DIAGN. LAB.

1976, XII, Nr 4

PIOTR KANABUS

WYDALANIE KINURENINY I INNYCH METABOLITOW PRZEMIANY

TRYPTOFANU W KWAS NIKOTYNOWY W MOCZU DZIECI

2 Pracowni Psychofarmakologii Kliniki Psychiatrycznej AM w Warszawie

Kierownik: doc. dr hab. med. H. Wardaszko-Łyskowska

Kinureninę, 3-hydroksykinureninę, kwas ksanturenowy i kwas 3-hy-

droksyantranilowy izolowano z moczu na kolumnie z Dowex 50 W
i oznaczano kolorymetrycznie i spektrofotometrycznie. Badania przepro-
wadzono przed i po doustnym obciążeniu L-tryptofanem w dawce 0,1 gł
Ikg c.c. w dzieci zdrowych i w dwóch grupach dzieci chorych. Wyniki
pozwalają ocenić stan czynnościowy początkowego odcinka drogi kinu-
reninowej i wskazują na obecność charakterystycznych zaburzeń u dzieci
upośledzonych umysłowo. `

Zakurzenia przemiany tryptofanu stwierdzono w wielu chorobach.

Szczególnie interesują się tym zagadnieniem badacze, zajmujący się pato-
genezą chorób psychicznych i niedorozwoju umysłowego. Wynika to z roli,
jaką spełnia serotonina — jeden z neurotransmiterów a zarazem metabolit
tryptofanu — w funkcji o.u.n. Natomiast mniej uwagi poświęcili oni
dotychczas przemianie tryptofanu w kwas nikotynowy (niacynę) i jego
amid (nikotynamid). Wydaje się, że dwie przyczyny są głównie odpowie-
dzialne za mniejsze zainteresowanie tym szlakiem metabolicznym, nazy-
wanym kinureninowym lub T-N (ryc. 1).
Pierwsza wynika z przesłanek teoretycznych — ze względu na fakt,
że jego produkt: niacyna zwykle dopływa z dostatecznej ilości ze źródeł
egzogennych, fizjologiczne znaczenie tego szlaku dla ustroju pozostaje
niejasne. Druga ma charakter praktyczny i wiąże się ze sprawą metodyki
badań. Mianowicie szlak T-N — w przeciwieństwie do krótkiej drogi
serotoninowej -— jest rozgałęziony i obejmuje eo najmniej kilkanaście
metabolitów. Obydwie te przyczyny sprawiają, że badania nad szlakiem
Т-М u człowieka są związane z licznymi trudnościami, zarówno koncep-
cyjnymi, jak i technicznymi. Dla zilustrowania tych trudności można
przytoczyć chociażby fakt istnienia rozbieżności zdań w tak podstawowej
sprawie jak to, jaka część tryptofanu przyjmowanego dziennie z pokar-
mem (500—900 mg, 12) wchodzi na tory drogi serotoninowej, a jaka — na
szlak T-N. W przypadku drogi serotoninowej ma to być frakcja rzędu
1%/o (14) до 10%/ (7), w przypadku szlaku T-N — od 10% (1, 6) do 900/0 (7).
Price i wsp. zalecają oznaczanie możliwie dużej liczby metabolitów
w małych grupach osobników — a nie jednego lub dwóch metabolitów
w licznych grupach; opracowali oni metodę pozwalającą w ramach jednej
procedury oznaczać kilka metabolitów szlaku T-N (11). Niestety tylko
dwa z nich to metabolity głównego ciągu tego szlaku: kinurenina (K)
i 3-hydroksykinurenina (HK).
230 P. Kanabus a Nr 4

po: I
Q
Z CH,-CH-COOH €-CH,—CH-COOH CH; —CH-COOH
I | | м, 2 7 NH; UH
NH; i
NH,
N
H
TRYPTOFAN , KINURENINA ЕЕ; NYLOALANINA

[pan [sae

. OH в о
R & сн, сн-соон CH,-CH-COOH
Z COOH l NH, NH 2 HO . NHMa
H OH |
KWAS 3-0H-KINURENINA TYROZYNA
KSANTURENOWY
. |= | _

HO COOH |
CO A R KH

NH, 2 ‘
OH "
KWAS 3-0H-ANTRANILOWY

0.
Oo C—NH, 4 COOH N A D

O N Sy NA DP
CH, . | KWAS NIKOTYNOWY .

N’-METYLO-~
2-PIRYDONO-
5-KARBOKSYAMID

Ryc. 1. Skrécony schemat przemiany tryptofanu poprzez kinurenine do kwasu niko-

tynowego (I) oraz reakcja hydroksylacji fenyloalaniny do tyrozyny (ТГ.

W niniejszej pracy opisano modyfikację metody Price'a i wsp. (11). Mo-

dyfikacja ta polega na wprowadzeniu do metody oryginalnej szeregu ele-
mentów innych metod. Dzięki temu uzyskano sposób postępowania po-
zwalający na oznaczenie w jednej próbce moczu i przy użyciu jednej
kolumny jonowymiennej trzech pierwszych metabolitów głównego ciągu
szlaku T-N: K, HK i kwasu 3-hydroksyantranilowego (HA) oraz ważnego
metabolitu ubocznego: kwasu ksanturenowego (XA). Przy użyciu zmody-
fikowanej metody można ponadto oznaczać inne metabolity, podobnie jak
przy użyciu metody oryginalnej (11). Praktyczną użyteczność opisanej
wyżej modyfikacji określono na podstawie danych, uzyskanych u dzieci
zdrowych i w dwóch grupach dzieci chorych.

MATERIAŁ I METODYKA

Badane osoby podzielono na trzy grupy:

Grupa I obejmuje 7 dzieci zdrowych, w wieku 7—14 lat, które nie otrzymywały
żadnych leków, w tym preparatów zawierających witaminy.
Nr 4 Wydalanie kinureniny u dzieci 231

Do grupy II włączono 7 dzieci w wieku 4—13 lat z różnymi zaburzeniami meta-

bolicznymi i stanami, które mogą prowadzić do intensyfikacji przemiany na dro-
dze T-N, lub otrzymujące leki,które mogą dawać taki efekt. Grupa ta jest bardzo
zróżnicowana z klinicznego punktu widzenia i obejmuje m.in. dziewczynkę z zespo-
łem Willi-Prader, chłopca z wrzodem dwunastnicy, rekonwalescenta po mononukleo-
zie zakaźnej, przyjmującego Encorton, a także dziecko zdrowe, przyjmujące multi-
witaminę.
Wszyskie dzieci z grupy I i II w czasie przeprowadzania badań przebywały
w oddziale pediatrycznym; w czterech przypadkach zbiórki moczu przeprowadzono
jednocześnie u dziecka z grupy I i II -- t.zn. przy tej samej diecie.
Grupę III stanowi 5 dzieci w wieku 5—12 lat z głębokim niedorozwojem umy-
słowym, przebywających stale w domach specjalnej opieki. U trojga z nich na
podstawie dodatniej próby Fóllinga i wysokiego poziomu fenyloalaniny we krwi
(około 20 mg/100 ml) rozpoznano fenyloketonurię. U pozostałych przyczyna niedoroz-
woju nie była znana i dzieci te zakwalifikowano jako niezróżnicowany, głęboki nie-
dorozwój umysłowy (15). Niektóre z tych dzieci otrzymywały leki przeciwdrgaw-
kowe. :
Próba obciążenia tryptofanem
Przeprowadzono dwie dobowe zbiórki moczu. Po zakończeniu pierwszej i przed
rozpoczęciem drugiej podawano doustnie L.-tryptofan (odczynnik 1) w dawce 0,1 g/kg
ciężaru ciała. Kompletność zbiórek moczu sprawdzano przy pomocy oznaczeń krea-
tyniny. Mocz zakwaszano stężonym kwasem solnym i przechowywano w tempera-
turze —207C.
Odczynniki
1. L-tryptofan produkcji firmy Reanal,
2. Żywica Dowex 50 W X 12 (200—400 mesh) produkcji firmy J. T. Baker Chemi-
cal Co., ,
3. Wzorce K, HK, XA i HA firm Koch-Light i Sigma,
4. Dwuchlorowodorek N-(1-naftyleno)-etyleno-dwuaminy produkej firmy Loba-che-
mie.

Przygotowanie kolumny z żywicy Dowex

Kolumnę przygotowuje się wg przepisu Price'a (10). Żywicę wlewa się w postaci
gęstej zawiesiny do rurki o wymiarach 56 X 1 cm aż do wytworzenia słupka wyso-
kości 5 cm. Poleca się używanie rurki zawierającej u dołu, tuż nad ujściem, płytkę
ze szkła spiekanego a u góry zakończonej szlifem, umożliwiającym przyłączenie
zbiornika o pojemności 100 ml (zbiornik ułatwia wymywanie XA). Przed każdym
użyciem kolumnę równoważy się poprzez przemycie 20 ml 0,1 N HCl. Po każdym
użyciu przemywa się kolumnę 40 п] 8 М НС! 1 200 ml H,O.
Autorzy metody oryginalnej (11) zalecają przyspieszenie wymywania przez użycie
sprężonego powietrza. Doświadczenie autora wskazuje, że prowadzi to do ściśnięcia
kolumny i efekt jest odwrotny do zamierzonego.

Hydroliza
Do próbek moczu, odpowiadających 2% zbiórki sprzed obciążenia i 0,5% zbiórki
po obciążeniu tryptofanem, dodaje się tyle HCI, aby jego końcowe stężenie wyniosło
1 N. Zakwaszone próbki przesącza się przez bibułę i wstawia do wrzącej łaźni wod-
nej (13); po 1 godzinie próbki ochładza się, sączy ponownie i dodaje się do nich
9 objętości HO.

Chromatografia kolumnowa
Próbkę wprowadza się na kolumnę i pozostawia do przesączenia pod wpływem
siły ciężkości (w ten sam sposób postępuje się z rozpuszczalnikami, używanymi
w dalszym przebiegu analizy). Kolumnę przemywa się 40 ml porcjami 0,1 N, 0,5 М
 232 P. Kanabus Мг 4

i1 N HCI (frakcje te można zebrać oddzielnie i oznaczyć w nich metabolity trypto-

franu, zgodnie z przepisem Price'a i wsp.) (11).
Następnie kolunmę przemywa się
20 ml H.O, przy czym frakcję tę odrzuca się, a XA wymywa 150 ml H,O (8). Z kolei
40 ml 2,4 N HC] eluuje się z kolumny HA, a potem 40 ml 5 N HCI-KiHK.

Chromatografia bibułowa
10 ml porcje frakcji 2,4 Ni5 N HCI suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem nad
chlorkiem wapnia i wodorotlenkiem sodu. Pozostałość rozpuszcza się:w małej obje-
tości 50%/ etanolu i nakłada na arkusze bibuły Whatman 1. Na jeden z arkuszy
nakłada się 0,2 ml stężonej frakcji wodnej (patrz niżej). Chromatografię przepro-
wadza się techniką zstępującą: w pierwszym kierunku w układzie n-butanol — kwas
octowy — woda (12: 3:5), w drugim kierunku w 20% wodnym roztworze KCl (3).
Po wysuszeniu chromatogramy ogląda się w świetle ultrafioletowym, a potem arku-
sze, na które nałożono próbki frakcji kwasu solnego, barwi się przez spryskiwanie
lub zanurzenie ich w 0,25%/e roztworze NaNQO;, a po wysuszeniu przez kolejne spry-
skiwanie lub zanurzenie w 0,25% roztworze dwuchlorowodorku N-(1-naftyleno)-ety-
leno-dwuaminy.

Oznaczanie kwasu ksanturenowego (XA)

Frakcję wodną odparowuje się do sucha w eksykatorze obrotowym w tempera-
turze 50°C. Pozostałość rozpuszcza się w 12 ml HO. Pobiera się do probówek dwie
lub trzy porcje po 3,8 ml tej stężonej frakcji wodnej i wstawia się je do łaźni
wodnej o temperaturze +15%C. Po ochłodzeniu dodaje się 1 ml świeżo przygotowa-
nego roztworu dwuazowanego kwasu sulfanilowego (0,5% roztwór kwasu sulfanilo-
wego w 2% HC] miesza się z równą objętością świeżo przygotowanego 0,5%s wod-
nego roztworu azotynu sodu). Po 3 minutach dodaje się 0,2 ml pirydyny i kolory-
metruje przy 510 nm wobec próby odczynnikowej (2).
Wykres kalibracyjny nie jest powtarzalny; przy każdej serii oznaczeń należy więc
wykonać 2—3 punktowy wykres kalibracyjny.

Oznaczanie 3-hydroksy- kinureniny (HK) i kwasu 3-hydro-

ksy-antranilowego HA
Do 3,0 ml odpowiedniej frakcji dodaje się 0,2 ml świeżo przygotowanego 0,257/e
roztworu NaNQO>. Po 3 minutach dodaje się 0,2 ml 10%e amidosulfonianu amono-
wego (ammonium sulfamate) i dobrze miesza. Po 20—30 minutach kolorymetruje
się przy 367 nm wobec próby zerowej, zawierającej 3 ml odpowiedniej frakcji
i 0,4 mł amidosulfonianu.

Oznaczanie kinureniny (K)

Trzy próbki frakcji 5 N HCl o objętości 2,0 ml przenosi się do probówek bakte-
riologicznych, które wstawia się do zlewki z lodem. Po 5 minutach dodaje się do
każdej z nich 1,0 ml 9 N NaOH i wstawia ponownie do zlewki z lodem. Po 5 minu-
tach dodaje się 0,2 ml świeżo przygotowanego 0,25% roztworu NaNQO,, a po dalszych
3 minutach dodaje się 0,2 ml 10% roztworu amidosulfonianu amonowego i dobrze
miesza. Po 2 minutach dodaje się 0,2 ml 0,25% wodnego roztworu dwuchlorowodorku
N-(1-naftyleno)-etyleno-dwuaminy i probówki pozostawia się w ciemności przez
3 godziny. Kolorymetruje się w 550 nm wobec 1 N HCI jako próby zerowej. Przy
każdej serii oznaczeń należy wykonać 2—3 punktowy wykres kalibracyjny.

Określanie odzysku
Badano zawsze dwie próbki każdego moczu; do jednej z nich dodawano przed
hydrolizą wzorcowe roztwory badanych metabolitów: 10—20 ug XA, 100—340 ug
pozostałych. Odzyski wynosiły: XA — 806%, HK — 966%, HA — 88+ 7%/o
1К — 85+ 5%.
Nr 4 Wydalanie kinureniny u dzieci 233

Powtarzalność
Oceny powtarzalności oznaczeń dokonywano poprzez wykonanie 30 oznaczeń da-
nego metabolitu w tym samym moczu i obliczenie współczynnika zmienności (VK).
Powtarzalność wynosi: dla XA — 5%, dla HK — 3%, dla HA — 3% i dla K — 7%.

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

Przedstawiona metoda pozwala oznaczać w sposób prosty i dokładny

stężenie w moczu kinureniny, 3-hydroksykinureniny, kwasu ksantureno-
wego i kwasu 3-hydroksyantranilowego. Ocena wydalania tych metaboli-
tów początkowego odcinka drogi T-N daje wgląd nie tylko w przebieg
metabolizmu na tym odcinku, lecz może również dostarczać wskazówek
co do istnienia innych, głębszych zaburzeń metabolicznych.
Wyniki oznaczeń wykonanych u dzieci podano w tabeli I.
Tabela I
Wydalanie metabolitów tryptofanu w moczu (w uM/kg c.c./24 godz.)

. . 3-hydroksy- Kwas Kwas |

ЗЕНА kinurenina 3-hydroksy- | ksanturenowy
antranilowy

przed obciążeniem
Grupa I 0,58 + 0,29 1,20 + 0,61 1,81 = 0,88 0,17 + 0,18
Grupa II 0,61 + 0,24 0,97 = 0,38 1,24 + 0,48 0,10 = 0,08
Grupa ir 0,29 + 0,06 17,19 + 12,20! 1,43 + 0,62 0,10 + 0,06

po obciążeniu
Grupa I 7,33 = 4,25 4,15% 2,31 4,14 + 0,75 0,94 + 0,65
Grupa II 45,27 + 34,741 0,44 + 0,081 8,02 + 4,25 0,79 + 0,28
Grupa III 30,98 + 19,87 * 3,15 = 0,42 3,53 + 2,20 0,88 + 0,94

* р< 0,02, 1р< 0,05 w stosunku do grupy I

Wartości uzyskane u dzieci zdrowych — grupa I — są bardzo zbliżone

do wartości podawanych przez Michaela i wsp. (9), którzy badali dzieci
amerykańskie metodą Price'a i wsp. (11).
W grupie II wyniki uzyskane przed obciążeniem nie odbiegały zasad-
niczo od wartości, uzyskanych w grupie kontrolnej, natomiast wyniki po
obciążeniu są znacznie wyższe (poza ZA). W dwóch przypadkach wzmo-
żone wydalanie metabolitów może być prawdopodobnie związane z wpły-
wem czynników hormonalnych. Od szeregu lat wiadomo, że glikokorty-
koidy aktywują przemianę tryptofanu na drodze kinureninowej i to nie-
wątpliwie tłumaczy podwyższone wyniki otrzymane w jednym z prze-
badanych przypadków. Zależność między środowiskiem hormonalnym
ustroju a przebiegiem przemiany tryptofanu jest niezmiernie interesu ją-
cym i mało poznanym problemem badawczym. Opisana metoda może być
tutaj bardzo przydatna.
Greengard (4) zwróciła uwagę na wyraźną korelację dodatnią między
aktywnością pirolazy tryptofanowej a wydalaniem kinureniny w moczu.
Obecne wyniki wskazywałyby, że podobna korelacja dotyczy aktywności
tego enzymu i wydalania dalszych metabolitów drogi T-N. Wzrostowi
wydalania K w każdym przypadku w grupie II towarzyszy bowiem pro-
porcjonalny wzrost wydalania HK i HA; po obciążeniu stosunek wartości

4 — Diagn. Lab.
234 P. Kanabus Nr 4

tych metabolitów odpowiada 4: 2:1. Obserwacja ta ma istotne znaczenie

dla oceny wyników w grupie III.
W grupie III wydalanie K po obciążeniu jest wyższe niż w grupie kon-
trolnej, natomiast wydalanie HK i HA jest niższe; stosunek średnich
wyników tych metabolitów wynosi 10:1:1. W niektórych przypadkach
stosunek ten zmienia się jeszcze bardziej na niekorzyść HK i HA. Taki
układ wyników wskazuje nie na intensyfikację przemiany na drodze T-N
(w każdym razie na początkowym jej odcinku) — z czym mamy do czy-
nienia w grupie II, lecz na zahamowanie tej przemiany na etapie poprze-
dzającym powstawanie HK i HA tj. w reakcji hydroksylacji kinureniny.
Wyniki uzyskane u dzieci z głębokim upośledzeniem umysłowym są
w znacznym stopniu zgodne z wcześniejszymi wynikami autora, odnoszą-
cymi się do innej grupy dzieci z fenyloketonurią (5). Dzieci te również
wydalały mniejsze ilości HK i HA, jednakże wydalanie K było u nich
niższe niż u dzieci zdrowych. Opublikowane poprzednio wyniki nie prze-
czą więc w zasadzie wysuniętej wyżej sugestii o zahamowaniu hydroksy-
lacji kinureniny.
Rozważania na temat związku między zaburzeniami metabolicznymi
na drodze T-N a niedorozwojem umysłowym przekraczają ramy obecnego
doniesienia. Warto jednak wspomnieć o dwóch faktach. Po pierwsze, do
typowych objawów niedoboru niacyny należy właśnie niedorozwój umy-
słowy. Po wtóre, między reakcją hydroksylacji kinureniny a reakcją hy-
droksylowej fenyloalaniny można zauważyć liczne analogie. W obu reak-
cjach uczestniczy NADPH (ryc. 1), a ponadto nieodzowny jest kofaktor
pterydynowy (16). Ponieważ hydroksylacja fenyloalaniny w fenyloketonu-
rię jest prawie całkowicie zablokowana, wydaje się celowym przebadanie
sprawności przebiegu hydroksylacji kinureniny we wrodzonych wadach
metabolizmu, prowadzących do niedorozwoju umysłowego.

П. Канабус

ЭКСКРЕЦИЯ КИНУРЕНИНА И ДРУГИХ МЕТАБОЛИТОВ ПРЕВРАЩЕНИЯ

ТРИПТОФАНА В НИКОТИНОВУЮ КИСЛОТУ В МОЧЕ ДЕТЕЙ

Содержание

Кинуренин, 3-гидроксикинуренин, ксантуреновую кислоту и 3-гидроксиантра-

ниловую кислоту выделили из мочи на колонке с Поуех 50 \ и определяли
колориметрическим и спектрофотометрическим способом. Исследования произ-
водились до и после пероральной нагрузки Г-триптофаном дозой в 0,1 г/кг в.т.
У здоровых детей и в двух группах больных детей. Результаты позволяют
оценить фуинкциональное состояние начального участка кинуренинового пути
и указывают на наличие характерных нарушений у умственно недоразвитых
детей.

Р. Капариз

URINARY EXCRETION OF KYNURENIE AND OTHER METABOLITES

OF THE TRYPTOPHAN-NICOTINIC ACID PATHWAY IN CHILDREN

Summary

Kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid and 3-hydroxyanthranilic acid

were isolated from urine on Dowex 50 W column ard colorimetrie and spectropho-
Nr 4 Wydalanie kinureniny u dzieci 235

tometric determinations were performed. The investigations were done before and
after oral loading with L-tryptophan in a dose of 0.1 g/kg in healthy children and
in 2 groups of children with diseases. The results make it possible to evaluate the
functional state of the initial part of the kynurenie pathway and indicate presence
of characteristic disturbanees in mentally retarded children.

PISMIENNICTWO

1. Brown R.R., Price J. M.: J. Biol. Chem., 1956, 219, 985. — 2. Coppini D., Be-
nassi C., Montorsi M.: Clin. Chem. 1959, 5, 391. — 3. Dalgliesh C.E.: Biochem.
J., 1956, 64, 481. — 4. Greengard O.: Am. J. Clin. Nutr., 1971, 24, 709. — 5. Ka-
nabus P.: w D.D.A. Primrose, red. Proceedings of the 2nd Congress of J.A.S.S.M.D.,
PZWL, Warszawa, 1971, 635. — 6. Leklem J. E.: Am. J. Clin. Nutr., 1971, 24, 659. —
7. Łapin 1.P.: informacja osobista, 1973, Leningrad. — 8. McCoy E. E., Chnug S.1.:
J. Pediat., 1964, 64, 227. — 9. Michael A. F., Drummond К. М., Doeden D., Anderson
J.A., Good R. A.: J. Clin. Invest., 1964, 43, 1730. — 10. Price J. M.: J. Biol. Chem.,
1954, 211, 117.
11. Price J. M., Brown R.R., Yess N.: w Advances in Metabolic Disorders, red.
R. Levine, R. Luft, t.2, 1965, Acad. Press, New York and London. — 12. Reynolds
М. 5.: J. Am. Dietet. Ass., 1957, 33, 1015. — 13. Tompsett S.L.: Clin. Chim. Acta,
1960, 5, 415. — 14. Udenfriend S., Titus E., Weissbach H.: J. Biol. Chem., 1955, 216,
499. — 15. Wald I.: w D.D.A. Primrose, red. Proceedings of the 2nd Congress of
LA.S.S.M.D., PZWL, Warszawa, 1971, 127. — 16. Wolf H.: Scand J. Clin. Lab. Invest.,
1974, 33, 20.
Wpłynęło dnia 27. VI. 1975 r.
Adres autora: 01-581 Warszawa, ul. Krasińskiego 16, m. 91.