Báo cáo Thí Nghiệm

Bài 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN HOÀ TAN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY
1, Nguyên tắc

- Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử
Folin. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein
trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch protein
nghiên cứu với thuốc thử Folin, dựa thei đường chuẩn của protein tinh khiết
với thuốc thử này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng protein của mẫu vật
nghiên cứu
- Phản ứng:

Cu2+/OH- Folin
Protein . Phức Cu+ Phức hợp màu xanh đậm
Phản ứng Biure (Tím)

Xác định lượng protein Đo OD

 Giai đoạn 1: Phản ứng Biure

Protein + Cu(OH)2 Phức Cu2+ (xanh tím)

 Giai đoạn 2: Phản ứng với Folin Mox

OH-
Cu+ + Folin Cu2+ + (x, y < 6)

(W+6, Mo+5) Wy

Xanh đậm, hấp thụ ánh sáng λ = 750nm

2, Đường chuẩn – Đo mật độ quang OD

 - Định luật Lamba – Beer
⊥0
A = OD = Log = εLC
I

C: Nồng độ chất hấp thụ ánh sáng (mg/ml; mmol/ml)

L: Chiều dày lớp dung dịch
ε: Hệ số hội tụ phân tử, đặc trưng cho từng loại chất
⟹ OD = εLC = kC ( k = εL = const )
⟹ OD = f(C) ⟹ Quan hệ tuyến tính ⟹ Xác định được lượng protein thông qua C
3, Cách tiến hành

Chuẩn bị 2 dãy ống ống nghiệm sạch gồm 6 ống rồi thực hiện các bước dưới đây:

3.1 Pha dãy dung dịch BSA với các nồng độ Ci cho đường chuẩn (dãy ống 1):

Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau tạo dãy ống có
nồng độ BSA (Ci)

Ống 1 2 3 4 5 6
falcon15ml/ống
nghiệm ngắn
Dung dịch BSA 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
gốc(ml)
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Nồng độ BSA 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Ci(mg/ml)
Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci

3.2 Thực hiện phản ứng:

Bổ sung lần lượt các hóa chất với lượng tương ứng như bảng sau vào dãy ống 1 ở
trên tạo dãy ống có cường độ màu khác nhau tùy thuộc nồng độ BSA Ci khác
nhau:

Ống 1 2 3 4 5 6
nghiệm
Dung dịch 5 5 5 5 5 5
C (ml)
 Trộn đều để yên 10 phút
Dung dịch 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Folin (ml)
Trộn đều bằng vortex, để yên 20 -30 phút

3.3 Đo độ hấp thu ánh sáng tại bước sóng 750nm (OD750 nm) với mẫu đối
sánh (mẫu kiểm chứng) là mẫu trong ống nghiệm số 7.

OD 0 0,112 0,132 0,179 0,223 0,272

3.4 Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa Nồng độ BSA Ci
(mg/ml) (mục 1. ) và OD750nm (mục 3.), trục tung là mật độ quang (OD750nm),
trục hoành là nồng độ protein. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng
y= ax +b với y = OD750nm, x= [Protein] (mg/ml) và hệ số tương quan R2 nhờ
phần mềm Excel.

OD 750nm
0.3

f(x) = 0.268986486486487 x + 0.0105675675675675

0.25 R² = 0.990349498925063

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

4, Phân tích mẫu

 Chuẩn bị protein phân tích
- Bước 1: Cân mẫu cần đo ( 0,3g )
- Bước 2: Cho mẫu đã cân vào cối và một ít NaOH 1N vào để làm ẩm rồi
nghiền nhỏ.
- Bước 3: Cho mẫu đã nghiễn vào bình tam giác 100ml cùng với lượng NaOH
còn lại.
 - Bước 4: Đặt bình mẫu vào đun cách thủy gần 100oC trong 15 phút
- Bước 5: Lấy mẫu ra làm nguội, trung hòa tới pH=7 bằng HCl 0,1N (dùng
đữa thủy tinh chấm lên giấy thử pH và so sánh dải màu)
- Bước 6: Chuyển mẫu sang bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất
tới vạch định mức và trộn đều
- Bước 7: Lọc bằng giấy lọc thu được dịch lọc protein phân tích
 Tiến hành thí nghiệm
 Mẫu thí nghiệm ( 2 mẫu )
- Bước 1: Lấy ống nghiệm khô sạch cho 300ml dịch lọc protein vào dung dịch
C (hỗn hợp dung dịch A:B=50:1)(*)
- Bước 2: Trộn đều và để yên 10 phút
- Bước 3: cho tiếp dung dịch Folin trộn đều và để 20-30 phút
 Mẫu kiểm chứng
- Bước 1: Lấy ống nghiệm sạch và khô cho 300ml nước và dung dịch C ( hỗn
hợp dung dịch A:B=50:1 )
- Bước 2: Trộn đều và để trong 10 phút
- Bước 3: cho tiếp dung dịch Folin vào rồi trộn đều, để 20-30 phút
Dung dịch A: Na2CO3 2% pha trong NaOH 1N
(*):
Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch
Natri Xitrat 1%
 Đo độ hấp thụ
- Mẫu Thử nghiệm và mẫu kiểm chứng được tiến hành trong cùng điều
kiện, dùng cùng 1 máy đo quang, đo cùng lúc.
- Đo độ hấp thụ phụ thuộc C theo quan hệ tuyến tính trong một giới hạn
nhất định nên giá trị mật độ quang ngoài khoảng đường chuẩn=> nằm
ngoài khoảng tuyến tính=> giảm nồng độ=> cách pha loãng dung dịch.
- Độ nhạy của phản ứng phụ thuộc vào máy đo quang
- Dung dịch phải trong (vì nếu đục sẽ có hạt lơ lửng => ánh sáng gặp hạt sẽ
bị phản xạ, tán xạ => làm I1 giảm=> A tang=> sai số) Vì vậy phải lọc
hoặc ly tâm.
- Ánh sáng phải đơn sắc
- Phản ứng biure là phản ứng đặc trưng cho liên kết peptit với ion Cu2+:
do nguyên tử N tạo liên kết phối trí với Cu2+ => tạo phức.Cu2+ oxh các
gốc Tyr, Tryp => Cu+ có màu xanh đặc trưng.
- Độ tan nhỏ nhất khi pH=pI
5, Xử lí số liệu
Khối lượng mẫu phân tích: 0,3g
OD mẫu kiểm chứng: 0
Hàm lượng protein trong mẫu đem phân tích:
Mẫu phân tích Y Δy
1 0,171 0,0135
2 0,144 0,0135
yTB= 0,1575 ΔyTB= 0,0135

 Sai số của y:
y = yTB ± Δy = 0,1575 ± 0,0135
 Đường chuẩn protein: y = 0,269x + 0,0106 (trong đó x có đơn vị mg/ml và
y là kết quả đo OD).
( y – 0,0106) 0,1575−0,0106
⟹x = 0,269 = 0,269 = 0,5461 (mg/ml)

0,0135−0,0106
Δx = 0,269
= 0,0108 (mg/ml)
 Kết luận:
- Cứ 100ml dung dịch mẫu có 54,61(mg) protein
- Cứ 0,3g mẫu chứa 54,61(mg) protein

54 , 61
⟹ %Pr = 0 ,3∗1000 * 100% = 18,20%

0,0108
Sai số của %Pr = 0 , 3 *100% = 3,60%

Vậy hàm lượng protein trong mẫu là: %Pr = (18,20 ± 3,60)%

 Nhận Xét
Từ đường chuẩn trên ta thấy R 2 = 0,9903 gần với 1 => kết quả đã khá chuẩn nhưng
vẫn còn sai số .
Có nhiều bước có thể làm sai số như :
 - Các ống nghiệm được sử dụng có thể chưa sạch hoàn toàn hóa chất của các
lần sử dụng trước. Việc trung hòa dung dịch cũng có thể gây sai số .
- Việc sử dụng pipet có thể sảy ra sai sót do: chưa thành thạo việc sử dụng hút
và nhả dung dịch dẫn đến thể tích lấy ra không chuẩn xác. Đầu pipet vào quá
sâu, đầu côn có thể dịch các hóa chất gây sai lệch, cần thay đầu côn mới sau
khi hút từng loại hóa chất và hạn chế cho pipet vào quá sâu.
- Khi đo trong máy đo quang, nếu để cuvet không đúng chiều ánh sáng đi qua,
đổ tràn dung dịch, dùng tay cầm vào 2 mặt trong của cuvet mà không dùng
giấy lau sạch 2 mặt trong sẽ ảnh hưởng đến đường truyền của ánh sáng dẫn
đến sai số.

6, Các chú ý khi làm thí nghiệm

* Chuẩn bị dịch phân tích

- Dùng NaOH để nghiền mẫu, chiết vi NaOH giúp phá vỡ cấu trúc màng tế bào
( Cấu tạo tư Photpholipit). Nhờ phản ứng este hóa, giải phóng toàn bộ protein.
- Đun ổn định ở 90C để tránh biến tính protein vì nhiệt độ quá cao, protein bị biến
tính. Còn nhiệt độ thấp dẫn tới hiệu suất không cao.
- Sau khi chiết protein xong phải trung hòa dung dịch bằng HCl loãng đến pH=7 vì
phản ứng biure diễn ra mạnh trong môi trường kiềm, phụ thuộc vào pH → phải
đưa môi trường dung dịch về pH=7 để ko làm ảnh hưởng đến hiệu suất của phản
ứng biure.
- Dùng giấy pH làm chỉ thị kiểm tra môi trường trong dung dịch chứ không dùng
phenolphthalein vì phenolphthalein sẽ làm ảnh hưởng đến màu sắc của dung dịch
sau phản ứng biure → mật độ quang đo được sẽ bị ảnh hưởng.
- Dung dịch trước khi đưa vào máy đo quang phổ phải được lọc kỹ, trong và không
có những hạt lơ lửng vì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả đo.
* Làm phản ứng màu:
- Dung dịch A: Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1 N => Cung cấp môi trường
kiềm.
- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch natrixitrat 1% bền vững
hơn trong Kali- natrixitrat 1%
- Dung dịch C: hỗn hợp A/B = 50/1
- Dung dịch A có Na2CO3 dùng làm dung dịch đệm duy trì PH. Nếu không có
Na2CO3 thì thời gian đạt tiêu chuẩn sẽ thay đổi.
- Dung dịch B có Cu2+ tham gia phản ứng Biure tạo phức đồng protein màu xanh.
* Đo độ hấp phụ:
- Mẫu TN và mẫu KC phải được tiến hành trong cùng điều kiện, dùng cùng một
máy đo quang, đo cùng lúc.
- Đo độ hấp thụ phụ thuộc C theo quan hệ tuyến tính trong một giới hạn nhất định
nên giá trị mật độ quang ngoài khoảng đường chuẩn=> nằm ngoài khoảng tuyến
tính=> giảm nồng độ=> cách pha loãng dung dịch.
- Độ nhạy của phản ứng phụ thuộc vào máy đo quang
- Dung dịch phải trong (vì nếu đục sẽ có hạt lơ lửng => ánh sáng gặp hạt sẽ bị phản
xạ, tán xạ => làm I1 giảm=> A tang=> sai số) Vì vậy phải lọc hoặc ly tâm.
- Ánh sáng phải đơn sắc
7.Phạm vi áp dụng của phương pháp
- Phương pháp Lowry sử dụng để phân tích mẫu có chưa hàm lượng protein
thấp có axit amin mạch vòng và là protein hòa tan.
- Phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh
sạch. Nếu trong mẫu có các thành phần khác như K +, Mg2+, NH4+, EDTA,
Tris-HCl, cacborhydrate và tác nhân khử thì sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả.
Ngoài ra một khi đã nhuộm, mẫu protein không thể được sử dụng cho các
phương pháp xét nghiệm khác.
- Cường độ màu của phản ứng cũng phụ thuộc nhiều vào loại protein, độ pH,
tùy loại máy đo