag phase mà đường cong
sinh trưởng trực tiếp đi vào log phase và
phát triển. Tại vì không có sự thay đổi pH
giữa môi trường nhân giống và lên men
chúng đều có pH = 6 và cũng như có thời
gian nhân giống khá dài nên vi sinh vật đã
sinh trưởng tốt thích nghi với môi trường
lên men ngay lập tức để tiến vào pha log.
Môi trường lên men có thời gian nhân
giống là 12 giờ có thời gian thế hệ ngắn
nhất 0,57 giờ, tiếp đến là môi trường có
thời gian nhân giống 36 giờ với thời gian
thế hệ 0,60, và thời gian thế hệ kéo dài
nhất 0,62 là ở môi trường nhân giống 24
giờ. Thời gian thế hệ càng ngắn thì tốc độ
sinh trưởng của tế bào càng nhanh và hiệu
suất tạo thành tế bào càng cao. Do đó thời
gian nhân giống là 12 giờ thích hợp nhất
cho việc nuôi cấy tế bào.
Thông qua các thông số kết quả có thể
thấy được trong 3 môi trường có thời gian
12
GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
nhân giống khác nhau 12 giờ, 24 giờ và 36
giờ thì môi trường nhân giống 12 giờ là
môi trường có thời gian thế hệ ngắn nhất,
tốc độ sinh trưởng cao nhất nên là thời
gian nhân giống tối ưu nhất. Đây là
khoảng thời gian nhân giống phù hợp để
tạo điều kiện cho chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae sinh trưởng và
sản xuất sinh khối.
Hình 3.6 Các thông số động học sinh
trường
IV. KẾT LUẬN
Khi khảo sát việc thay đổi thời gian
nuôi cấy (12h, 24h, 36h) và giữ nguyên
pH của môi trường lên men (pH=6), ta
thấy được sự ảnh hưởng khi thay đổi thời
gian nuôi cấy đến động học sinh trưởng
của nấm men Saccharomyces Cerevisiae.
Thời gian nhân giống thay đổi ảnh hưởng
đến mật độ tế bào (lnN/ml), tỉ lệ tế bào
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn
sống (%), tỉ lệ tế bào nảy chồi (%), hàm nghiệm, với môi trường nuôi cấy có
lượng đường tổng (%) và tốc độ sinh pH=6, môi trường lên men có pH=6 và
trưởng đặc trưng của pha log dạng lnN của thời gian nhân giống là 12h là điều kiện
nấm men Saccharomyces Cerevisiae. phù hợp cho nấm men Saccharomyces
Qua khảo sát ta thấy được, trong ba cerevisiae sinh trưởng và sản xuất ra sinh
môi trường nhân giống có thời gian nhân khối.
giống khác nhau (12h,24h,36h) thì môi
trường nhân giống có thời gian là 12h là
môi trường có thời gian thế hệ ngắn nhất,
tốc độ sinh trưởng cao nhất và hiệu suất
tạo thành tế bào cao nhất, điều này cho
thấy trong ba môi trường nhân giống
(12h,24h,36h) thì môi trường nhân giống
có thời gian là 12h là môi trường phù hợp
nhất với môi trường lên men có pH=4-6
để tạo điều kiện tối ưu nhất cho nấm men
Saccharomyces Cerevisiae sản xuất ra
sinh khối cao nhất và sinh trưởng tốt nhất.
Khi tốc độ sinh trưởng nhanh, thời gian
thế hệ ngắn thì hiệu suất tạo thành tế bào
nấm men cao hơn. Sau khi thực hiện khảo
sát, nhóm thấy rằng việc chọn thời gian
nhân giống cho môi trường nhân giống là
việc vô cùng quan trọng để cho quá trình
lên men đạt được mục đích là nấm men
Saccharomyces Cerevisiae sản xuất ra
sinh khối cao nhất. Việc xác định được
thời gian của môi trường nhân giống và
pH môi trường lên men phù hợp nhất sẽ
tối ưu được hiệu quả. Trong bài thí
13
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO 5. Kwiatkowski, S., & Kwiatkowski,

1. Arroyo-López FN, Durán S. E. (2012). Yeast
Quintana MC, Garrido Fernández (Saccharomyces cerevisiae)
A (2006) Use of the generalized z- glucan polysaccharides-
value concept to study the effects occurrence, separation and
of temperature, NaCl application in food, feed and
concentration and pH on Pichia health industries. The complex
anomala, a yeast related to table world of polysaccharides, pp. 47-
olive fermentation. Int J Food 70.
Microbiol 106: 45–51. 6. Liu, X., et al. (2015). Effect of
2. D'Amato D, Corbo MR, Del initial pH on growth
Nobile MA, Sinigaglia M, (2006) characteristics and fermentation
Effects of temperature, ammonium properties of Saccharomyces
and glucose concentrations on cerevisiae Journal of food science,
yeast growth in a model wine 80(4), M800-M808.
system. Int J Food Sci Technol 41: 7. M Werner-Washburne, et al.
1152–1157. (1993). Stationary phase in the
3. Fleet, G. M. (1993). Yeasts- yeast Saccharomyces cerevisiae.
growth during fermentation. ASM Journals.
WQine Microbiology & 8. Mitchison, J.M., 1971. The
Biotechnology, pp. 27-54. Biology of the cell cycle
4. Foss, B. A., Johansen, T. A., & Cambridge Univ. Press, London
Sørensen, A. V. (1995). Nonlinear and New York, pp.1-33.
predictive control using local 9. Narendranath, N. V., K. C.
models—applied to a batch Thomas, and W. M. Ingledew.
fermentation process. Control (2001). Acetic acidand lactic acid
Engineering Practice, 3(3), pp. inhibition of growth of
389-396. Saccharomyces cerevisiae by

14
Báo cáo Thí nghiệm Công nghệ lên men GVHD: PGS.TS. Trịnh Khánh Sơn

differentmechanisms. J. Am. Soc. Brewer’s yeast (Saccharomyces

Brew. Chem. 59:187–194.20. cerevisiae) slurry in replacement
10. Neelakantam V. Narendranath* for soybean meal. Journal of
and Ronan Power, (2005). Nutrition and Metabolism.
Relationship between pH and 15. Nguyen Quang Thao, Nguyen Van
Medium Dissolved Solids in Quyen, Nguyen Thao Anh and
Terms of Growth and Metabolism Nguyen Thanh Dat. (2016).
of Lactobacilli and Saccharomyces Effects of fermentation conditions
cerevisiae during Ethanol on ethanol production from corn
Production. Applied and by Saccharomyces cerevisiae
Environmental Microbiology, MS42. Journal of science of
May 2005, p. 2239–2243. HNUE, Vol. 61, no.9, pp. 169-
11. Ngô Thị Huyền Trang & Vũ Văn 176.
Hạnh (2017). Nghiên cứu tối ưu 16. Siregar, J. S., Ahmad, A., &
điều kiện sản xuất sinh khối nấm Amraini, S. Z. (2019, November).
men saccharomyces cerevisiae Effect of time fermentation and
sc2. 75. Vietnam Journal of saccharomyces cerevisiae
Biotechnology, 15(3), pp. 581- concentration for bioethanol
588. production from empty fruit
12. Nguyễn Quang Thảo (2000) bunch. In Journal of Physics:
Nghiên cứu lên men vang vải Conference Series (Vol. 1351, No.
thiều. Luận án Tiến sĩ: 100–105 1, p. 012104). IOP Publishing.
13. Soares, E. V. (2011). Flocculation
in Saccharomyces cerevisiae: a
review. Journal of applied
microbiology, 110(1), pp. 1-18
14. Solomon, S. G., Ataguba, G. A., &
Itodo, G. E. (2017). Performance
of Clarias gariepinus fed dried

15