Fluorymetria

Emisja promieniowania

Inkadescencja Luminescencja:
(wzbudzenie termiczne)
radioluminescencja
chemiluminescencja
triboluminescencja
bioluminescencja
fotoluminescencja:
fluorescencja, fosforescencja

1
Fluorymetria

Fluorymetria jest metodą

ilościową polegającą na
pomiarze intensywności
fluorescencji emitowanej
przez wzbudzone światłem
cząsteczki.

Diagram przejść elektronowych

S2
T2
S1
ISC

T1

A IC F P ISC

S0

2
Diagram przejść elektronowych

Absorpcja 10-15 – 10-14 s

Przejścia bezpromieniste
Oscylacyjne, rotacyjne 5 x 10-12 s
Konwersja wewnętrzna 10-12 –10-7 s
Przejście międzysystemowe 10-12 –10-7 s

Przejścia promieniste (fotoluminescencja)

Fluorescencja 10-9 – 10-5 s
Fosforescencja 10-4 – 10 s

Diagram przejść elektronowych

Z wyższych poziomów elektronowych następuje szybka
dezaktywacja bezpromienista do stanu S1

Na poziomie S1 cząsteczka może wytracić energię:

-promieniście, na drodze fluorescencji,
-bezpromieniście przechodząc do S0 (internal conversion, IC),
-bezpromieniście, przechodząc do tripletu, na drodze tzw.
przejścia międzysystemowego (intersystem crossing, ISC).

Na poziomie T cząsteczka może wytracić energię:

- promieniście, na drodze fosforescencji,
-bezpromieniście przechodząc do S0(ISC),
-w wyniku wygaszania,
- ulega reakcjom fotochemicznym.

3
Aleksander Jabłoński
1898-1980

Przyrządy do pomiarów fluorescencji

Z MW P

ME

D R

Fluorymetry
Schemat blokowy

Spektrofluorymetry

4
Przyrządy do pomiarów fluorescencji

Fluorymetr
- pomiar intensywności fluorescencji
- dwa monochromatory - filtry
- analiza ilościowa

Spektrofluorymetr Fluorymetry

- pomiar widm wzbudzenia i emisji

- dwa monochromatory – siatki
dyfrakcyjne
- analiza jakościowa
Spektrofluorymetry

Przyrządy do pomiarów fluorescencji

Fluorymetry
Fluorymetry

Spektrofluorymetry

5
 Przyrządy do pomiarów fluorescencji

Adapted from Theodoro Hazlett Principles of Fluorescence Techniques Genova, ItalyJune 14-16, 2004

Przyrządy do pomiarów fluorescencji

Fibre optics...

6
 Widma emisji fluorescencji
Widmo emisji Widmo emisji fluorescencji
IF / jednostki umowne

I F = f ( EM )
0.8

0.4
 EX = const
0.0
300 400 500 600 700
 / nm

Widmo
Widmowzbudzenia
absorpcji Widmo emisji
IF / jednostki umowne

0.8

0.4

0.0
300 400 500 600 700
 / nm
Widmo absorpcji i emisji

7
 Widma emisji fluorescencji

Widmo absorpcji i emisji

Widma emisji

8
 Widma emisji
Widma emisji czystych chemicznie związków charakteryzują
się występowaniem tylko jednego pasma, niezależnie od
długości fali promieniowania wzbudzającego.

Widmo emisji stanowi zwierciadlane odbicie ostatniego

długofalowego pasma w widmie absorpcji i jest
przesunięte długofalowo w stosunku do widma absorpcji
danego związku.

Przesunięcie Stokesa jest to wyrażona w cm-1 odległość

maksimum pasma emisji i maksimum najbardziej
długofalowego pasma w widmie absorpcji.

Wydajność kwantowa fluorescencji

liczba kwantów emitowanych

=
liczba kwantów absorbowanych

9
Czynniki wpływające na wydajność kwantową
fluorescencji
Czynnikiem decydującym o wysokiej wydajności kwantowej są:
wysokie wartości molowego współczynnika absorpcji, , w
szczególności w przypadku fluorescencji z poziomów ,*,
(głównie w przypadku związków o wielokrotnych skoniugowanych
wiązaniach podwójnych) i CT (silna fluorescencja w ciele stałym);
słaba fluorescencja z poziomów n,*, brak fluorescencji z
poziomów *;

sztywność cząsteczki (związki planarne);

stabilizacja rezonansem (podstawniki)

Przykłady związków
fluoryzujących

10
Czynniki wpływające na wydajność kwantową
fluorescencji
Wydajność kwantowa fluorescencji jest wielkością charakterystyczną dla związku:


Antracen w EtOH 0.27
Chlorofil a w EtOH 0.23
Chlorofil b w EtOH 0.10
Eozyna w H2O 0.16
Fluoresceina w H20/NaOH 0.85 (zielona)
Siarczan chininy w H20/1N H2SO4 0.55 (niebieska)
Rodamina B w EtOH 0.97 (czerwona)
Witamina B2 w H2O 0.26

Czynniki wpływające na wydajność kwantową

fluorescencji

20o C

25oC

Temperatura
względna intensywność fluorescencji

31oC
Rozpuszczalnik
35o C
pH
Wygaszacze (O2, Cl i in.) 40oC

43oC

nm

Rodamina B w 0.1 N HCl

11
 Wygaszanie fluorescencji

= 1 + K SV Q
F0
F

F0, F -intensywność fluorescencji,

bez i w obecności wygaszacza,
[Q] - stężenie wygaszacza
KSV -stała wygaszania, stała Sterna-
Volmera quenching constant

Intensywność fluorescencji
Dla roztworów rozcieńczonych, (bc<0.05):

IF = KΦ I0 εbc
K – stała proporcjonalności zależna od układu
pomiarowego
- wydajność kwantowa fluorescencji
I0 – intensywność promieniowania wzbudzającego
- molowy współczynnik absorpcji
b – długość drogi optycznej
c - stężenie

12
Zależność intensywności fluorescencji od
stężenia cząsteczek emitujących

If
10 -6 M

IF = KΦ I0 εbc 10-5 -10-4 M vit.B 2

10-3 -10-2M

Równanie sprawdza się wyłącznie dla roztworów, których

rozcieńczenia są rzędu ppm (part per million) czyli A = abC 
0,05. W przypadku wyższych stężeń występuje efekt filtru
wewnętrznego

Zależność intensywności fluorescencji od

stężenia cząsteczek emitujących

I0 I0 I0

IF IF

Widmo wzbudzenia
Widmo emisji
IF / jednostki umowne

0.8

0.4

0.0
300 400 500 600
 / nm
Efekt filtru wewnętrznego

13
Pomiary intensywności fluorescencji

Analiza ilościowa
•wartości intensywności fluorescencji są względne (zależą od
warunków pomiaru, przyrządu)
•jednostki intensywności fluorescencji nie są zdefiniowane

W oznaczeniach ilościowych konieczna jest kalibracja

wykonana w warunkach identycznych jak pomiary
analizowanej próbki

Pomiary intensywności fluorescencji

Wybór analitycznej długości fali

Monochromator wzbudzeniowy (pierwotny) – długość fali w zakresie

długofalowego pasma absorpcji (np. maksimum absorpcji)

Monochromator emisyjny (wtórny) – długość fali w zakresie pasma

emisji (maksimum emisji)
Z MW P

ME

D R

14
 Pomiary intensywności fluorescencji
Wybór analitycznej długości fali

0.6
Widma absorpcji
0.5
siarczanu chininy / 1N H2SO4 Widmo emisji lampy rtęciowej
0.4
Absorbancja

0.3

0.2

0.1

0.0
240 255 270 285 300 315 330 345 360 375 390
 / nm

Wykaz długości fal dla poszczególnych linii widma lampy rtęciowej:

Uwaga! „x” – zaznaczono linie silne, w nawiasach – linie bardzo słabe.

Pomiary intensywności fluorescencji

0.6
Widma absorpcji 7 Widma emisji
1.5x10
siarczanu chininy
0.5
siarczanu chininy / 1N H2SO4 toniku

0.4 wz=350 nm
Absorbancja

7
1.0x10
IF / j.u.

0.3

0.2 6
5.0x10

0.1

0.0 0.0
240 255 270 285 300 315 330 345 360 375 390 400 450 500 550 600 650 700
 / nm  / nm

15
Pomiary intensywności fluorescencji

Metody wyznaczania stężenia

Metoda krzywej wzorcowej 450

300

IF /j.u.
Metoda wzorca (zakłada liniowość 150 IF=f(c)
zależności I=f(c)
0
0 2 4 6 8 10 12-314 16 18
c / mol x dm
I WZ cWZ I X  cWZ
= cX =
IX cX I WZ

Pomiary intensywności fluorescencji

Krzywa wzorcowa
16
14 Ideal
12
FLRIntensity

10
8
6 Actual
4
2
2 4 6 8 10 12 14
Concentration

16
Zastosowania fluorymetrii
Badania ilościowe
Zastosowania podobne jak spektrofotometria UV VIS ale metody
fluorescencyjne są bardziej czułe i selektywne.

Zalety metod fluorescencyjnych

•Doskonała czułość oznaczeń – pomiar promieniowania emitowanego.
•Duża selektywność – nie wszystkie związki wykazują fluorescencję; możliwość wyboru
długości fali promieniowania wzbudzającego i emitowanego.
•Szeroki zakres liniowości oznaczeń.

Ograniczenia metod fluorescencyjnych

•Reakcje fotochemiczne.
•Zależność intensywności fluorescencji od temperatury, pH, siły jonowej.
•Wygaszanie fluorescencji (tlen, temperatura, zanieczyszczenia, stężenie).

Zastosowania fluorymetrii
Badania ilościowe
Zastosowania podobne jak spektrofotometria UV VIS ale metody
fluorescencyjne są bardziej czułe i selektywne.

Zalety metod fluorescencyjnych

•Doskonała czułość oznaczeń – pomiar promieniowania emitowanego.
•Duża selektywność – nie wszystkie związki wykazują fluorescencję; możliwość wyboru
długości fali promieniowania wzbudzającego i emitowanego.
•Szeroki zakres liniowości oznaczeń.

Ograniczenia metod fluorescencyjnych

•Reakcje fotochemiczne.
•Zależność intensywności fluorescencji od temperatury, pH, siły jonowej.
•Wygaszanie fluorescencji (tlen, temperatura, zanieczyszczenia, stężenie).

17
Zastosowania fluorymetrii –analiza ilościowa

Oznaczanie stężenia na podstawie pomiaru intensywności

fluorescencji:
- związków naturalnie wykazujących fluorescencję (np.
witamina E, B2, B6, chlorofil, wielopierścieniowe węglowodory
aromatyczne WWA)
- przeprowadzonych we fluoryzujące pochodne w wyniku
reakcji chemicznych, reakcji kompleksowania (np. kationy:
magnez, glin, selen, kadm, wapń; aniony: cyjanki, fluorki, jodki)
-metoda detekcji w chromatografii cieczowej

Zastosowania fluorymetrii

H 2O OH2
Al3+
OH HO O OH

N N SO3Na N N SO3Na

Sól sodowa kwasu 2,2’-dihydroksy-1,1’-azanaftalen-3-sulfonowego

Pontachrome BBR

18
Zastosowania fluorymetrii

Metoda detekcji w chromatografii cieczowej

A (+)-T

Relative fluorescence (a.u.)

-T

-T

0 2 4 6 8 10 12 14

Retention time [min]

Analiza chromatograficzna tokoferoli w oleju sojowym, długość

fali wzbudzenia 295 nm, emisji 325 nm.

Zastosowania fluorymetrii
Produkty spożywcze, chemia rolna:
nieorganiczne (kationy: magnez, glin, selen, kadm, wapń;
aniony: cyjanki, fluorki, jodki.);
witaminy;
białka (mleko i produkty spożywcze);
barwniki (chlorofil);
Pestycydy i insektycydy (analiza śladowa).
Zanieczyszczenie środowiska:
zanieczyszczenie wody, powietrza (WWA, insektycydy,
pestycydy)
metale toksyczne (beryl, ołów, kadm)
Medycyna, chemia kliniczna, biochemia:
elektrolity (wapń, magnez, siarczany, fosforany), lipidy,
proteiny, aminokwasy, enzymy,leki, metabolity (glukoza we
krwi, ketony, porfiryny).

19
Zastosowania fluorymetrii
Sensory - miniaturowe przenośne urządzenia do
określonych celów analitycznych:
monitorowanie stężenia gazów w środowisku ,
w wodzie. (np, O2, CO, CO2, amoniaku)

Sensor tlenu

FLUOROPROBE®

Zastosowania fluorymetrii

20
Monitorowanie wód oceanicznych

21
22