BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ
HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
- - -🙚🕮🙘- - -

Báo cáo tiểu luận

KHÓA HỌC CHUYÊN ĐỀ 1

Chủ đề: Methylation-specific PCR (MSP)

GVHD : TS. Nguyễn Minh Xuân Hồng

Sinh viên thực hiện : Trần Thanh Ngọc -20125565
Lớp : DH20BQC
Ngành/Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TP.Thủ Đức, tháng 4 năm 2024

 LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Minh Xuân Hồng đã
hướng dẫn và giảng dạy trong quá trình học tập bộ môn “Khóa học chuyên đề 1” trong
khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm đã trang bị cho chúng em những kiến thức, kỹ
năng cơ bản cần có để hoàn thành báo cáo tiểu luận nghiên cứu này.
Tuy nhiên trong quá trình nghiên cứu, do kiến thức chuyên ngành còn hạn chế nên
chúng em vẫn còn nhiều thiếu sót khi tìm hiểu, đánh giá và trình bày về tiểu luận. Rất
mong nhận được sự quan tâm, góp ý của cô để tiểu luận của chúng em được đầy đủ và
hoàn chỉnh hơn.
Chúng em xin chân thành cám ơn!
 MỤC LỤC

Methylation-specific PCR (MSP)

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................2
MỤC LỤC..............................................................................................................................3
I. Giới thiệu.......................................................................................................................4
1. Mục đích, đặc điểm và ý nghĩa của Methylation-specific PCR................................4
2. Lịch sử phát triển..........................................................................................................4
II. Nguyên lý hoạt động của Methylation-specific PCR.................................................6
III. Ứng dụng của Methylation-specific PCR..................................................................7
IV. Vật liệu và thuốc thử...................................................................................................8
V. Ưu điểm và hạn chế của Methylation-specific PCR..................................................8
VI. Các công nghệ liên quan đến Methylation-specific PCR.........................................9
1. Các công nghệ liên quan đến Methylation-specific PCR..........................................9
2. Các công nghệ khác......................................................................................................9
VII. Kết luận.................................................................................................................10
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................11
 I. Giới thiệu

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi
trùng hợp phản ứng khuếch đại gen).
Methylation-specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) là một phương pháp phân tích
DNA được sử dụng để xác định sự methylation của các vùng DNA cụ thể. Methylation là
quá trình thêm một nhóm methyl (CH3) vào các cơ sở của DNA, thường xảy ra ở vị trí
cytosine của CpG dinucleotides trong chuỗi DNA. Phương pháp này cực kỳ quan trọng
trong nghiên cứu về biểu hiện gen và sự biểu hiện gen bất thường, tự tổng hợp, sửa chữa,
và điều chỉnh hoạt động của gen. PCR đặc hiệu methyl được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực, bao gồm di truyền học, y học và công nghệ sinh học.
1. Mục đích, đặc điểm và ý nghĩa của Methylation-specific PCR

PCR thông thường, việc nhận dạng một mẫu DNA có thể gặp khó khăn do sự
xuất hiện của các loại DNA khác nhau trong mẫu. PCR đặc hiệu methyl giúp xác định vị
trí và mức độ methyl hóa của các nucleotide trên chuỗi DNA, tự tổng hợp, sửa chữa, và
điều chỉnh hoạt động của gen, ảnh hưởng đến việc biểu hiện gen giúp phát hiện các biến
đổi và từ đó phát triển ra các phương pháp chuẩn xác hơn và điều trị tăng độ nhạy và độ
chính xác hơn PCR thông thường.
Một số đặc điểm của MSP:
- MSP sử dụng bisulfite conversion để chuyển đổi cytosine thành uracil, nhưng không
ảnh hưởng đến cytosine đã được methyl hóa. Quá trình này tạo ra sự khác biệt trong
chuỗi DNA giữa DNA methyl hóa và không methyl hóa.
- Thiết kế cặp primer đặc biệt cho vùng DNA quan tâm, sao cho một primer chỉ nhận
dạng DNA methyl hóa và primer kia chỉ nhận dạng DNA không methyl hóa.
- Sử dụng PCR để sao chép và mở rộng vùng DNA cụ thể được quan tâm, sau đó phân
tích kết quả để xác định mức độ methylation.
2. Lịch sử phát triển

4
 Stephen B. Baylin - Bác sĩ chuyên khoa ung thư
Phương pháp Methylation-Specific PCR (MSP) đã được phát triển vào cuối những
năm 1990 bởi Stephen Baylin và nhóm nghiên cứu tại Johns Hopkins University School of
Medicine. Ông Baylin là một trong những nhà khoa học hàng đầu trong lĩnh vực nghiên cứu
methylation của DNA và vai trò của nó trong ung thư.
Lịch sử hình thành của MSP có thể được phân thành các bước chính như sau:
Nghiên cứu về methylation của DNA: Trước khi MSP được phát triển, các nhà nghiên
cứu đã tiến hành nghiên cứu về methylation của DNA và sự ảnh hưởng của nó đối với biểu
hiện gen. Các phương pháp truyền thống như bisulfite sequencing đã được sử dụng để xác
định các vị trí được methyl hóa trong DNA, nhưng chúng không phải là phương pháp phù
hợp cho các ứng dụng phân tích mẫu lớn.
Phát triển phương pháp MSP: Với sự nhận thức về ý nghĩa của methylation trong
ung thư và các bệnh lý khác, nhóm nghiên cứu của Stephen Baylin và đồng nghiệp đã phát
triển MSP vào cuối những năm 1990. Phương pháp này cho phép phát hiện cụ thể và phân
tích methylation của DNA một cách nhanh chóng và hiệu quả.
Ứng dụng trong nghiên cứu và chẩn đoán: MSP nhanh chóng trở thành một công cụ
phổ biến trong nghiên cứu về methylation của DNA, đặc biệt là trong việc nghiên cứu các
biểu hiện gen và tác động của methylation đối với sự phát triển bệnh lý. Nó cũng được sử
dụng trong các ứng dụng chẩn đoán để xác định tình trạng methylation của DNA trong mẫu
5
lâm sàng, như phát hiện và theo dõi các loại ung thư.
II. Nguyên lý hoạt động của Methylation-specific PCR
Nguyên lý hoạt động của Methylation-specific PCR (MSP) là phương pháp dựa trên
PCR để phân tích các kiểu methyl hóa ở các đảo CpG. Để thực hiện xét nghiệm MSP, DNA
được tinh chế và trải qua quá trình biến đổi dựa trên sự khác biệt trong chuỗi DNA giữa
DNA được methyl hóa và DNA không methyl hóa bằng cách:
- Xử lý bisulfite: trong quy trình sulphon hóa: DNA mẫu được xử lý bằng bisulfite,
một hợp chất hóa học có khả năng chuyển đổi dư lượng cytosine không được methyl
hóa thành uracil. Cytosine đã methyl hóa, trong đó nhóm methyl được gắn vào
carbon 5, không thể chuyển đổi được do phản ứng sulphon hóa không thể xảy ra.

Hình 1. Cơ chế chuyển đổi nucleotide từ cytosine thành uracil bằng cách xử lý natri sulfite
(Clark và cộng sự, Nucleic Acids Res., 1994, 22:2290–2997).
- Thiết kế cặp primer:
 Cặp primer được thiết kế để phản ứng với các vùng DNA đã được xử lý bằng
bisulfite, trong đó một primer phản ứng với DNA methyl hóa và một primer khác
phản ứng với DNA không methyl hóa.
 Primer được thiết kế đặc biệt sao cho nó chỉ phản ứng với DNA đã được xử lý bằng
bisulfite và có chuỗi tương ứng.

6
  Đối với thí nghiệm MSP, cần có hai cặp mồi. Một cặp đặc hiệu cho DNA đã methyl
hóa (M) và cặp còn lại đặc hiệu cho DNA không được methyl hóa (U). Để phân biệt
DNA đã methyl hóa và không methyl hóa, một hoặc nhiều vị trí CpG được đưa vào
mỗi trình tự mồi (hoặc ít nhất một trong cặp). Phản ứng PCR được thực hiện bằng
cách sử dụng từng cặp mồi, cặp mồi M và U.

Hình 2. Lựa chọn mồi cho PCR đặc hiệu methyl hóa. Các mồi cho MSP được yêu cầu theo
cặp chỉ phát hiện DNA đã methyl hóa (mồi M) và chỉ DNA không được methyl hóa (mồi U).
Mồi chứa ít nhất nhiều hơn một vị trí CpG và hai cặp mồi chứa cùng một vị trí CpG. Tuy
nhiên, hai bộ mồi bao gồm các vị trí CpC giống nhau không thể có cùng độ dài và điểm bắt
đầu. Trình tự gốc là từ vùng khởi động của gen RUNX3 (số gia nhập, NM_004350).
- PCR: Sau khi cặp primer đã được thiết kế, một chuỗi PCR tiêu chuẩn được thực hiện
với DNA đã được xử lý bằng bisulfite như mẫu. Mỗi reaksi PCR sẽ tạo ra bản sao
của một phần của vùng DNA quan tâm.

- Phân tích kết quả: Sau khi khuếch đại thành công từ cặp mồi M là dấu hiệu của
DNA bị methyl hóa và sản phẩm PCR bởi cặp mồi U phản ánh DNA không được
methyl hóa. MSP có thể nhanh chóng đánh giá tình trạng methyl hóa của hầu hết mọi
cytosine của các vị trí CpG trong đảo CpG.

III. Ứng dụng của Methylation-specific PCR

- Điều chỉnh biểu hiện gen: có thể ức chế hoặc kích hoạt quá trình biểu hiện gen, ảnh
hưởng đến chức năng của protein và sự phát triển của tế bào.
7
 - Bảo vệ ADN: bảo vệ ADN khỏi sự phá hủy hoặc biến đổi do tác động của các yếu tố
bên ngoài như tia cực tím, chất gây ung thư hay gốc tự do.
- Phân loại và chuẩn đoán bệnh tật: như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh trầm cảm... Do
đó, việc phân tích mẫu ADN để xác định các biểu hiện methyl hoá có thể giúp trong
việc phân loại và chuẩn đoán bệnh tật.
- Làm cơ sở cho nghiên cứu di truyền và tiến hóa: đóng vai trò quan trọng trong việc
điều chỉnh và duy trì các cấu trúc gen trong quá trình tiến hóa.
- Phát triển các phương pháp điều trị bệnh: giúp phát triển các phương pháp điều trị
bệnh dựa trên việc thay đổi mức độ methyl hoá của gen liên quan.
IV. Vật liệu và thuốc thử
Vật liệu cần thiết cho quá trình methyl hoá ADN bao gồm:
- S-adenosylmethionine (SAM): là nguồn methyl trong quá trình methyl hoá ADN.
- DNA methyltransferase: là enzyme có khả năng truyền nhóm methyl từ SAM
vào các cơ sở nitrogen của nucleotide trong chuỗi ADN enzyme này chịu trách
nhiệm điều chỉnh quy trình methyl hoá ADN.
Một trong những loại thuốc thử methyl hoá ADN : là 5-azacytidine, một chất được sử
dụng trong điều trị một số loại ung thư. Thuốc này hoạt động bằng cách ức chế enzyme
methyltransferase, làm tăng tần suất methyl hoá trong ADN và gây ra tổn thương gen
V. Ưu điểm và hạn chế của Methylation-specific PCR
Ưu điểm:
- Chính xác và đáng tin cậy: Phương pháp MSP cho kết quả chính xác về việc phát
hiện sự đổi về methyl đối với các vùng DNA cụ thể.
- Độ nhạy cao: MSP có thể nhận biết được sự thay đổi nhỏ về methylation ở các vùng
DNA quan trọng.
- Ứng dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu ung thư: Phương pháp này hữu ích trong
việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh ung thư liên quan đến sự thay đổi methyl.
- Phát hiện ngay lập tức khuếch đại dương tính giả và sai lệch PCR.
Hạn chế:
- Độ đặc hiệu thấp

8
 - Không thể phát hiện toàn bộ methyl hóa DNA
- Không phân biệt được giữa các loại methyl hóa
Những cải tiến:
- Chế độ chọn lọc: MSP có khả năng phân lập và khuếch tán DNA methyl hóa, tạo
điều kiện thuận lợi cho quá trình PCR.
- Hiệu quả: MSP đảm bảo tính hiệu quả và chính xác cao hơn so với các kỹ thuật PCR
khác.
VI. Các công nghệ liên quan đến Methylation-specific PCR

1. Các công nghệ liên quan đến Methylation-specific PCR

Phương pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis): Khi DNA xử lý
với bisulfite, các cytosine không bị methyl sẽ biến đổi thành uracil, sau phản ứng PCR,
uracil thành thymine. Sự thay đổi nucleotide này có thể làm xuất hiện hoặc mất đi vị trí
nhận biết của enzyme giới hạn.
Phương pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase
chain reaction): MS-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vào vùng giàu
CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa với DNA không methyl hóa. Kết hợp hai
kỹ thuật MS-PCR với lai điểm cho phép định lượng các cytosine bị methyl hóa không
cần điện di.
Phương pháp định lượng qMS-PCR: Để tăng tính chính xác, hạn chế dương tính giả,
TaqMan và các mồi kết hợp với đầu dò được xây dựng và hoàn thiện, trong đó
MethylLight và HeavyLight là hai kỹ thuật định lượng phổ biến.

2. Các công nghệ khác

Bisulfite Sequencing: Đây là một phương pháp phổ biến được sử dụng để phân tích
methylation của DNA. Trong bisulfite sequencing, DNA trải qua bisulfite conversion
để chuyển đổi các cytosine thành uracil, nhưng không ảnh hưởng đến các cytosine đã
methylation. Sau đó, DNA được sequenced để xác định vị trí và mức độ methylation.
Mass Spectrometry (MS): Phương pháp này được sử dụng để phân tích methylation
của DNA bằng cách sử dụng các kỹ thuật phổ học để xác định tỷ lệ cytosine
methylation trong mẫu DNA.
9
 Single-molecule Real-time (SMRT) Sequencing: SMRT Sequencing sử dụng một
phương pháp sequencing đơn phân tử để phát hiện methylation, có thể phát hiện được
các phân tử DNA individual và theo dõi mức độ methylation trên mỗi phân tử.
Chip-based Methods (Chip-seq và MeDIP-seq): được sử dụng để phát hiện và định
lượng methylation của DNA trên quy mô genome. Trong Chip-seq (Chromatin
Immunoprecipitation sequencing), methylation được phát hiện bằng cách sử dụng các
antibody chọn lọc để chiếu sáng các khu vực methylation trên chromatin. Trong
MeDIP-seq (Methylated DNA Immunoprecipitation sequencing), DNA được
immunoprecipitated với các antibody chọn lọc chống lại cytosine methylation, sau đó
được sequenced để xác định các khu vực methylation.
VII. Kết luận

Methylation-specific PCR (MSP) là một biến thể của PCR được sử dụng để phân
tích methylation của các khu vực DNA cụ thể, dựa trên việc sử dụng các cặp primer được
thiết kế để chỉ nhận diện DNA được methylation (primer methylation) hoặc không
methylation (primer unmethylation). Quá trình PCR sẽ chỉ tạo ra sản phẩm nếu DNA
mẫu thỏa mãn điều kiện methylation hoặc không methylation tương ứng với primer sử
dụng. Vì vậy, PCR đặc hiệu methyl được coi là một phương pháp phân tích gen tiên tiến
và đa dạng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm di truyền học, y học và công nghệ
sinh học. và điều chỉnh hoạt động của gen, ảnh hưởng đến việc biểu hiện gen giúp phát
hiện các biến đổi và từ đó phát triển ra các phương pháp điều trị tăng độ nhạyvà chuẩn
xác. Tuy nhiên cũng cần cải tiến những hạn chế và các công nghệ liên quan để tăng độ
nhạy và độ chính xác của phương pháp PCR. Trong tương lai, PCR đặc hiệu methyl hóa
có tiềm năng phát triển với sự phát triển của công nghệ phân tích gen.

10
TÀI LIỆU THAM KHẢO

11