Khoa Dược - Bộ môn hóa chuyên ngành

HÓA PHÂN TÍCH 2

QUANG PHỔ UV-VIS

Thành phố Hồ Chí Minh – 2022

1
MỤC TIÊU HỌC TẬP
Sau khi học, sinh viên sẽ trình bày được :

 Trình bày được phổ UV-Vis

 Các định luật của quang phổ UV-Vis

 Nêu được các thành phần chính của một máy quang phổ

 Các phương pháp đo quang phổ UV-Vis

 Ứng dụng phép đo quang phổ UV-Vis

 QUANG PHỔ UV-VIS
ÁNH SÁNG

PHÂN TỬ NGUYÊN TỬ

Hấp thu Phát xạ Hấp thu Phát xạ

UV-VIS F.S AAS A.E.S

I.R

CÁC PHƯƠNG PHÁP NÀY ĐỀU ỨNG DỤNG TRONG

NGÀNH DƯỢC 3
 QUANG PHỔ UV-VIS
UV? VIS?

• Vùng tử ngoại gần (UV gần)  Vùng khả kiến.

200 – 375 nm 375 – 800 nm

• Thay đổi năng lượng electron hóa trị  Thay đổi năng lượng electron hóa trị

• Chỉ sử dụng cốc đo thạch anh  Có thể sử dụng cốc đo: thạch anh,
thủy tinh, và plastic

200nm 400nm

400nm 800nm 4
 QUANG PHỔ UV-VIS
Bức xạ vùng UV- Vis chia thành 3 vùng nhỏ

 → * →* ()m→()n* ( - )n→( - )n

UV xa
UV (chaân khoâng) 200 UV 400 Vis 800 
(nm)

• Vùng tử ngoại chân không • Vùng tử ngoại gần (UV gần)  Vùng khả kiến. : coman do >
- .
sim
: As bu xachiyan
· Vis
(UV xa) King

50 – 200 nm 200 – 375 nm 375 – 800 nm !

• Ít sử dụng: Gồm 3 vùng UV:  Có năng lượng thấp hơn

 Có năng lượng khá lớn, khi

plaste
vùng UV
va chạm gây vỡ liên kết / phân  UV-A (320-400 nm) My you
:

tử. Dan theg Ant

-

 UV-B (280-320 nm) ·

 Bị hấp thụ̣ mạnh bởi hầu hết

dung môi và oxy / không khí  UV-C (< 280 nm). Nig mark
·
!
E O qua

CUV-B
day Ozon
.

narg gat
de 1 f Khi
troi
:
qua
 Bị hấp thụ̣ bởi thạch anh 5
Es
dur es de thach ach
QUANG PHỔ UV-VIS
① O tauntine

O
O

6
 QUANG PHỔ UV-VIS
CHUYỂN MỨC NĂNG LƯỢNG

Sự kích thích điện tử từ orbital phân tử đang chiếm đóng (orbital liên kết) sang
LK
chint Talk xich
π

(orbital phản liên kết) [le ma ;

.
-

· ⑥

s >
-

p
+ d +
f

Năng lượng chuyển dịch:

⑭
E
a
/ <Egg
q *
② ③
E→* > E→* >E→* > E→* > En→* > En→*
④ ④ ⑥

En - **
N N
②
A
↑*
①
6 *:
Phan li of 6
7

(a)
>
·
Vis
UV-xa
I

(chan Klong)
-

f an dec Ng
Rigan
rat mark m cothikich
thich nay bac
↑
 QUANG PHỔ UV-VIS
CHUYỂN MỨC NĂNG LƯỢNG
Điện tử : Điện tử  : Điện tử tự do n (không liên kết):
~&lienket
 Liên kết đơn trong phân tử ·
.

 Tham gia liên kết đôi, ba  n có ở các dị tố O, S, N, X.

·

- - - - -

 → * cần E lớn
- -

  →  * cần E nhỏ  n→ * cần E thấp hơn  → *

( <150 nm: UV chân không).
(  UV-Vis gần)
 Hydrocarbon no: dùng làm
 Phân tử có nối đôi, nối đôi
dung môi n-hexan, nước
liên hợp
 Thường các hợp chất có
màu, và hấp thu trong Vis
 Thường chứa C=O
 Các phân tử có cấu trúc liên
hợp có nhiều điện tử và  và n
tham gia n→*, →*
 Dm ảnh hưởng vì nó tác động
lên liên kết trong phân tử

8
CẤU TRÚC ĐIỆN TỬ CỦA MỘT NGUYÊN TỬ
n 1 2 3 4 5 6 7
K L M N O P Q

Khi electron chuyển động trên một quỹ đạo lượng tử thì nguyên
tử không thu và không phát năng lượng.

Khi hấp thụ ánh sáng, electron chuyển động trên một quỹ đạo
có năng lượng E1 sang quỹ đạo có năng lượng E2 sẽ phát ra 1
photon có tần số hay bước sóng theo hệ thức:

E = h = h c/

Màu của ánh sáng phát ra sẽ tuỳ thuộc  hay 

Electron muốn chuyển từ lớp trong ra lớp ngoài thì cần

E = E(n+1) – En 9
CẤU TRÚC ĐIỆN TỬ CỦA MỘT NGUYÊN TỬ
Khi hấp thụ BXĐT, electron sẽ chuyển động từ quỹ đạo có năng lượng thấp E1 sang
quỹ đạo có năng lượng cao hơn E2,  phát ra một photon có tần số hay bước sóng
theo hệ thức:

Nếu hấp thụ năng lượng cao, điện tử nhảy hơn một mức năng lượng thì quá trình điện tử trở
về trạng thái cơ bản sẽ phải trãi qua vài bước, từ mức năng lượng thấp gần nhất rồi xuống
mức kế tiếp. 10
QUANG PHỔ UV-VIS

11
 QUANG PHỔ UV-VIS
 Màu của một chất liên quan đến sự hấp thu và phản xạ của
một chất
 Màu mắt người nhìn thấy là màu bổ trợ cho màu hấp thu

Observed Color of Color of Light Approximate

Compound Absorbed Wavelength of Light
Absorbed
Green Red 700 nm

Blue-green Orange-red 600 nm

Violet Yellow 550 nm

Red-violet Yellow-green 530 nm

Red Green 500 nm

Orange Blue 450 nm

Yellow Violet 400 nm

12
 QUANG PHỔ UV-VIS
chas no comu cir co The hap the
 Một chất như thế nào mới hấp thu trong vùng Uv-Vis? ·

 Tất cả các chất điều hấp thu trong vùng UV-Vis?
 Tại sao chất hấp thu mạnh, có chất hấp thu yếu?

NHÓM MANG MÀU(Chromophore) NHÓM TRỢ MÀU (Auxochrome)

NO2
HO

H2N N N O3S N N

N
NH2
N
OH SO3

Fast Brown Sunset Yellow (Food Yellow 3)

Para Red 13
hapthe Kis UV-Vi
Colk d (akienzan) Konguig
= de
1
AK
:
·

se hap the
· chaschico 1K don
viy UV-Vis

bro song (do Niy thp)

De hap ther vey den
(thup hon
-

- chai tro man cho chas sho voo man chint lam dick chugen vephia e da hon
 QUANG PHỔ UV-VIS
NHÓM MANG MÀU(Chromophore)
de

• Elk
Là nhóm chức chưa no, liên kết đồng hóa
trị trong phân tử gây ra sự hấp thụ̣ bức xạ
trong vùng UV- Vis ( > 200nm)

• CHROMOPHORE chuyển dịch n→* -

thường có   300nm.

• CHROMOPHORE chuyển dịch →* -

thường có   190nm.

Điều kiện cần để một chất hấp thu trong

vùng UV-VIS

14
 QUANG PHỔ UV-VIS
NHÓM TRỢ MÀU (Auxochrome)

 Là những nhóm thế no gắn vào nhóm mang

màu làm thay đổi cả bước sóng lẫn cường độ
của dải hấp thu cực đại.

 Thường làm chuyển dịch max về phía dài

hơn.

 Ví dụ: -OH, -NH2, CH3, NO2, -Cl, NHR, -

NR2, -SO3H,... (làm tính hấp thu tăng, làm
giảm năng lượng cần hấp thu)

T
whim

-
- Aro Miss
-

15
*
QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

to man deha the

-
 Sự chuyển dịch sang đỏ (bathocromic) = red shift
 Sự chuyển dịch sang xanh (hypsocromic) = blue shift
 Hiệu ứng tăng cường độ (hypercromic effect) tang
=>
do
↑
hip then
 Hiệu ứng giảm cường độ (hypocromic effect) => glam o hap Bu

3 4

16
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

 Sự chuyển dịch sang đỏ (bathocromic) = red shift

• Hấp thu bức xạ có bước sóng dài hơn trong dung môi có độ phân cực cao

• Trong phân tử hữu cơ có sự liên hợp

Do:

• Mạch C dài hiệu ứng liên hợp tăng sự lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm

• Liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng lớn

 Sự chuyển dịch sang xanh (hypsocromic) = blue shift

• Hấp thu bức xạ có bước sóng ngắn hơn trong dung môi có độ phân cực cao

• Chủ yếu xảy ra ở n→ * của nhóm carbonyl

Do

• Sự làm bền trạng thái n của dung môi

17
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

- -
- -

Galent
<

<

18
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

19
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

 DUNG MÔI
hap the
Cao =
 NỒNG ĐỘ too
v &

polime PHẢI ĐƯỢC

KIỂM SOÁT
·

hapthe (Do Khancing lage)

 pH Ank huong ·
dar Al i

 NHIỆT ĐỘ MẪU ĐO
atten Ries.
Mai thi plan cy
to 1
=>

PHẢI GHI RÕ RÀNG CÁC YẾU TỐ TRÊN TRONG

QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH BẰNG PP UV-VIS

20
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG – DUNG MÔI I
· ear kiem phan die can AET
.

• Đa số dung môi cũng có thể hấp thu bức xạ UV. Do đó phải ghi rõ dm được dùng để hòa tan mẫu

• Sử dụng dung môi càng kém phân cực càng tốt.

• Độ phân cực của dung môi có thể làm biến đổi môi trường điện tử của nhóm hấp thu mang màu.

• Thông thường, độ lớn của sự chuyển dịch có thể liên quan với độ phân cực của dung môi.

• Để phân tích so sánh, nên sử dụng một dung môi duy nhất cho tất cả các lần đo.

Độ dài sóng Các dung môi hấp thụ

180-195nm Acid sulphuric (96%), nước, acetonitril, cyclohexan, isooctan

200-210nm cyclopentan, n-hexan, glycerol, methanol, ethanol

210-220nm n-butyl alcohol, isopropyl alcohol, cyclohexan, ethyl ether, 1,4-dioxan

245-260nm chloroform, ethyl acetat, methyl format

265-275nm carbon tetrachlorid, dimethyl sulphoxid/formamid, acetic acid

280-290nm benzen, toluen, m-xylen

300-400nm pyridine, aceton, carbon disulfit

21
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG – NỒNG ĐỘ

• Nồng độ ảnh hưởng tới cường độ của dải hấp thu

• Ở nồng độ cao, tương tác phân tử (như là dimer hoá) dẫn đến cường độ
-

hấp thu không biến thiên tuyến tính theo nồng độ dẫn đến định lượng

không chính xác.

Nguyên nhân do sự thay đổi về dạng và vị trí của dải hấp thu.

22
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG – pH

 Ở các gía trị pH khác nhau thì cấu trúc của vật chất (như là các chỉ thị

pH) có thể thay đổi theo pH nên sẽ hấp thụ cực đại ở bước sóng khác

nhau.

 Nếu đang khảo sát một hoạt chất mà pH ảnh hưởng đến phổ của một

mẫu đo thì nên dùng hệ đệm để làm ổn định pH môi trường rồi mới khảo

sát độ hấp thụ của hoạt chất này.

23
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG – pH – Chú ý

Hầu hết các hệ đệm hấp thụ có ý nghĩa và có thể ảnh hưởng đến độ

dài sóng cực đại đối với các phép đo. Do vậy, phải làm song song mẫu

trắng.

Methyl Orange

CH3 CH3
H
O3S N N N O3S N N N
CH3 CH3

Yellow, pH > 4.4 Red, pH < 3.2

24
 Ul -
VIS : 375 >
-

000 nm

↓
200 375 nm int
Amax) Dinh
-

( :

mi da
si max

A = . L
. 2
E chegin A n
hie

Clai quary
die↑ [X1 A1)
,

cae too may

:
: t Peak_
in *
Xpeak (x , i f2)
I A Am & max
beal
..

"mar
e
-

2
X < PC
de
> >
-
> O

Den
lang kin↳ 800)
-

Bu
-

(200
&x
-

O
UU-Vis
(thach and) do

man
-Block Arh VD Ho 300-800 nm

I
:

> UV -

thach Anh (do

-

vis
300 nam

+
this and
=>
Diy .

+ Plastic Aron Khoar of UV)

-
cha
Hink hong
'I :

ent dis
Decainh
-

1
pla
c 4
phi jan
-
max
+ A
.

Hint dang
dink 19 paracetamol (C =? M)
-

-
VD ean
scien hapthe
:

+
Tien hant : j chichun (C = 0 , 001 M)
thu te ser
+ Drhp => Do daichuan
= A = 0 , 72

M
tamsuatra
"x6C= 000f Parab M
are-

Mag 1 tia

Mag 2 chum tia (hien sai

-
eau too :
(

-
Y ·

i nk
man traing

B1 man ele

In manvoman ded
: De2
racBasin
:
-
f
no
B2 : They
 QUANG PHỔ UV-VIS
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG – NHIỆT ĐỘ

 Sự trương nở đơn giản của dm có thể làm thay đổi độ hấp thụ biểu kiến

và do đó cũng có thể làm ảnh hưởng đến độ đúng của kết quả.

 Sự cân bằng vật lý hay hoá học: khi nhiệt độ tăng sẽ phá hủy cấu trúc

của acid nucleic.

 Nhiệt độ thay đổi: chỉ số khúc xạ của dm thay đổi một cách có ý nghĩa.

 Như vậy: nếu khi đo phổ, nhiệt độ có ảnh hưởng đến mẫu thì phải sử

dụng cốc đo ổn nhiệt đễ không làm thay đổi độ hấp thụ biểu kiến.

25
ĐỊNH LUẬT HẤP THỤ BỨC XẠ
LAMBERT - BEER

26
ĐỊNH LUẬT HẤP THỤ BỨC XẠ LAMBERT - BEER
Độ hấp thụ ánh sáng của vật chất tỷ lệ thuận với
nồng độ của vật chất hấp thụ và độ dày của ánh sáng truyền qua vật chất.

A = - lg T = -lg(I/Io) = lg (Io /I) =  l

C

A (absorbance): độ hấp thụ A=lC

 (molar absorption = extinction coefficient): độ tắt mol (lít/M.cm)

( >104 chất hấp thụ mạnh và  < 102 chất hấp thụ yếu)

l: bề dày của lớp chất hấp thu (cm)

C: nồng độ của chất hấp thu (M/lít)

Chú ý: Định luật Lambert – Beer chỉ thật sự đúng đối với ánh sáng có một độ dài sóng duy
nhất hay ánh sáng đơn sắc. 27
 ĐỊNH LUẬT HẤP THỤ BỨC XẠ LAMBERT - BEER
Điều kiện ứng dụng định luật Lambert-Beer:
 Ánh sáng phải đơn sắc
 Nếu mẫu đo là dung dịch thì phải loãng và trong suốt (không tán xạ)
 Chất khảo sát phải bền/dd và bền dưới tác dụng của bức xạ ứng dụng
 Áp dụng để phân tích các mẫu có nồng độ < 0.01M
 ε tùy thuộc chỉ số khúc xạ của môi trường (η).

Định luật Lambert-Beer thường bị sai lệch do:

- Phần cứng trên máy
- Sự phân ly (ion hoá dung dich)
- Sự trùng hợp phân tử chất thử
- Tạp chất lẫn với chất thử.

28
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

Spectrometer
Light Source Monochromator
(filter,
wavelength selector)
Detector
Sample

Data Processing

29
Mô hình chung của các trang thiết bị quang học
• Tất cả các dụng cụ này chứa 5 thành phần cơ bản

 source (nguồn sáng)

 wavelength selector (bộ chọn bước sóng)

 sample holder (cốc chứa mẫu đo)

 detector(bộ phận phát hiện)

 và signal processor (bộ phát tín hiệu) (PC)

Máy quang phổ lý tưởng

Tốc độ quét tốt
Độ phân giải cao
Phần mềm đặc trưng
Dễ thao tác
Bộ lưu dữ liệu tốt
30 ý
Phần tính toán được người sử dụng đồng
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

• Đèn Deuterium: Làm từ thạch anh,

• Đèn Tungsten thủy tinh hay plastic

Mang

Lăng kính thường • Detector ống nhân

- -

được làm theo dạng quang

-x

kim tự tháp đứng, có • Detecter dải diode

--

đáy là hình tam giác. quang

-

31
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS
• Đèn Deuterium: (P2)
 Sử dụng cho vùng UV (200 – 450 nm)
 Vùng Vis bị nhiễu nhiều.
 Half – life 1.000 giờ Chie rang to in tr 1 000
.

gl
bro xa
 D2 + năng lượng điện D2* D2 + hυ O

• Đèn Tungsten
&
 Sử dụng cho vùng Vis (330 – 900 nm)
 Có cường độ cao / vùng này.
 Half – life 1200 giờ
 Sợi dây mảnh tungsteng đặt trong thủy tinh
 Khi dây này bị nung đỏ đưa khí trơ trong đèn lên trạng thái
kích thích và phát bức xạ 32
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

• Lăng kính thường được làm theo dạng

kim tự tháp đứng, có đáy là hình tam
giác.
• Thường làm từ thạch anh
• Quá trình khúc xạ và phản xạ bên trong
lăng kính.
• Biến ánh sáng đa sắc thành ánh sáng đơn
sắc
33
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

• Làm từ thạch anh, thủy tinh hay plastic

• Thạch anh dùng 200 – 800nm
• Thủy tinh và plastic chỉ dùng Vis
• Thường sử dụng cốc có l = 1 cm
• Hay dùng từ Cuvettes

34
 SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS
• Nhận bức xạ điện từ sau khi qua mẫu (bị hấp thu)
• Biến tính hiệu quang thành tính hiệu điện
• Cường độ dòng điện tỉ lệ thuận với cường độ bức xạ đập vào bề mặt cathode

Detector ống nhân quang

 Có chức năng tổ hợp các tín hiệu chuyển qua vài
giai đoạn khuyếch đại trong thân ống.
 Tín hiệu từ Cathode sang Anode

Detecter dải diode quang

 Hệ thống thu nhận này rất nhanh vì các động tác
thu nhận cùng lúc.
 Đường đi qua của ánh sáng phát hiện bằng diod
được nối liền với độ rộng của khe vào và ra của
diod.
 Độ nhạy của đầu dò phụ thuộc vào số lượng diode
 Thông thường số diode = 512 con
35
SƠ ĐỒ KHỐI CỦA MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

• Cách tử
 Cấu tạo bởi vô số những khe rất nhỏ trên độ rộng 1 cm
 Tùy thuộc vào góc tới của chùm ánh sáng và bề mặt cách tử mà hướng truyền của
chùm bức xạ khi phản xạ trên bề mặt cách tử theo những hướng khác nhau
 Mở rộng hay hẹp phụ thuộc vào cường độ của đèn và độ nhạy của mẫu

36
 MÁY QUANG PHỔ 1 CHÙM TIA VÀ 2 CHÙM TIA
Máy quang phổ 1 chùm tia Máy quang phổ 2 chùm tia
 Máy được phát minh đầu tiên  Máy được phát minh sau
 Toàn bộ ánh sáng qua mẫu  Toàn bộ ánh sáng chia làm 2
 Chỉ có 1 cốc đo  Có 2 cốc đo ( cốc Ref và cốc Sample)
 Không quét được phổ UV-Vis  Quét được phổ UV-Vis
 Gía thành thấp, độ nhạy cao  Gía thành cao
 Độ trôi lớn  Khắc phục độ trôi vì I và I0 được đo cùng
 Các máy ngày nay có thể quét được phổ lúc
UV-Vis

Độ trôi do cường độ ánh sáng mất đi trên đường truyền, do thay đổi đường đi do phản xạ, và đi qua detector. Không đồng nhất giữa
mẫu đo va blank 37
MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

38
MÁY ĐO QUANG PHỔ UV-VIS

39
 CÁC PP ĐO CỦA MÁY QUANG PHỔ UV-VIS

QUÉT PHỔ (Spectrum)  Cho hình dạng phổ UV-Vis

(Wavelength scan)  Xác định max dựa vào độ hấp thu

ĐO ĐỘ HẤP THU  Từ max xác định độ hấp thu (A)

(Photometry)  Dùng để đinh lượng

ĐO ĐỘNG HỌC  Xác định thời gian phản ứng

(Kinetic) hay (Time scan)  Cố định Từ max xác định độ hấp thu
(A) theo thời gian

Chú ý: Tất cả các phép đo trên trước khi thực hiện đo phải trừ sự ảnh hưởng của mẫu trắng
(Blank) thường là dung môi pha mẫu 40
 ỨNG DỤNG QUANG PHỔ UV-VIS

Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực để:

 Định tính

 Định lượng

 Khảo sát vận tốc phản ứng

 Xác định pKa

 Xác định độ tinh khiết chất

 Xác định công thức cấu tạo chất (định luật:

Woodward)

 Làm đầu dò trong máy phân tích khác như sắc ký

và điện di

41
 ... >
-

↳
>
-

ac =
th
TA ↑= I-To & bi tri.

M
ho lau thi ?
·
Aony ~
Bao las va 2

haj
·

A
L

+ B => C - coden !
2
N N

· - --

! 40 min
>
i i
!
·
⑳
( I

Omin
A

THI 40mm

sn Whicho RQ Ain
= Poi trong COP
40 A +B >
-

san min
↑

=>
Dai KQ to wil

-
Dau ten : coman chuan : quel tra disim Xmax .

*
APho Aft :
dihap Ther c 1 chas 2 = 1% vo co do t(cm)
ỨNG DỤNG – Định tính
Định tính một chất: max và hình dạng phổ hấp thu UV-Vis
Phổ hấp thu của một chất là đường biểu diễn độ hấp thu của chất đó theo bước sóng của
ánh sáng chiếu tới

Cực đại hấp thụ (A max): bước sóng mà ở đó chất đo có độ hấp thu lớn nhất (A).
Ứng với một Amax là một max
Mỗi chất có một hoặc nhiều max đặc trưng
DĐVN V cho phép max được phép sai lệch ± 1 nm

Chú ý: trong một số chất để định tính không chỉ căn cứ vào max mà còn căn cứ vào các
đỉnh khác có trên phổ UV-Vis
Ví dụ: Vitamin B12
Dung dịch thử có các hấp thụ cực đại ở 278 nm, 361 nm và ở khoảng 547 đến 559 nm. Tỷ số độ hấp
thụ ở cực đại 361 nm so với độ hấp thụ ở cực đại khoảng 547 nm đến 559 nm từ 3,15 đến 3,45. Tỷ số
độ hấp thụ ở cực đại 361 nm so với độ hấp thụ ở cực đại 278 nm từ 1,70 đến 1,90.
42
ỨNG DỤNG – Định tính
Định tính một chất: có chất chuẩn d
zing ok

• So sánh phổ của mẫu đo với phổ của chất chuẩn

• Cùng nồng độ, hai phổ phải cho  max và  max giống hệt nhau

43
"

ỨNG DỤNG – Định tính

Định tính một chất: không có chất chuẩn

So sánh max, max của phổ UV-Vis của chất khảo sát với phổ UV-
Vis có trong tài liệu về phổ

Thí dụ:
phổ UV-Vis của B12
Vitamin B12: 3 cực đại 278  1nm; 361  1nm; 548
~ hapthuccai
 2nm.

 Cực đại hấp thu max và hệ số hấp thụ max là hai hằng số phổ UV - Vis đặc trưng riêng cho
mỗi chất.
 Phải thực hiện đúng theo các điều kiện đã ghi / tài liệu về dung môi, nồng độ, loại
44
ỨNG DỤNG – Định lượng
Định lượng trực tiếp – một thành phần

 Phương pháp đo tuyệt đối (không có chuẩn) -

Cotheding An

 Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ mol  của một chất
comman
 Phương pháp so sánh độ hấp thụ với chuẩn

 Phương pháp sử dụng đường tuyến tính

/

1.0
intensity

.
0.5

0.0
350 400 450
wave length cm-1
45
ỨNG DỤNG – Định lượng
 Phương pháp đo tuyệt đối (không có chuẩn)
A(hoaëcD)
1% 1% Cx% =
 Sử dụngE cm hayA cm E11%cm
 Máy phải được chuẩn hóa

Ví dụ: Định lượng B12 (DĐVN V) Cách 1

0,787
Cân chính xác 1 ml chế phẩm, cho vào = 0,0038 gam / 100ml
207
một bình định mức 50 ml, thêm nước tới 38
 100 = 95%
vạch được nồng độ pha xấp xỉ 40 40
microgam/ml
Độ hấp thu A = 0,787 ở max = 361nm Cách 2
(cốc đo l =1cm). Hãy xác định nồng độ A  (ñoä pha loaõng) A  50
=
của B12. E11cm
%
 (löôïng ñöôïc caân) 207  a
1%
E
Biết cm = 207 tại 361nm. 0,787  50
C% =  1% = 95%
207  0,002 46
ỨNG DỤNG – Định lượng
 Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ mol  của một chất

 Đo độ hấp thu của mẫu chuẩn tại max

 Dựa theo định luật Lambert-Beer, tính  rồi suy ra nồng độ mẫu thử Ct (mol/lit).

  của cùng chất trong cùng dung môi và tại cùng bước sóng thì giống nhau

Ac Ac
Ac= .Cc. l   = = (l=1cm).
Cc  l Cc

At= .Ct. l suy ra Ct = At At

=
εl ε

47
ỨNG DỤNG – Định lượng
 Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ mol  của một chất

 Tính hệ số hấp thu mol () của 5 dung dịch S1 – S5. Tính độ hấp thu mol trung bình.
 Tính nồng độ của dung dịch X theo định luật Lambert – Beer: A = .C.l (theo nồng độ mol).
Bảng kết quả đo độ hấp thu của các dung dịch khảo sát

Nồng độ Độ hấp thu Hệ số hấp thu

Dung dịch A mol ()
dd KMnO4
S1 0,5 x 10-3 M 0,2276
S2 1,0 x 10-3 M 0,4588
S3 1,5 x 10-3 M 0,6984
S4 2,0 x 10-3 M 0,9413
S5 2,5 x 10-3 M 1,1793
X ??? 0,9498

48
ỨNG DỤNG – Định lượng
 Phương pháp so sánh độ hấp thụ với chuẩn
 Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc trong dung môi thích hợp.
 Pha dung dịch mẫu thử có nồng độ Ct, trong cùng dung môi.
 So sánh độ hấp thụ (At) của dung dịch thử nghiệm có nồng độ (Ct) với độ hấp thụ Ac
của dung dịch chuẩn có nồng độ biết trước (Cc)
 Chú ý: Trong thực nghiệm, Ct và Cc càng gần nhau kết quả càng chính xác.

At Ct At
=  Ct = Cc
Ac Cc Ac

49
ỨNG DỤNG – Định lượng
Phương pháp sử dụng đường tuyến tính
 Pha các dd mẫu chuẩn C1, C2, C3,C4,… Cn chính xác / dm thích hợp.
 Lần lượt xác định A1, A2, A3, A4...An ở max
 Vẽ đồ thị với trục tung là (A), trục hoành là (C)
 Xác định y = ax + b với R2 = 0,99..
 Đo Ax của dd cần khảo sát rồi căn cứ vào đồ thị tìm Cx
 (Cx phải nằm trong khoảng C1 – Cn khảo sát)

50
ỨNG DỤNG – Định lượng
Vẽ đường biễu diễn độ hấp thu theo nồng độ của 5 dung dịch S1 – S5 bằng chương trình
Excel. Xác định phương trình hồi qui, suy ra nồng độ dung dịch X (theo nồng độ đương
lượng và nồng độ mol.
Bảng kết quả đo độ hấp thu của các dung dịch khảo sát
Nồng độ (x) Độ hấp thu 1.4
Dung dịch A (y)
dd KMnO4 1.2 y = 477.18x - 0.0147
S1 0,5 x 10-3 M 0,2276 R² = 0.9999
1

S2 1,0 x 10-3 M 0,4588 0.8

Series1
S3 1,5 x 10-3 M 0,6984 0.6 Linear (Series1)
S4 2,0 x 10-3 M 0,9413 0.4
S5 2,5 x 10-3 M 1,1793 0.2
X ??? 0,9498 0
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003

51
 ỨNG DỤNG – Định lượng
Định lượng trực tiếp – nhiều thành phần
Áp dụng định luật cộng tính

Nguyên tắc: ở một bước sóng xác định thì độ hấp thụ của
nhiều hợp chất có mặt trong một hỗn hợp bằng tổng độ hấp
thụ của mỗi thành phần.
Điều kiện:
• Cực đại hấp thu của các thành phần cách nhau một
khoảng hơn 10 nm.
• Độ hấp thu mỗi chất riêng biệt phải tuân theo định luật
Lambert – Beer.
• Không có sự tương tác hóa học giữa hai chất.
Lưu ý:
• Phương pháp này chỉ áp dụng được cho các hỗn hợp 2 -
3 thành phần
• Nếu nhiều thành phần hơn thì rất khó xác định.
52
 ỨNG DỤNG – Định lượng
Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần
 Quét phổ UV-vis riêng rẽ của 2 chất chuẩn X và Y.

 Chọn 2 cực đại  max1 và  max2 đặc trưng của 2 chất chuẩn X và Y.

 Đo riêng A từng chất chuẩn để xác định

 Đo A của dd hỗn hợp ở các  max1 và  max2 của các thành phần với cốc đo dày 1cm

 X và Y là 2 ẩn số. Giải 2 phương trình 2 ẩn số.

ε1x ,ε1y : hệ số tắt mol của X và Y ở 1

A1 = ε1x  X  l + ε1y  Y  l ε 2x ,ε 2y : hệ số tắt mol của X và Y ở 2
A2 = ε 2x  X  l + ε 2y  Y  l X : nồng độ chất 1,

Y : 2 trong hỗn hợp dung dịch

53
ỨNG DỤNG – Định lượng
Thay các giá trị đo được vào phương trình, giải hệ hệ phương trình để tính nồng độ của
K2Cr2O7 và KMnO4 trong dung dịch thử.

1max = 525 nm 2max = 446 nm

Tên dung dịch
A𝝀 𝜺 𝝀𝟏 A𝝀 𝜺𝝀𝟐
𝟏 𝟐

Dung dịch KMnO4 0,630 0,055

Dung dịch K2Cr2O7 0,170 0,884
Dung dịch thử 0,457 0,380

54
ỨNG DỤNG – Định lượng
Chiết đo quang
Tạo dẫn chất hấp thụ mạnh, đo trong vùng UV – vis

Nguyên tắc: Thêm một thuốc thử hữu cơ vào chất khảo sát không có tính hấp thụ (hoặc hấp

thụ yếu) để tạo thành phức chất có tính hấp thụ mạnh hơn chất ban đầu rồi sau đó chiết sang

môi trường khác và đo trực tiếp.

Ứng dụng:
Phân tích nước và tạp chất / nước
Lưu ý:

Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và tăng tính chọn lọc một cách có ý nghĩa.

55
 ỨNG DỤNG – Định lượng
Chiết đo quang
Tạo dẫn chất hấp thụ mạnh, đo trong vùng UV – vis

• Chiết đo quang : để phân tích một số kim loại.

Dithizone (= diphenylthiocarbazone) tạo phức với kim loại tan / nước ở pH khác nhau

• Giải thích:

 Dithizone tan / dm kém phân cực như CHCl3. Khi lấy dịch CHCl3 lắc với dd nước (pH
thay đổi) có chứa ion kim loại thích hợp thì sẽ tạo thành một phức màu tan / CHCl3 .

 dd Chì (Pb2+) / nước không hấp thụ / UV –vis tạo phản ứng với Dithizon thành dẫn chất
Pb – Dithizonat có màu đỏ tan / CHCl3 và hấp thụ / vùng UV –vis

56
 ỨNG DỤNG – ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG
Cơ sở lý thuyết: Xét một phản ứng hoá học
A + B → C + D
Tốc độ của phản ứng này có thể đo được bằng 2 cách:
 Đo sự giảm độ hấp thụ tại 1 do các chất phản ứng A hay B mất đi
từ từ.
 Đo sự gia tăng độ hấp thụ tại 2 do các sản phẩm C hay D tăng lên
từ từ.
 Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để định lượng enzym đã
xúc tác.

57
 ỨNG DỤNG – ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG
Thí dụ: định lượng  -chymotrypsin (cơ chất) bằng cách cho n-
acetyl tyrosin ethyl ester (enzym) vào dung dịch  -chymotrypsin
rồi đo độ giảm hấp thụ của dung dịch trên ở bước sóng 237nm theo
thời gian.

dan chat
pptao 58
 ỨNG DỤNG – XÁC ĐỊNH HẰNG SỐ pKa
Nguyên tắc:
 Phổ UV-Vis của các chất hữu cơ chứa các nhóm chức có tính acid hay base thường thay
đổi theo pH của môi trường.
 Dạng và cường độ của đường cong hấp thụ thay đổi theo [H+]

Thí dụ:

 Xác định pKa của đỏ methyl bằng N NH N NH N NH

- -
COOH COO COO
cách khảo sát đường cong hấp thu của
pK1 # 2.5 pK2 # 5.1

đỏ methyl) ở các môi trường: HCl NMe2 NMe2 NMe2

0.1N, NaOH 0.1N, đệm acetic, acetat H2In+ HIn (ñoû) In- (vaøng)

(CH3COONa 0.1M, CH3COOH

0.35M)

 pKa của đỏ methyl được tính như sau :

[ HA ]
pKa = pH đệm + lg
[A − ] 59
 ỨNG DỤNG – XÁC ĐỊNH HẰNG SỐ pKa
• Thí dụ :
HA: acid / nước bị phân ly HA + H2O → H3O+ + A-
A- : base liên hợp. Với dd acid loãng HA, ta có:
[H + ][A − ] [base ]
Ka = pKa = pH + lg
[HA] [acid]
Giá trị pH đo bằng máy đo pH.
Giá trị của tỷ số đo được bằng máy đo quang phổ. Từ đó tính được pKa
• Giải thích:
 mt thật acid sẽ đo được giá trị hấp thụ cực đại của dạng HA.
 mt thật kiềm sẽ đo được giá trị hấp thụ cực đại của dạng A-.
 mt trung tính đo được giá trị hấp thụ cực đại của cả HA và A-.
Độ hấp thụ đo được sẽ là sự tổ hợp tuyến tính của 2 dạng đó. 60
 ỨNG DỤNG – DETECTOR CỦA HPLC
HỆ THỐNG HPLC

Solvent cabinet

Degasser

Pump module

Injector/Autosampler

Column compartment

Detector(s) Computer
 ỨNG DỤNG – DETECTOR CỦA HPLC
ĐẦU DÒ UV-VIS
 Phổ biến nhất trong HPLC
Ưu và nhược điểm của PDA
 UV-Vis: 190 – 800 nm
Ưu điểm:
 Tế bào đo: ống hình trụ, dài 1 cm, đường
 Tạo được phổ UV-Vis
kính 1 mm
 Kiểm tra được độ tinh khiết của peak
 Detector đo ở bước sóng cố định
 Phát hiện đồng thời chất phân tích ở
nhiều bước sóng khác nhau.
ĐẦU DÒ PDA  Cung cấp phổ 3D của chất phân tích
(photo diod array detector) Nhược điểm:
 Phát triển từ Detector UV-Vis  Độ nhạy kém hơn UV-Vis
 Mỗi diod phát hiện sự hấp thu ở một  Mắc tiền
bước sóng nhất định.  Ít ứng dụng trong phân tích vết
 Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần
trong 1 giây.
 Thu được sắc ký đồ và phổ đồ
62
 SAÉC KYÙ ÑOÀ

Cheá phaåm CORYPADOL ôû 273 nm

(theâm Chlorpheniramin chuaån 5000 g/mL)
Hoãn hôïp chuaån ôû 273 nm
Ñieàu kieän saéc kyù toái öu:
Paracetamol - Coät Phenomenex Gemini RP18
(250x4,6 mm; 5 m)
Chlorpheniramin - Pha ñoäng: MeCN : ñeäm phosphat
Cafein 0,05M, pH 3 (15:85)
- Toác ñoä doøng: 1 mL/phuùt
- Theå tích tieâm maãu: 20 L
- Böôùc soùng phaùt hieän
Chlorpheniamin: 210nm
Paracetamol vaø cafein: 273nm
Phoå UV cuûa hoãn hôïp chuaån

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

 KHAÛO SAÙT ÑIEÀU KIEÄN PHAÂN TÍCH (TT)

Hoãn hôïp chuaån paracetamol vaø cafein Cheá phaåm CORYPADOL

ôû 273 nm ôû 273 nm

Chlorpheniramin chuaån ôû 210 nm Cheá phaåm CORYPADOL ôû 210 nm

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

Detector daõy diod quang (PDAD)

Saéc kyù ñoà 3 chieàu cuûa clarithromycin trong cheá phaåm

Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM

66