Skrypt MIKOLOGIA

Na ćwiczeniach z mikologii studenci są zobowiązani:

- zapoznać się z obowiązującym regulaminem ćwiczeń,
- w sali ćwiczeń nosić fartuch ochronny i ewentualnie maseczkę, ubrania wierzchnie (kurtki, płaszcze) zostawiać
w szatni, torby i plecaki składać w jedno miejsce,
- przestrzegać zasad jałowej pracy, wszelkie czynności wykonywać przy zapalonym palniku (30-centymetrowa
jałowa strefa wokół palnika),
- używane szkło, pipety i szkiełka przedmiotowe odkładać do przeznaczonych do tego celu pojemników,
- założone hodowle oznaczać pisakiem wodoodpornym,
- wykorzystane lub niepotrzebne hodowle czy materiał zakaźny składać w pojemnikach przeznaczonych do
unieszkodliwienia w autoklawie,
- przed wyjściem z sali ćwiczeń posprzątać stanowisko robocze, wyczyścić wanienki do barwień, obiektywy w
mikroskopach, wyłączyć używane urządzenia,
- przed wyjściem z sali ćwiczeń dokładnie umyć ręce,
- po opuszczeniu sali zdjąć fartuch ochronny.

W laboratorium mikrobiologicznym nie wolno:

- bezwzględnie jeść, pić i palić, żuć gumy,
- pozostawiać materiału zakaźnego bez oznakowania,
- otwierać hodowli mikroorganizmów na dłużej niż to konieczne do wykonania ćwiczenia,
- pipetować ustami,
- otwierać hodowli blisko twarzy,
odkładać materiału zakaźnego oraz wykorzystanego szkła na stół lub do przypadkowych naczyń czy
pojemników, ani do kosza

TECHNIKA KORZYSTANIA Z MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO

1) Ustawić mikroskop 15-20 cm od krawędzi stołu.
2) Sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne części (obiektyw, okular, lusterko) przetrzeć miękką, suchą ściereczką.
3) Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensorową znajdującą się pod stolikiem.
4) Przekręcając śrubą makrometryczną podnieść tubus tak, aby obiektywy znalazły się 3 – 5 cm nad stolikiem.
5) Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw o najmniejszym powiększeniu.
6) Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami.
7) Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki czołowej obiektywu. Następnie bardzo wolno,
patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, oddalać stolik od obiektywu aż do ujrzenia konturu badanego
obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby mikrometrycznej.
8) Kolejno włączać w oś optyczną mikroskopu obiektywy o coraz większej sile powiększającej. Każdorazowo oddalać
stolik od obiektywu, a następnie patrząc z boku przestawić rewolwerem obiektyw i postępować jak od punktu 6.
9) W przypadku mikroskopowania przy użyciu obiektywów immersyjnych należy najpierw znaleźć obraz obiektywem
suchym, a następnie podnieść obiektyw do góry i na preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego. Patrząc z boku
opuścić obiektyw aż do zanurzenia się soczewki czołowej w olejku. Skorygować światło (podnieść kondensor). Znaleźć
ostry obraz manipulując śrubami makro- i mikrometryczną.
10) Po zakończeniu mikroskopowania obiektyw przemyć alkoholem.
11) Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej, wyłączyć i przykryć.
UWAGA! Do posiewów grzybów „twardych” (pleśnie, dermatofity) używać ezy hakowej,
dla grzybów „miękkich” (drożdże) ezy okrągłej

1
Na kolejne zajęcia proszę o przyniesienie 2 ziemniaków/grupę
Ćwiczenie 2
I. Przygotować płytki z podłożem hodowlanym dla grzybów:
- rozpuścić podłoże Sabourauda (300 ml) i wylać 15 płytek o  60mm (do wysokości 2/3 płytki). Płytki
pozostawić do zastygnięcia agaru.

II. Przygotować podłoża mikologiczne:

a) Potato-dextrose agar (PDA):
- 300g ziemniaków w plasterkach (umyte ale nieobrane)
- 1l wody
- Gotować wyciąg prze 30 min.
- Wyciąg przesączyć przez gazę lub uzyskać prze dekantację
- Dodać 20g glukozy
- Dodać 20g agaru
- Uzupełnić do 1l H2O
- pH, 5,6 ± 0,2
- Autoklawować 15 min w temperaturze 121 °

Hodowla, ocena morfologii grzybów drożdżopodobnych i strzępkowych, inicjacja sporulacji u drożdży, zwykle
stymuluje produkcję pigmentu przez T. rubrum. Rekomendowane podłoże do oznaczania liczby grzybów w
napojach mlecznych, środkach spożywczych mrożonych i innych. Umożliwia częściową identyfikację wyrosłych
drożdży i pleśni na podstawie morfologii kolonii.

b) CZAPEK-DOX AGAR:
(G/L):
- FeSO4x7(H2O) 0.01
- MgSO4 0.5
- KCl 0.5
- K2HPO4 1.0
- NaNO3 3.0
- Sacharoza 30.0
- AGAR 15.0
pH 6.8 ± 0.2.
(121 °C, 15 psi, 15 minutes).

c) OA: agar owsiany (CBS):

- 30 g płatków owsianych w 1 litrze wody zagotować i dusić na wolnym ogniu przez 2 godziny.
- Przefiltrować przez ściereczką i dopełnić do 1 litra.
- Dodać 15 g agaru do jednego litra
- sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ° C przez 15 min.
- pH 6,0±0,2
Morfologia grzybów m.in. pleśniowych. Stymuluje produkcję konidiów

d) Podłoże Sabourauda:

2
 Wykonać zgodnie z instrukcją producenta

W celu zahamowania wzrostu bakterii do podłóż można dodać:

- 40ug/ml - Chloramfenikol ( stężenie wyjściowe 34mg/ml etanolu);
- 10g/l gentamycyna
- 20 jednostek/ml penicylina + 40 jednostek/ml streptomycyna
Wykonać:
Streptomycyna - (2ml) : 50mg/ml w jałowej wodzie
Używać w stężeniu roboczym 40ug/ml podłoża

III. Hodowle grzybów pleśniowych

- przygotować stół do pracy jałowej
- opisać wcześniej wylane płytki nazwą przesiewanego grzyba (np. Aspergillus clavatus, Penicillium spp.,
Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium spp., Rhizopus spp., Alternaria spp.)

- ezą haczykową pobrać ok. 1-2mm2 kawałki agaru z grzybnią i zaszczepić centralnie lub w 3 miejscach płytkę z
podłożem Sabourauda

- płytki inkubować w temperaturze pokojowej 7-14 dni.

http://ammaterialy.w.interiowo.pl/mikrob/praktycz.pdf
Na kolejne ćwiczenia przynieść po 3 kawałki (z różnych źródeł) sera białego

Ćwiczenie 3
I. Badanie czystości mikologicznej różnych powierzchni laboratoryjnych:

1. Przygotować płytki ( 60mm )z podłożem Sabourauda (po jednej dla każdego studenta)
2. Jałową wymazówką wykonać posiew z wybranej przez studenta powierzchni
3. Płytki (opisane miejscem pobranej próby) inkubować w temperaturze pokojowej 7-21 dni

II. Ocena morfologii oraz zarodnikowania grzybów pleśniowych na różnych pożywkach :

Materiał:

3
Hodowle płytkowe : Aspergillus clavatus, Penicillium spp., Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium spp., Rhizopus spp.,
Alternaria spp.
- przygotować zestaw 4 podłóż na płytkach Petriego ( 60mm ) (Potato-dextrose agar (PDA), CZAPEK-DOX AGAR,
agar owsiany (CBS) oraz Sabourauda) dla każdego badanego grzyba
- ezą hakową pobrać grzybnię i przeszczepić centralnie (tylko w 1 miejscu) na dane podłoże
- hodowlę inkubować 7- 21 dni prowadząc cotygodniowe obserwacje makroskopowe grzybów (wygląd, średnica
kolonii) oraz ich zarodnikowanie (obserwacje pod binokularem). Wyniki zapisać w postaci tabeli.

III. Mikrohodowle wybranych grzybów pleśniowych (1):

- w łaźni wodnej rozpuścić słupek z agarem Sabourauda
- na odtłuszczone i wyjałowione (alkoholem) szkiełko podstawowe nanieść 3-4 krople rozpuszczonego
agaru Sabourauda (lub wyciąć bloczek (1cmx1cm) z przygotowanej wcześniej płytki - ezą hakową
pobrać grzybnię i przeszczepić na szczyt kopułki agaru (/ bloczka)
- przykryć (bez dociskania) wyjałowionym alkoholem szkiełkiem nakrywkowym
- mikrohodowlę wstawić do komory wilgotnej
- hodowlę inkubować w temperaturze pokojowej
- wykonać opis makroskopowy wysiewanych grzybów

IV. Izolacja Geotrichum candidum z produktów mlecznych(1):

- niewielki kawałek sera białego umieścić w pustej szalce Petriego ( 90mm) i pozostawić w lodówce na okres 2-3
tygodni

Ćwiczenie 4
I. Mikrohodowle wybranych grzybów pleśniowych:
- Mikrohodowle wykonać jak opisano w ćwiczeniu 3 (wersja z wycinanymi bloczkami – wylać płytki 2 ( 90mm) na
grupę z agarem Sabourauda do wysokości ½ płytki)
- Wykonać opis makroskopowy wysiewanych grzybów
- Przeprowadzić obserwacje mikroskopowe wyrosłych grzybów pleśniowych przy powiększeniu obiektywu (5-40x)

II. Ocena morfologii oraz zarodnikowania grzybów pleśniowych na różnych pożywkach(2):

- przeprowadzić ocenę makroskopową oraz pod binokularem wzrost i zarodnikowanie grzybów

III. Przynieść na kolejne zajęcia: 1/2l wody pobranej z naturalnego zbiornika, kałuży lub roztopionego śniegu (w
zależności od warunków atmosferycznych)

4
 IV. Na kolejne zajęcia przynieść: ok. 50ml ziemi (zabezpieczonej przed wyschnięciem np. w woreczku
foliowym) pobranej z różnych stanowisk (min. 5 prób/ grupę) (semestr zimowy!!)

Ćwiczenie 5
I. Badanie czystości mikologicznej różnych powierzchni laboratoryjnych(2):
- Wykonać obserwacje pod binokularem wyrosłych grzybów pleśniowych

II. Mikrohodowle wybranych grzybów pleśniowych:

Przeprowadzić obserwacje mikroskopowe wyrosłych grzybów pleśniowych przy powiększeniu obiektywu (5-40x)

III. Wybór stanowiska i pobieranie prób gleby do analizy mykologicznej:

- przygotować 9 płytek  90mm z podłożem Martensa (200ml gotowego agaru/grupę; gotowy roztwór
streptomycyny 50mg/ml w jałowej wodzie)

Martin's rose agar:

pH 7.2 ± 0.2
( streptomycynę dodać do rozpuszczonego i ostudzonego do 50oC podłoża, tuż przed wylaniem płytek)
Agar Róż Bengalski – podłoże z różem bengalskim służy do izolacji i różnicowania drożdży i pleśni z próbek
środowiskowych. Stosowane do oznaczania liczby drożdży i pleśni z zastosowaniem metody zalewowej lub posiewu
powierzchniowego. Róż bengalski opóźnia rozrost kolonii pleśni, zabarwia strzępki grzybni co ułatwia odróżnianie
kolonii drożdży od pleśni i liczenie kolonii.

- 1 g gleby zawiesić w 9 ml płynu fizjologicznego (3 falkony/grupę)

- falkony wytrząsać 15 min. przy 150 rpm (lub silnie przez 5 minut)
-wykonać (w eppendorfach z płynem fizjologicznym) rozcieńczenia (10-2, 10 -4, 10-6, 10-8) uzyskanej zawiesiny gleby
- z rozcieńczeń 10 -4, 10-6, 10-8 wysiać na płytki z podłożem Martin'sa z różem bengalskim po 0,1 ml odpowiedniego
rozcieńczenia
-płytki inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 dni.
- policzyć liczbę kolonii grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych
- otrzymane wyniki przeliczyć na 1g masy gleby.
IV Aktywność Esteraz
Stosowane medium Zawiera Tween 80 jako źródło C, purpurę bromokrezolu jako wskaźnik pH
i sól wapniową. Wzrost grzyba na kwasach tłuszczowych powoduje wzrost pH, zmieniając kolor na purpurowy i tworząc
nierozpuszczalne sole wapnia, takie jak stearynian wapnia, które występują w postaci białego pierścienia wokół kolonii.

5
 Skład pożywki: pepton 10 g, NaCl 5 g, CaCl2.2H20 0,1 g, purpura bromokrezolu 25 mg, agar 15 g /l wody, pH
5.4.
Pożywkę sterylizować w autoklawie pod ciśnieniem 15 psi przez 20 min.
(10%) wodnego roztworu Tween 80 - 10 ml Tween 80 rozpuścić w 90 ml ciepłej destylowanej wodzie (65-70°C) i
oddzielnie sterylizować.
Po ochłodzeniu do 65-70°C, 10 ml roztworu Tween zmieszać z 90 ml podstawowego medium i wylać płytki  60mm
Płytki szczepić punktowo testowym grzybem (Rhizopus, Fusarium) i inkubowano przez 8-10 dni.

https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/viewFile/132773/122385

Ćwiczenie 6
I. Izolacja Geotrichum candidum z produktów mlecznych(2):
- przygotować płytki z agarem Sabourauda (3/ grupę) ( 90mm)
- ezą (okrągłą)pobrać grzybnię (żółtawy nalot na serze) i wysiać, posiewem redukcyjnym, na podłoże Sabourada.

- inkubować w temperaturze pokojowej http://slideplayer.pl/slide/59717/

II. Przygotować podłoża mikologiczne:

a) Podłoże kukurydziane (CMA): (Podłoże wykonać w objętości 200ml !)
g/1l::
1) 20.0 g mąka kukurydziana
2) 20.0 g pepton
3) 20.0 g glukoza
Gotuj mąkę kukurydzianą w 500 ml wody przez 1 godzinę w temperaturze 60 ˚ C. Przefiltruj przez gazę
mieszankę mąki kukurydzianej. Do 500 ml wody dodaj pepton, glukozę i agar. Połącz płyny, uzupełnij do 1000
ml.
(a) Dodanie 10ml (1%) Tween 80 stymuluje produkcję chlamydospor przez C. albicans, Candida stellatoides i
Candida tropicalis.
pH: 6.0 ± 0.2 at 25°C
Autoklawować. (121°C) przez 15 minut

Inkubację prowadzić w temperaturze 23-27°C (25°C) przez maksymalnie 4 dni kontrolując co 24 godz.
pojawianie się chlamydospor. Chlamydospory nie rozwijają się w 37°C

Microorganisms Growth Chlamydospores

Candida albicans Good +
6
A. brasiliensis Good -
S. cerevisiae Good -
C. stellatoidea +
C tropicalis +
C krusei +

(Corn Meal Agar (CMA) w/1% Dextrose

Dodanie dekstrozy (1%) (10g/1l) - wzrost większości dermatofitów - Inkubacja w temperaturze pokojowej 20-32°C minimum przez 21 dni
Trichophyton rubrum - czerwony pigment na rewersie kolonii)

b) Podłoża stymulujące produkcję askospor przez Saccharomyces cerevisiae (drożdże właściwe):

Podłoża wykonać w objętości 100ml !

1. Agar Adamsa:
g/ 1l:
0,4g glukoza
2,3g octan sodu
20g agar
108-112°C / 15 minut
Hodować Saccharomyces cerevisiae 48 godzinach w 30oC.

2. Modified Gorodkowa Agar

Ingredients Gms / Litre
Peptic digest of animal tissue 10.000
Dextrose 1.000
Sodium chloride 5.000
Agar 20.000
pH 6-9-7.1 before sterilisation
Autoklawować:(121°C) /15 minut.

3. „Podłoże do sporulacji”:
YE (wyciąg drożdżowy) 1,5g
Glukoza 1g
Bezwodny octan K 9,8g
Agar 20g
Woda do 1000ml

c) Podłoże do badania asymilacji lipidów: (Podłoże wykonać w objętości 200ml !)

g/l:
10g trypticase pepton
5g wyciąg drożdżowy
2g glukoza
2g NaCl
0,12g KH2PO4
20g agar

III. Barwienie metodą Grama:

7
 Materiał: hodowle płytkowe przedstawiciel rodzaju Candida, Bacillus, Escherichia
- wykonać 4 preparaty: 1 z mieszaniny 3 ww. mikroorganizmów oraz po 1 preparacie z czystych kultur.

- przygotować preparat na odtłuszczonym szkiełku podstawowym w kropli ,

- utrwalić preparat (nad płomieniem)
- barwienie:
1. fiolet krystaliczny – 3 min.
spłukać niewielką ilością wody
2. płyn Lugola - 2 min.
spłukać wodą
3. etanol – kilka sekund
spłukać wodą
4. safranina – 30 sek.
spłukać wodą
- po wyschnięciu oglądać pod imersją

Technika barwienia Grama składa się z następujących czynności:

1. Barwienie podstawowe roztworem fioletu krystalicznego. Wszystkie bakterie zostają wybarwione na fioletowo
pod wpływem tego barwnika zasadowego.
2. Utrwalenie płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu). Jodyna w połączeniu z fioletem krystalicznym tworzy
w komórkach kompleksy krystaliczne fiolet-jodyna.
3. Odbarwienie (alkohol etylowy, lub mieszanina alkohol etylowy-aceton). Pierwotne barwienie fioletem
krystalicznym zostaje wymyte u niektórych bakterii, inne pozostają zabarwione.
4. Dobarwienie barwnikiem kontrastowym (fuksyna karbolowa, safranina). Ten barwnik zasadowy powoduje
ponowne wybarwienie na czerwono (safranina) lub na różowo (fuksyna) bakterii pozbawionych koloru podczas
odbarwiania.

Ćwiczenie 7
I. Izolacja Geotrichum candidum z produktów mlecznych(3):
- z wyrosłych kolonii założyć hodowlę stacjonarną w 5ml płynnego podłoża Sabourada
- hodowlę prowadź do 4 tygodni prowadząc cotygodniowe obserwacje

II. Produkcja askospor przez Saccharomyces cerevisiae (drożdże właściwe) (1):

- Przygotować płytki z podłożem Adamsa, Gorodkowej oraz „Podłożem do sporulacji” (po 2 każdego rodzaju na
grupę) ( 90mm, podłoże do wysokości ¾ szalki)
- Na przygotowane płytki wysiać siewem redukcyjnym Saccharomyces cerevisiae oraz Saccharomycodes ludwigii
- inkubację prowadzić w temperaturze pokojowej (25-30oC) przez 14 dni

III. Produkcja chlamydospor przez grzyby z rodzaju Candida(1):

- przygotować 5 płytek ( 90mm) podłoża CMA z Tween 80 (1%)
- wysiać siewem redukcyjnym : C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis*, C. krusei, S. cerevisiae
- inkubację prowadzić 24-48 godz. w temperaturze 25+/-2oC. Przy negatywnej reakcji przedłużyć czas hodowli do
72 godz.
- wykonać preparat przyżyciowy na szkiełku podstawowym

* Tween 80 jest powierzchniowo aktywnym środkiem, który stymuluje produkcję chlamydospory Candida albicans i
czasami Candida tropicalis

IV. Ocena makro- i mikroskopowa grzybów z rodzaju Rhodotorula:

- wykonać preparat przyżyciowy

8
V. Wymaz z jamy ustnej w kierunku izolacji grzybów drożdżopodobnych (1):
- przygotować odpowiednią ilość płytek ( 60mm)z agarem Sabourauda streptomycyny (40ug/ml) (gentamycyny lub
chloramfenikolu),
-Wymaz pobierać z grzbietowej powierzchni języka, policzka i zmian patologicznych,
- pobrany materiał wysiać na gotowe podłoże
- wyniki posiewu oceniać po 24 i 72 godzinach oraz po 7 dniach (temperatura 37oC).

VI.Test wzrostowy różnicujący C. albicans oraz C. dubliniensis

- probówki z płynnym (5ml) podłożem Sabourauda z dodatkiem 6,5% NaCl (20% NaCl- roztwór wyjściowy)
zaszczepić grzybami C. albicans oraz C. dubliniensis
-hodowle z wytrząsaniem prowadzić przez 48h w temp 37 oC
VII. Mikrohodowle dermatofitów (patrz ćwiczenie 2-3) (komory wilgotne)

Ćwiczenie 8
I. Ocena wzrostu Malassezia spp. (M. furfur i M. pachydermatis) na modyfikowanych podłożach
Sabourauda:
- przygotować 1 płytkę ( 90mm) z agarem Sabourauda oraz 3 płytki z podłożem Sabourauta wzbogacone jednym z
podanych poniżej składników:
- oliwą z oliwek (końcowe stężenie1%)
- Tween 80 (1% )
-Tween 40 (1%)
- wykonać zawiesinę grzybów w 1ml płynu fizjologicznego (OD550nm=0,3)
- płytki podzielić na sektory i podpisać
- nakroplić, centralnie na odpowiednim sektorze, po 30 ul zawiesiny odpowiedniego grzyba
- inkubować w temperaturze 37oC przez 72-96godz.

II. Asymilacja lipidów przez Malassezia furfur:

Enzymy zewnątrzkomórkowe, np. lipazy uważane są za istotny czynnik wirulencji grzybów.
Lipazy to enzymy hydrolityczne, które są odpowiedzialne za hydrolizę estrów wyższych kwasów
tłuszczowych.
Tweeny - mieszaniny podstawionych tlenkiem etylenu estrów sorbitu oraz jego bezwodników - jednocyklicznego
sorbitanu i dwucyklicznego sorbidu z kwasami: laurylowym, palmitynowym, stearynowym i olejowym.

Po rozpuszczeniu podłoża do badania asymilacji lipidów schłodzić je do ok. 50oC i wymieszać z 200ul (na 1 płytkę)
wystandaryzowanej (do 105/ml) zawiesiny komórek badanego grzyba. Po zastygnięciu w podłożu wyciąć, jałowym
kokroborem, studzienki o średnicy 8mm. Do tak uzyskanych studzienek dodać różne źródła tłuszczu (np.: oliwa z
oliwek, oliwa z pestek winogron, olej rzepakowy, Tween 20 (roztwór zawierający ester kwasu laurynowego), Tween
40 (roztwór zawierający ester kwasu palmitynowego), Tween 60 (roztwór zawierający ester kwasu stearynowego),
Tween 80 (roztwór zawierający ester kwasu oleinowego).

9
 Wykonać doświadczenie na 3 płytkach ( 90mm) zgodnie ze schematem (maksymalnie 3 źródła/płytkę) Hodowle

inkubować 7 dni w temperaturze 37oC . Zmierzyć strefę wzrostu grzybów wokół studzienek.

III. Ocena zdolności produkcji enzymów (katalazy oraz ureazy) przez Malassezia spp.:
1. Reakcja na obecność katalazy:
Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem:
2 H2O2 2H2O + O2
- Na szkiełko podstawowe pobrać ezą grzybnię (grzybów z rodzaju Malassezia, Saccharomyces oraz Candida), a
następnie dodać ok. 3 krople wody utlenionej

2. Produkcja ureazy – podłoże Christensena z dodatkiem Tween 40 i 80:

Źródłem składników odżywczych jest pepton. Fosforany utrzymują pH pożywki podczas wzrostu badanych szczepów.
Substratem różnicującym jest mocznik. Podczas hydrolizy mocznika wytwarzany jest amoniak alkalizujący podłoże.
Wskaźnik pH czerwień fenolowa w środowisku alkalicznym zmienia barwę z żółtej na intensywnie czerwoną.
Wyniki testu dla rodzaju: Geotrichum (wynik ujemny) od Trichosporon (wynik dodatni) oraz Candida (wynik ujemny) od
Cryptococcus (wynik dodatni) Rhodotorula spp. (wynik dodatni) i Malassezia (wynik dodatni).

- Szczepy Malassezia spp. oraz wybrane Candida, Geotrichum i Rhodotorula wysiać liniowo na płytki/skosy z podłożem
Christensena (z dodatkiem Tween 80 (0,1%) oraz Tween 40 (0,5%))
- hodowle prowadzić w temperaturze pokojowej lub do 32oC

IV. Obserwacje mikroskopowe grzybów z rodzaju Malassezia:

- wykonać preparaty przyżyciowe

V. Produkcja chlamydospor przez Candida albicans(2):

- odczytać wyniki, wykonać preparat przyżyciowy w płynie fizjologicznym lub w laktofenol blue

VI. Wymaz z jamy ustnej w kierunku izolacji grzybów drożdżopodobnych (2):

- przygotować odpowiednią liczbę płytek ( 60MM) z agarem Sabourauda (+ antybiotyk przeciwbakteryjny-
streptomycyna 40ug/ml)
- przesiać wyrosłe grzyby
- inkubować w 37oC

Ćwiczenie 9
I. Produkcja askospor przez Saccharomyces cerevisiae (drożdże właściwe) (2):
a) Obserwacja zarodników workowych (askospor) drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz
Saccharomycodes ludwigii w preparacie przyżyciowym
1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym (po 1 preparacie z podłoża Adamsa, Gorodkowej oraz „Podłoża
do sporulacji”)
2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli drożdży z pożywek sporulacyjnych i zawiesić w wodzie
3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując początkowo obiektyw 10x, a
następnie 40x.
b) Barwienie zarodników u drożdży metodą Schaeffera-Fultona

10
- Wykonać rozmaz drożdży na szkiełku podstawowym, (po 1 preparacie z podłoża Adamsa, Gorodkowej oraz „Podłoża
do sporulacji”)
- utrwalić (2-3 minuty) 70% alkoholem metylowym (dodać 2-3 krople alkoholu i wysuszyć preparat suszarką).
Barwić:
-5 min. 1% roztworór zieleni malachitowej w 0,5% fenolu (podgrzewać na palnikiem lub suszarką)
- płukać woda bieżącą
- 1min. 1% wodny roztwór safraniny
Worki – zielone, komórki wegetatywne –czerwone

II. Testy identyfikacyjne grzybów drożdżopodobnych (1):

a) próba filamentacji (ang. germ tube test) – umożliwia szybką identyfikację gatunków Candida albicans i
Candida dubliniensis, które po 2-3 godzinach inkubacji w surowicy wykazują zdolność do tworzenia
wypustek (filamentów – ang. germ tube),
- Umieść 0,5 ml surowicy od owiec lub ludzkiej w małej probówce.
Uwaga: można również stosować płodową surowicę bydlęcą zamiast ludzkiej surowicy.
- Za pomocą pipety Pasteura dotknij kolonii drożdży i delikatnie zemulguj ją w surowicy.
Uwaga: Zbyt duża ilość inokulum będzie hamować tworzenie się filamentów.
- Inkubować probówkę w 37 ° C przez 2 do 4 godzin.
- Po inkubacji z hodowli wykonać preparat niebarwiony (na szkiełko podstawowe nanieść 1 kroplę
hodowli, nałożyć szkiełko nakrywkowe) i oglądać pod powiększeniem 400x. Filamenty są nieseptowanymi
wypustkami, które są ½ szerokości i 3-4 razy dłuższe od komórki, z której powstają.
Test pozytywny: krótkie strzępki (filamenty) powstające bocznie z komórki drożdży, bez zwężenia w punkcie
początkowym i bez obecności jądra. Przykłady: Candida albicans i Candida dubliniensis
Test ujemny: Przykłady: C. tropicalis, C. glabrata i inne drożdże.
Ograniczenia testu:
C. tropicalis może tworzyć pseudostrzępki, które mogą być fałszywie interpretowane jako filamenty
Drożdże o dawnej nazwie Candida stellatoidea także produkują fi lamenty - gatunek został połączony z
C. albicans i już nie istnieje jako odrębny.
Ten test jest tylko częścią ogólnego schematu identyfikacji drożdży. Do ostatecznej identyfikacji
wymagane są dalsze testy.

b) testy fermentacyjne (zymogramy) – umożliwia identyfikację gatunków na podstawie zdolności grzyba do

przekształcania różnych cukrów do alkoholu i dwutlenku węgla (fermentacji) (dodatkowy opis w Ćwiczenia z
mikologii lekarskiej)
o wykonać zawiesinę grzybów w wodzie (OD 550 =0,2)
o probówki z przygotowanym podłożem (woda peptonowa + błękit bromotymolowy + odpowiedni
cukier) zaszczepić 50ul przygotowanej zawiesiny
o inkubację prowadzić w 37OC 1-2 dni.
o Zapisać uzyskane wyniki w postaci tabeli– zmiana barwy, produkcja CO2

Gatunek zymogram
grzyba
glukoza galaktoza laktoza maltoza sacharoza rafinoza

11
 c) Podłoża chromogenne:
Hodowla na agarach selektywnych ID albicans, CHROMagar Candida (identyfikacja C. tropicalis, C.
krusei, C. glabrata, C. albicans), ID albicans, CandiSelect (C. albicans niebieskie chromogenny substrat
rozkładany przez N-acetylo-beta-D-galaktozamidazę).
- Wykonać wysiew redukcyjny dla wybranych grzybów z rodzaju Candida oraz z pojedynczych kolonii
grzybów wyizolowanych z jamy ustnej
- inkubację prowadzić zgodnie z wytycznymi producenta podłoża

Ćwiczenie 10
I. Izolacja Geotrichum candidum z produktów mlecznych (4):
Obserwacja artrokonidiów oraz strzępek dichotomicznie rozgałęzionych Geotrichum candidum:
-wykonaj preparat przyżyciowy z hodowli płynnej oraz stałej na szkiełku podstawowym

II. Testy identyfikacyjne grzybów drożdżopodobnych (2):

Odczyt zymogramu

III. Testy asymilacyjne (auksamogramy węglowodanowe i azotowe) – badają zdolność grzyba do asymilacji
(przyswajania) różnych cukrów i związków azotowych jako jedynych źródeł węgla i azotu

Materiał: hodowle płytkowe grzybów z rodzaju Candida (po 4 na każdą grupę)

- rozpuścić podłoża i przygotować płytki do auksonogramu C i N
Asymilacja cukrów: Asymilacja azotu:
(NH4)2SO4 5g Glukoza 20g
KH2PO4 1g KH2PO4 1g
MgSO4 0,5g MgSO4 0,5g
Agar 20g Agar 20g
H2O 1000ml H2O 1000ml

- wykonać po 2 płytki dla każdego podłoża, dla każdego testowanego grzyba

- podłoże ostudzić do ok. 50oC
- na płytkę ( 90mm) dodać 200 ul zawiesiny grzybów w wodzie (OD 550 =0,3)
- do tak przygotowanej płytki dodać ostudzonego podłoża (do ½ wysokości płytki) i następnie szybko i dokładnie
wymieszać pożywkę z bakteriami
- na zastygniętą powierzchnię podłoża jałową pęsetą nanieść jałowe krążki bibuły zgodnie ze schematem

- na krążki dodać po 15ul badanego 10% roztworu źródła N (1-KNO3, 2-(NH4)2SO4, 3-asparagina, 4-mocznik, 5-
pepton) lub C (6-mannoza, 7-glukoza, 8-sacharoza, 9-mannitol, 10-galaktoza) (w zależności od użytego podłoża)
- inkubować 48-96h w 28-37oC
- wyniki przedstawić w postaci tabeli z podanymi średnicami wzrostu (zmętnienia) wokół miejsca nakroplenia

12
 IV. Synteza enzymów hydrolitycznych:
Jednym z mechanizmów umożliwiającym kolonizację tkanek gospodarza jest zdolność wydzielania enzymów
hydrolitycznych, w tym proteaz i lipaz, które przez oddziaływanie na środowisko grzyba warunkują pozyskiwanie
substancji odżywczych oraz rozprzestrzenianie się grzybów w obrębie skóry i błon śluzowych.

PODŁOŻE WERNERA- ocena właściwości lipolitycznych

(zestaw hodowli płytkowych grzybów z rodzaju Candida, Malassezia)
pH = 7,4
Skład:
pepton 10g
NaCl 5g
CaCl2 uwodniony 0,4g
agar 20 g
Tween 80 10 ml (Polysorbate 80, Monooleinian polioksyetylenosorbitolu - stanowi
mieszaninę estrów kwasu oleinowego. Jego rola w podłożach mikrobiologicznych jest wieloraka,
m. In. stanowi źródło kwasów tłuszczowych)
H2O dest. 1000 ml
-na wcześniej przygotowane podłoże ( 90mm) wysiewać grzyby w postaci linii długości ok. 2,5 cm (tak by linie

wysiewu nie stykały się ze sobą).

-Po inkubacji w 37oC wykonać pomiar stref zmętnienia i przedstawić wyniki w tabeli (0,5 cm - silne właściwości
lipolityczne, mniejsze strefy – właściwości słabe)

PODŁOŻE STEIBA – ocena właściwości proteolitycznych

pH = 4,6
Skład:
glukoza 20g
KH2PO4 1g
MgSO4 0,5g
agar 20g
H2O dest. 1000 ml
5% r-r wodny kazeiny wołowej (lub albuminy)
Podłoże z albuminą:
- dodać 2,2 ml albuminy oraz 22 ml przestudzonego podłoża Steiba
- dokładnie wymieszać
lub
(Podłoże z kazeiną:
- Na każdą płytkę ( 90mm) dodać 2 ml kazeiny
- dodać 10 ml rozpuszczonego, przestudzonego do 50oC podłoża Steiba
- dokładnie wymieszać)
- Wysiewać szczepy Candida j. w. - w postaci linii o długości ok. 2,5cm. (tak by były wyraźnie od siebie
odseparowane!)
13
- Inkubować w 37oC
- zmierzyć strefy przejaśnienia powstałe wokół linii wysiewu grzyba, wyniki przedstawić w postaci tabeli

14
15
16
17
V. Test perforacji włosa

18
 - Przygotować 2 płytki ( 90mm) z podłożem Sabourauda i zaszczepić je (jak pokazano): T mentagrophytes

oraz M. canis
- płytki inkubować 7 dni w temp. pokojowej
VI.Na kolejne zajęcia przynieść próbki/eppendorfy z szamponami (preferowane szmpony przeciwłupieżowe)

VII.Na kolejne zajęcia przynieść ok. 50ml ziemi (zabezpieczonej przed wyschnięciem np. w woreczku
foliowym) pobranej z różnych stanowisk (min. 5 prób/ grupę) (semestr letni!!)

Ćwiczenie 11
I. Ocena skuteczności działania szamponów przeciwłupieżowych na wzrost grzybów z rodzaju
Malassezia:

- przygotować podłoże Sabourauda z dodatkiem Tween 80 (10ml /l) (płytki  90mm)

- na płytkę dodać 400ul zawiesiny Malassezia furfur lub M. pachydermatis (OD550=0,3), 200ul Tween 80 lub oliwy z
oliwek, a następnie schłodzonego agaru (ok. 50oC) (25ml = ¾ wysokości płytki)
- komponenty szybko i dokładnie wymieszać, płytkę pozostawić do zastygnięcia podłoża- po zastygnięciu podłoża

jałowym korkoborem wyciąć po 3 równomiernie rozłożone studzienki

- podpisać studzienki nazwą wybranego szamponu
- dodać do studzienki 100ul (do ¾ wysokości studzienki) badanego szamponu
- płytki, bez odwracania, inkubować w 37oC 48h-72h
- zmierzyć strefę zahamowania wzrostu grzybów, wyniki przedstawić w formie tabeli

II. Ocena lekowrażliwości wybranych przedstawicieli grzybów z rodzaju Candida:

- na płytkę dodać 200ul zawiesiny (OD550=0,3) wybranego grzyba z rodzaju Candida, a następnie schłodzonego
agaru Sabourauda (ok. 50oC) (20ml = do 2/3 wysokości płytki)
- dobrze wymieszać i pozostawić do zastygnięcia
- na tak przygotowane płytki nałożyć krążki nasączone lekami przeciwgrzybicznymi (zgodnie ze schematem powyżej)
- płytki inkubować w 37oC przez 24- 48 godz.
- zmierzyć strefę zahamowania wzrostu grzybów, wyniki przedstawić w formie tabeli

IV. Test przynęty włosowej (wersja ze środowiska)

- do szalek Petriego (szklane, wysokie) nasypać, do ¾ wysokości, ziemi i lekko uklepać
- podlać ziemię jałową wodą
- pęsetą rozłożyć ok. 10 odtłuszczonych, jałowych włosów i ponownie delikatnie przyklepać, tak by włosy miały
kontakt z ziemią
- inkubować ok. 4 tygodni w temperaturze pokojowej,
- co tydzień kontrolować poziom wilgotności ziemi

- preparat mikroskopowy z włosami wykonać w kropli płynu fizjologicznego.

19
 „perforatory” we włosach
https://www.researchgate.net/publication/260594961_Microspor
um_aenigmaticum_sp_nov_from_M_gypseum_complex_isolated_
as_a_cause_of_tinea_corporis/figures?lo=1
V.Test perforacji włosa (czyste kultury):
Materiał biologiczny: T mentagrophytes (test +), M. canis (test +), T rubrum (test-), Uwaga! Istnieją szczepy atypowe
T rubrum (test+)
a) I. Modyfikacja testu perforacji włosa
- w 25ml jałowej wody umieścić 20 jałowych włosów, 0,1 ml 10% ekstraktu drożdżowego, kilka niewielkich
fragmentów grzybni
- podpisać kolbkę nazwą badanego szczepu
- kolbkę zabezpieczyć parafilmem/folią
- inkubować w temperaturze pokojowej 3-4 tygodnie
- włosy oceniać mikroskopowo:
- podpisać szkiełko nazwą danego grzyba
- na szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynu fizjologicznego i umieścić w niej włosy (2-3 na
szkiełko)
- przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym
- oglądać preparat pod powiększeniem obiektywu 10-40x

b) II. Modyfikacja testu perforacji włosa:

- na przygotowane, na poprzednich ćwiczeniach, płytki z hodowlami T mentagrophytes oraz M. canis
pęsetą rozłożyć po ok. 5 odtłuszczonych, jałowych włosów
- inkubować minimum 10 dni w temperaturze pokojowej
- wykonać preparat j.w.

Ćwiczenie 12
I. Wykrywanie ureazy - podłoże Christensena (z dodatkiem mocznika i czerwieni fenolowej) (patrz
ćwiczenie 8):
Różnicowanie typowych gatunków Trichophyton rubrum (wynik ujemny) i Trichophyton mentagrophytes (wynik
dodatni)

Na przygotowane płytki/skosy wysiać Trichophyton rubrum oraz Trichophyton mentagrophytes. Hodowle

inkubować przez ok. 2 tygodnie w temperaturze pokojowej.

II. Test różnicowania M. audouinii, M. canis:

1. ½ łyżeczki ryżu wsypać do kolbki 20ml
2. dodać 8 ml H2O do każdej kolbki
3. autoklawować 15 min w 121 C
Na powierzchnię ziaren w kolbce wysiać badany grzyb i inkubować 7-14dni w temperaturze pokojowej.
Opisać zaobserwowane różnice we wzroście
M. canis , M. gypseum– wzrost,
M. audouinii – brak wzrostu (brązowy barwnik)
III.Materiały zapasowe u grzybów drożdżopodobnych:
1. Przyżyciowe barwienie wolutyny:
20
 wolutyna - substancja o charakterze białkowym gromadząca sie w cytoplazmie i wodniczkach w postaci ziarnistości.
Odczynniki:
- błękit metylenowy,
- płyn Lugola (J2 w KJ),
Postępowanie: ( preparaty wykonać dla wszystkich dostępnych grzybów z rodzaju Candida i Saccharomyces)

Na czyste i wysuszone szkiełko podstawowe należy nanieść kroplę płynu Lugola i kroplę błękitu metylenowego oraz
rozprowadzić w nich badane drożdże. Po 5 minutach wykonany preparat oglądać pod mikroskopem.

Wyniki barwienia:
protoplazma komórki barwi się na kolor żółto-brunatny, ziarna wolutyny zaś na kolor ciemnogranatowy.

2. Barwienie glikogenu w komórkach drożdży

Jest to barwienie przyżyciowe, pozytywowe, proste. Ziarna glikogenu barwią się na brązowo (brunatne), ciało
komórki jest jasnożółte.
Odczynniki:
- płyn Lugola
1. odtłuścić szkiełko podstawowe
2. nanieść kroplę kultury drożdży
3. dodać kroplę płynu Lugola i wymieszać z hodowlą
4. preparat przykryć szkiełkiem nakrywkowym
5. po 2-3 minutach obserwować pod mikroskopem (powiększenie obiektywu 40x)
6. wykonać rysunek
3. Barwienie tłuszczu w komórkach drożdży
Jest to barwienie pozytywowe proste. Krople tłuszczu czerwone, wiśniowe lub granatowe
(w zależności od stopnia spłukania), cytoplazma komórki jasno różowa.
Odczynniki:
- czerń Sudanu III (tetrabenzeno-β-naftol)
- 50% metanol lub etanol
Protokół:
1. odtłuścić szkiełko podstawowe
2. przygotować rozmaz z hodowli drożdży pobranej ze skosu (starej hodowli drożdży) w kropli wody
3. wysuszyć go na powietrzu
4. barwić Sudanem III w komorze wilgotnej przez 30 minut
5. zlać barwnik i osuszyć
6. spłukać 50% alkoholem metylowym przez 30 sekund, a następnie wodą
7. preparat wysuszyć
8. obserwować pod imersją
9. wykonać rysunek
IV. Mikrohodowle dermatofitów ( patrz ćwiczenie 2-3) (komory wilgotne)

Ćwiczenie 13
I. Ocena makroskopowa i mikroskopowa grzybów należących do dermatofitów (1):
a) opisać makroskopowo wygląd kolonii dermatofitów
b) wykonać preparaty mikroskopowe z wybranych grzybów należących do dermatofitów:
- podpisać szkiełko nazwą danego grzyba
- na szkiełko podstawowe nanieść kroplę barwnika Lactophenol Cotton Blue
Lactophenol Cotton Blue - roztwór błękitu laktofenolowego z bawełny, składający się z 40% glicerolu, 20% fenolu, 20%
kwasu mlekowego, 0,05% niebieskiego barwnika z bawełny (błękit Poirriera) oraz wody. Błękit laktofenolowy z bawełny
jest niebieskim barwnikiem używanym dobezpośredniego badania próbek pochodzenia klinicznego w kierunku

21
obecności elementów grzybów. Po dodaniu błękitu laktofenolowego z bawełny grzyby ulegają wybarwieniu na
niebiesko, co umożliwia ich łatwiejsze uwidocznienie i badanie.

- ezą hakową pobrać fragment grzybni (starając się nie naruszyć struktury grzybni) i umieścić w kropli
barwnika
- przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym
- oglądać preparat pod powiększeniem obiektywu 10-40x

II. cd.Mikrohodowle dermatofitów

- kontrola wzrostu i wilgotności komór/ obserwacje mikroskopowe preparatów

Ćwiczenie 14
I. Odczyt testów perforacji włosów (patrz ćwiczenie 11)

II. Ocena makroskopowa i mikroskopowa grzybów należących do dermatofitów (2):

- (patrz ćwiczenie 13)

Ćwiczenie 15
I. Ocena obecności elementów grzybów w preparatach dermatologicznych

Opis przykładowego testu komercyjnego:

Fungifast:

22
Nr1 (C +): kontrola pozytywna zawierające glukozę i purpurę bromokrezolową
nr 2 (β-NAG): zawiera chromogenny-substrat dla beta-D-glukozaminidazy;
nr 3 (pro): zawiera chromogenny substrat dla aminopeptydazy L- proliny;
nr 4 (TRE): zawiera trehalozę i purpurę bromokrezolową
nr 5 (EVIL): zawiera maltoza i purpurę bromokrezolową
nr 6 (CEL): zawiera celobiozę i purpurę bromokrezolową
nr 7 (RAF): zawiera rafinozę i purpurę bromokrezolową
Nr 8 (LAC): zawiera laktozę i purpurę bromokrezolową
nr 9 (POX) zawiera podłoże dla oksydazy fenolowej;
nr 10 (URE): zawiera mocznik
nr 11: pozytywna kontrola wzrostu
nr 12 (AB): amfoterycyna B 0,5 mg / ml;
nr 13 (AB): amfoterycyna B 2mg/ml;
nr 14 (5FC): 5-flucytozyna 4μg/ml;
nr 15 (5FC): 5-flucytozyna 16μg/ml;
nr 16 (ITZ): itrakonazol 0,125 g / ml;

23
nr 17 (ITZ): itrakonazol 0,5 mg / ml;
nr 18 (WSC): flukonazol 8mg/mL;
nr 19 (WSC): flukonazol 32μg/ml;
nr 20 (VRZ): worikonazol 1μg/ml;
Wyniki odczytuje się trójkami:

 -NAG, PRO, TRE;

 -Nag: pozytywne reakcja 1, negatywna0 PRO: pozytywne reakcja 2, negatywna0 TRE:
pozytywne reakcja 4, negatywna0
 MAL, CEL, RAF;
MAL:pozytywne reakcja 1, negatywna0 CEL: pozytywne reakcja 2, negatywna0
RAF: pozytywne reakcja 4, negatywna0
 LAC, POX, URE;
LAC: pozytywne reakcja 1, negatywna0 POX: pozytywne reakcja 2, negatywna0 URE:
pozytywne reakcja 4, negatywna0

ELIchrom FUNGI:

24
• Hydroliza 7 chromogennych substratów:
Oksydazy i peptydazy drożdży hydrolizują substraty chromogenne prowadzące do uwolnienia p-nitroaniliny, p-
nitrofenol lub orto-nitrofenolu, które mają żółte zabarwienie (ß-NAG, PRO, ONPG SGL, GLY) lub niebie skie(A-
GLU, PHOS).
• Asymilacja 10 substatów:
- Wykorzystanie cukrów ujawnia się przez zmianę koloru czerwieni bromokrezolowej (BCP) od fioletu do
żółtego, a nawet do braku koloru (MCR, TRE, GAL-SAC, MAL, LRP, RAF, LAC)
- Odporność na aktidion - podobna zasada (ACT)
-hydroliza mocznika uwalnia amoniak, który alkalizuje podłoże– czerwień fenolowa (PR) zmienia kolor na
fuksjowo-różowy (URE).
- hydroliza eskuliny do glukozy i eskuletyny. W obecności jonów Fe3+ (cytrynianu żelazowego) powstająca
eskuletyna tworzy kompleks o barwie brązowo-czarnej (ESC)
• Utlenianie 1 syntetycznego substratu
- aktywność okydazy fenolowej w obecności kwasu kofeinowego daje brązowe zabarwienie
(POX).
Każdy test zawiera kontrolę pozytywną (T +) – asymilacja glukozy oraz negatywną kontrolę (C-)

Opis:
C +: kontrola pozytywna zawierająca glukozę i BCP.
ß-NAG: zawiera substrat chromogenny na-D-glukozaminidazy
PRO: zawiera chromogenny substrat dla L-proliny-amidaza
ACT: zawiera aktidion, glukozę i BCP
MDG: zawiera metylo-a-D-glukopiranozyd
ESC: zawiera eskulinę
alfa-GLU: zawiera substrat chromogenny dla D-glucopyranosidase
PHOS: zawiera chromogenny substratu dla fosfatazy
TRE: zawiera trehalozę i BCP
ONPG: zawiera substrat chromogenny dla ß-D-galaktozydazy
C -: kontrola negatywna dla czytania SGL i GLY
SGL: zawiera chromogenny substratu dla peptydazy
GLY: zawiera chromogeny substratu dla amidazy glicyny
URE: zawiera mocznik i PR
POX: zawiera podłoże dla fenylooksydazy
SAC / GAL: zawiera galaktozę, sacharozę i BCP
MAL: zawiera maltozę i BCP
CEL: zawiera celobiozę i BCP
RAF: zawiera rafinozę i BCP
LAC: zawiera laktozę i BCP

25
matrix.ur.krakow.pl/~aduda-chodak/dydaktyka/materialy/MZ.../cwiczenie_1.doc

26